魏錦博，何正宇，王昌澤，戶業(yè)麗，汪暢，曹慧明，曹夢(mèng)西,*，梁勇

1. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢 430205 2. 江漢大學(xué)環(huán)境與健康學(xué)院，武漢 430056 3. 上虞新和成生物化工有限公司，紹興 312300

雙酚A(bisphenol A, BPA)于1891年被首次合成，作為聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等高分子材料的合成原料和顯色劑，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[1-3]，是全球年均生產(chǎn)量最大的化學(xué)原料之一[4]。至2013年，BPA全球年產(chǎn)量已超過(guò)580萬(wàn)t，且仍有增長(zhǎng)趨勢(shì)[5]。塑料或涂層制品中的BPA在長(zhǎng)時(shí)間的高溫、酸堿或紫外輻射下，可通過(guò)水解或氨解遷移至食物、環(huán)境和皮膚[6-8]，進(jìn)而被人體接觸并攝入。目前已在多種環(huán)境介質(zhì)、人體介質(zhì)中檢出BPA，包括空氣、室內(nèi)灰塵、地表水、廢水和沉積物等環(huán)境樣品[9-11]以及包括人類在內(nèi)多種動(dòng)物的血液、尿液、唾液、毛發(fā)、母乳和羊水等生物樣本[12-15]，甚至在母體胎盤、臍帶血和新生兒尿液中也有檢出[7, 16]。進(jìn)入人體的BPA可與多種受體相互作用，如雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)、雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)、甲狀腺激素受體(TR)和芳香烴受體(AHR)等[17-19]，對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，甚至?xí)?duì)后代的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖功能造成危害[7, 20-23]。流行病學(xué)調(diào)查顯示性欲減退、生殖障礙、多囊卵巢綜合征、出生缺陷和包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥發(fā)生等都與BPA的持續(xù)暴露有關(guān)[5, 8, 20, 24-28]。正因如此，BPA于2008年和2017年先后被美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃(National Toxicology Program, NTP)和成員國(guó)委員會(huì)(Member State Committee, MSC)列為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine-disrupting chemical, EDC)[8]。

隨著2008年開(kāi)始各國(guó)陸續(xù)發(fā)布法律條令限制BPA在塑料制品中的使用[1, 12]，BPA替代物的開(kāi)發(fā)成為工業(yè)生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題，這直接刺激了與BPA結(jié)構(gòu)類似的其他雙酚類化合物(BPs)，如雙酚S(bisphenol S, BPS)、雙酚F(bisphenol F, BPF)、雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)、雙酚B(bisphenol B, BPB)、雙酚E(bisphenol E, BPE)、雙酚C(bisphenol C, BPC)、雙酚Z(bisphenol Z, BPZ)、雙酚FL(bisphenol FL, BPFL)、雙酚AP(bisphenol AP, BPAP)、雙酚BP(bisphenol BP, BPBP)、雙酚M(bisphenol M, BPM)和雙酚P(bisphenol P, BPP)等BPA類似物的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用。隨著B(niǎo)PA類似物的不斷投產(chǎn)和使用，越來(lái)越多BPA類似物在食物、空氣、室內(nèi)灰塵、水體和沉積物等環(huán)境樣本和人體尿液、血清等生物樣本中被檢出，人類尿液排泄數(shù)據(jù)表明世界人類BPs日均攝入量為每人0.06～0.68 μg·d-1，而另一項(xiàng)研究表明人類血清中各BPs中位數(shù)水平為0.07～11.94 ng·mL-1，盡管部分BPs可由人體代謝排出，但BPs對(duì)人體的持續(xù)暴露仍然增加了體內(nèi)游離BPs風(fēng)險(xiǎn)[9, 29-35]。且實(shí)驗(yàn)表明多種BPA類似物(如BPB、BPF和BPE等)可通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)移[36]，提示BPA類似物的生物安全性有待進(jìn)一步研究。研究表明，BPA類似物與BPA具有相似的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，且部分類似物所展現(xiàn)的生殖毒性比BPA更強(qiáng)[2, 17, 25, 31, 37-39]。

相較于BPA而言，雙酚類似物的生殖毒性及相關(guān)分子機(jī)制的研究較少，這阻礙了對(duì)BPA及其類似物于環(huán)境安全和人體健康的綜合評(píng)價(jià)。本文將綜述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外針對(duì)BPA類似物的生殖毒性、致毒分子機(jī)制和人體生殖健康風(fēng)險(xiǎn)的研究進(jìn)展、存在的問(wèn)題及展望。

1 BPA類似物的生殖毒性效應(yīng)(Reproductive toxic effects of BPA analogues)

針對(duì)BPA類似物生殖毒性的探索主要來(lái)源于小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)等模式動(dòng)物，下文則是在動(dòng)物研究的基礎(chǔ)上對(duì)BPA類似物對(duì)雄性及雌性生殖系統(tǒng)的影響做出的統(tǒng)計(jì)。

1.1 BPA類似物對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響

BPA類似物對(duì)雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的危害主要體現(xiàn)在一些生殖毒性指標(biāo)的改變，包括雄性的性器官及性附器官質(zhì)量、性器官組織學(xué)變化、生殖細(xì)胞發(fā)生過(guò)程、精子產(chǎn)量及活力、體內(nèi)激素含量、類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)、卵黃蛋白原表達(dá)量(斑馬魚(yú))、氧化應(yīng)激反應(yīng)、表觀遺傳變化和后代數(shù)量及健康程度(表1)。值得注意的是環(huán)境濃度、低濃度和較高濃度BPs暴露對(duì)精子數(shù)量及質(zhì)量均會(huì)產(chǎn)生不良影響，以環(huán)境相關(guān)濃度的BPS(10 ng·kg-1·d-1)[40]暴露小鼠后會(huì)破壞睪丸組織結(jié)構(gòu)致使精子數(shù)量顯著下降，經(jīng)BPF(25 μg·L-1)[41]、BPAF(25 mg·kg-1·d-1)[42]、BPB(37.5 mg·kg-1·d-1)[43]和BPE(10 mg·kg-1·d-1)[44]暴露的小鼠中觀察到同樣的現(xiàn)象，其會(huì)破壞睪丸及附睪組織，而除了致使精子數(shù)降低，BPs還會(huì)顯著降低精子活力，最終造成小鼠生育能力下降，這可能與BPs暴露導(dǎo)致雄性生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激水平的增加有關(guān)[41-43,45-46](表1)。除BPC和BPFL，不同劑量BPA類似物暴露雄性動(dòng)物后均會(huì)提高體內(nèi)雌二醇(E2)水平，顯示出同BPA相似的類雌激素效應(yīng)[41,46-49]。BPC(0.5 μmol·L-1)暴露青鳉8 h便可引起體內(nèi)雌激素響應(yīng)生物標(biāo)記基因的表達(dá)水平顯著升高，引起生殖調(diào)控系統(tǒng)紊亂[50]。與其他BPs有所不同的是，BPS(10 mg·kg-1·d-1)和BPE(0.05 mg·kg-1·d-1)暴露后引起小鼠體內(nèi)睪酮(T)水平升高，這可能與不同暴露方式下的BPs在體內(nèi)不同代謝過(guò)程所導(dǎo)致的生物體組織濃度差異有關(guān)[44](表1)。除此之外，BPs暴露甚至?xí)鸲啻拘孕?yīng)，BPS(50 μg·kg-1·d-1)和BPE(50 μg·kg-1·d-1)暴露孕鼠，會(huì)對(duì)F3代小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害，這可能是雄鼠睪丸的表觀遺傳修飾發(fā)生改變所致[51-52]。

表1 雙酚A(BPA)類似物對(duì)雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的危害Table 1 The effect of bisphenol A (BPA) analogies on male reproductive systems

1.2 BPA類似物對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的影響

BPs于雌性生殖健康的研究中，子宮和卵巢質(zhì)量(相對(duì)質(zhì)量及絕對(duì)質(zhì)量，濕質(zhì)量及干質(zhì)量)、性腺體質(zhì)量比、卵巢中各時(shí)期卵泡數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化、青春期啟動(dòng)時(shí)間、發(fā)情周期和受精時(shí)間、懷孕率、體內(nèi)激素水平、類固醇激素生成酶相關(guān)基因表達(dá)、分娩情況及后代存活率、氧化應(yīng)激水平、表觀遺傳修飾變化以及后代生殖健康等方面是主要靶點(diǎn)。在環(huán)境濃度、低濃度和較高濃度下，不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的研究均表明BPA類似物會(huì)對(duì)雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)造成損害，如表2所示。BPS(10 μg·kg-1·d-1)[53-54]、BPF(50 mg·kg-1·d-1)[54]、BPB(5 mg·kg-1·d-1)[54]、BPC(45 mg·kg-1·d-1)[55]、BPZ(30 mg·kg-1·d-1)[56]、BPAP(80 μg·kg-1·d-1)[57]和BPFL(2 mg·kg-1，每3 d給藥1次)[45]暴露后均會(huì)顯著改變實(shí)驗(yàn)對(duì)象的子宮或卵巢質(zhì)量，并影響卵巢中各時(shí)期卵泡的發(fā)育、數(shù)量以及卵母細(xì)胞質(zhì)量，表明雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)同樣是BPs的主要作用靶點(diǎn)。上述BPs會(huì)顯著影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的E2水平，同時(shí)改變睪酮(T)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)等在雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育及繁殖中起重要作用的激素水平，擾亂激素平衡，嚴(yán)重干擾內(nèi)分泌，從而損害生殖健康(表2)。在去除卵巢的SD大鼠暴露于BPAF(50 mg·kg-1·d-1)或BPC(45 mg·kg-1·d-1)后，其子宮出現(xiàn)雌激素樣變化，表明BPAF和BPC具有強(qiáng)雌激素效應(yīng)[55]。孕期暴露BPS(50 μg·kg-1·d-1)或BPE(50 μg·kg-1·d-1)致使F3代雌性小鼠出現(xiàn)性早熟、發(fā)情周期紊亂、懷孕率降低和幼鼠存活率降低等問(wèn)題，產(chǎn)生多代毒性效應(yīng)[58]。

2 BPA類似物生殖毒性的分子機(jī)制(Molecular mechanisms of reproductive toxicity of BPA analogues)

研究者已發(fā)現(xiàn)BPs對(duì)生殖系統(tǒng)的多種危害(表1和表2)[40-50,52-56,58-59,60-68]。對(duì)BPs生殖毒性分子機(jī)制的研究一直持續(xù)探索著。對(duì)BPs生殖毒性的分子機(jī)制研究最早從BPA開(kāi)始，其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了它與雌激素受體(ER)具有一定的親和性。而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)BPA除了能與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER外還會(huì)對(duì)雄激素受體(AR)、雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)、甲狀腺激素受體(TR)和芳香烴受體(AHR)等生物體內(nèi)核受體產(chǎn)生干擾作用。除了核受體，BPA與膜相關(guān)雌激素受體——G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合親和力。BPA通過(guò)對(duì)以上與生物體生殖相關(guān)受體產(chǎn)生干擾，從而擾亂生物體內(nèi)激素的正常功能并最終對(duì)生殖功能造成損害。BPA類似物生殖毒性的分子機(jī)制研究大多是基于BPA類似物與BPA結(jié)構(gòu)上的相似性，利用細(xì)胞、體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體和計(jì)算機(jī)模擬的方法進(jìn)行研究和探討。

2.1 雌激素受體途徑

BPA可與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER(包括ERα、ERβ)，盡管其對(duì)ER的結(jié)合親和力僅有E2的千分之一，但即使是低劑量的BPA也具有生殖毒性[1]。由于BPA與2種ER亞型的配體結(jié)合域結(jié)合后引起的ER構(gòu)象變化的不同使得BPA同E2一樣是ERα的激動(dòng)劑，而成了ERβ的拮抗劑。BPA與ER的作用方式分為基因組作用模式和非基因組作用模式。經(jīng)典基因組模式為BPA與細(xì)胞內(nèi)的ERα和ERβ完全結(jié)合，形成配體-受體復(fù)合物，通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的雌激素反應(yīng)元件(estrogen responsive element, ERE)結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)；非基因組作用模式中BPA通過(guò)與細(xì)胞膜上的ERα和ERβ結(jié)合使其活化并與膜內(nèi)其他信號(hào)蛋白(如生長(zhǎng)因子受體等)相互作用，從而形成多分子復(fù)合物介導(dǎo)快速信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生[69]。非基因組模式下BPA可通過(guò)活化ERα介導(dǎo)的核外信號(hào)激活ERK/MAPK、PI3K/Akt和Ca2+流(與E2作用模式相同)以及抑制ERβ介導(dǎo)的p38/MAPK信號(hào)通路(與E2作用模式相反)發(fā)揮作用[70]，不少研究表明BPA的非基因組雌激素活性與E2相當(dāng)[71]。

表2 BPA類似物對(duì)雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的危害Table 2 The effect of BPA analogies on female reproductive systems

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)BPS和BPF具有和BPA類似的雌激素和抗雌激素效應(yīng)[39]，BPS在低劑量下也可高效激活ERα介導(dǎo)的ERK/MAPK通路；通過(guò)離體模型推測(cè)BPS和BPF的雌激素受體結(jié)合活性約為BPA的0.32倍和1.07倍。利用cyp19b-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(ER特異性介導(dǎo)E2調(diào)控cyp19b基因的表達(dá))的研究也表明BPF同BPA有相當(dāng)?shù)拇萍に鼗钚?，而B(niǎo)PS的雌激素活性較弱[72]。在Tox21的比較中，BPAF不僅是BPA類似物中活性最高的ER激動(dòng)劑，離體研究表明BPAF對(duì)ERβ的結(jié)合活性比ERα的更高[2, 73]。BPAF可通過(guò)ERα誘導(dǎo)的C-X-C趨化因子配體12的表達(dá)而促進(jìn)ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞(T47D和MCF-7)的增殖，但對(duì)ERα陰性細(xì)胞的增殖無(wú)影響[74]；同時(shí)有研究指出BPAF可激活ERβ通路和Ca2+流超載致使維持卵巢顆粒細(xì)胞生理特性的KGN細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[75]。而利用干擾RNA對(duì)ER進(jìn)行沉默的研究也表明BPAF通過(guò)經(jīng)典基因組通路和ERK1/2依賴的非基因組通路調(diào)控雌激素活性通路[76]。動(dòng)物模型和體外研究均表明BPB有與BPA相似甚至更高的雌激素活性效價(jià)，可與E2對(duì)ER產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[77]；此外，BPB可通過(guò)破壞卵母細(xì)胞中ERα的定位模式并誘導(dǎo)其功能障礙而影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂及其細(xì)胞質(zhì)量，BPB可能通過(guò)胞外ERK1/2信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖[62, 78]。采用青鳉進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及HELN-ERα和HELN-ERβ熒光素酶報(bào)告體系的體外實(shí)驗(yàn)均表明，BPC可結(jié)合ERα和ERβ并激活下游通路最終表現(xiàn)出強(qiáng)雌激素效應(yīng)，其作用強(qiáng)度與BPAF和BPB在同一水平(均強(qiáng)于BPA)[50, 73, 79]。同時(shí)，BPC、BPAF、BPE與BPA類似，均可通過(guò)ER介導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)通路提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，進(jìn)一步表明其可通過(guò)ER途徑影響生殖[80]。分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics, MD)模擬聯(lián)合體外的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也表明BPE、BPZ、BPBP、BPAP和四甲基雙酚A(TMBPA)通過(guò)與ERα-LBD結(jié)合這一分子起始事件激活下游通路引發(fā)雌激素效應(yīng)[81-83]，而B(niǎo)PM、BPP和BPFL這3種BPA類似物在分子對(duì)接、MD模擬和體外實(shí)驗(yàn)中被證明為ER的拮抗劑，抑制HELN-ERα/ERβ的轉(zhuǎn)錄活性[79, 84-85]，且Cao等[86]認(rèn)為hERα中的Thr347是區(qū)分BPs拮抗或激動(dòng)雌激素效應(yīng)的關(guān)鍵殘基。

2.2 膜雌激素受體途徑

除了與經(jīng)典的ER結(jié)合，BPA類似物還被證明可通過(guò)膜雌激素受體GPR30發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。GPR30是與ER作用模式不同的一種膜相關(guān)雌激素受體，主要通過(guò)激活第二信使環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)等的蛋白激酶途徑介導(dǎo)快速非基因效應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[87]。BPA在低濃度時(shí)主要是通過(guò)激活GPR30介導(dǎo)的非基因組途徑產(chǎn)生毒性效應(yīng)[88]。環(huán)境相關(guān)劑量下BPA可通過(guò)激活GPR30介導(dǎo)的cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP-PKA信號(hào)通路、EGFR-MAPK通路介導(dǎo)的ERK1/2快速磷酸化等途徑影響精原細(xì)胞、精母細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂[87, 89-90]。通過(guò)SKBR-3細(xì)胞熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BPS、BPF、BPAF、BPB與BPA類似同樣可與GPR30直接結(jié)合，且BPAF和BPB的結(jié)合親和力比BPA高9倍[91]。除此之外，低劑量的BPF可通過(guò)GPR30激活A(yù)kt和ERK1/2信號(hào)從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，這與E2的作用模式相似[92]。與BPF相同，不同的研究均表明BPAF可通過(guò)GPR30單獨(dú)(不需要ERα參與)激活ERK1/2和Akt磷酸化等信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，這一結(jié)果也為BPAF在乳腺癌產(chǎn)生和發(fā)展中的作用提供了解釋[93-94]。Li等[62]發(fā)現(xiàn)BPB可能通過(guò)GPR30介導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)誘導(dǎo)青春期后期大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖。BPC同樣被報(bào)道為GPR30的激動(dòng)劑，且其誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加可能同樣與GPR30介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)[80, 95]。Liu等[96]通過(guò)MD模擬發(fā)現(xiàn)，Leu137TM3和Trp272TM6是這幾種BPs識(shí)別結(jié)合并激活GPR30的關(guān)鍵殘基，為BPs與GPR30分子識(shí)別機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

2.3 雄激素受體途徑

與BPs和ER作用會(huì)產(chǎn)生類雌激素效應(yīng)和抗雌激素效應(yīng)不同，幾乎所有已被報(bào)道的在雄激素受體途徑發(fā)生作用的BPs都會(huì)產(chǎn)生抗雄激素作用[1-2]。BPA產(chǎn)生抗雄激素效應(yīng)可能是因?yàn)椋?1) BPA與AR的結(jié)合干擾了正常雄激素-AR復(fù)合物氨基/羧基末端結(jié)構(gòu)域(N/C)之間的分子內(nèi)的二聚化作用，導(dǎo)致AR穩(wěn)定性降低而自然降解[97]；(2) BPA促進(jìn)AR泛素化而降解；(3) BPA結(jié)合AR-LBD導(dǎo)致受體與其輔助伴侶蛋白——90-kDa熱休克蛋白(Hsp90)穩(wěn)定性增加，而阻止AR與之解離，最終導(dǎo)致AR無(wú)法轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以介導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄；(4) BPA占用AR-LBD位點(diǎn)后干擾了輔助AR核轉(zhuǎn)位的配體依賴的核定位序列，導(dǎo)致配體-受體復(fù)合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄不會(huì)被刺激，從而產(chǎn)生生殖毒害作用[98]。BPS、BPF、BPAF、BPB、BPE、BPC、BPZ、BPAP、TMBPA和BPP也在不同的體外雄激素受體終點(diǎn)檢測(cè)中顯示為抗雄激素效應(yīng)，其中BPAF、TMBPA和BPE可能具有更強(qiáng)的雄激素拮抗效應(yīng)，而B(niǎo)PS的拮抗效應(yīng)最弱[2, 99]。Conroy-Ben等[81]通過(guò)QSAR的方法對(duì)比雄激素拮抗劑——羥基氟他胺和BPs與AR結(jié)合模型發(fā)現(xiàn)BPBP、BPZ、BPB、BPA、BPE、BPF和BPS均通過(guò)與AR-LBD的Thr877和Asn705形成氫鍵而結(jié)合(與羥基氟他胺相同)，且QSAR模型研究結(jié)果與酵母報(bào)告基因雄激素試驗(yàn)(YAS)測(cè)定的結(jié)果一致。目前，BPs與雄激素受體相互結(jié)合并發(fā)揮生理相關(guān)作用的研究有限，且對(duì)其產(chǎn)生抗雄激素效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制了解不足，未來(lái)應(yīng)予以關(guān)注。

2.4 雌激素相關(guān)受體途徑

ERRγ是一種孤兒受體，也是人類48個(gè)核受體之一，在發(fā)育期哺乳動(dòng)物大腦以及成年動(dòng)物大腦和肺等器官中高表達(dá)，有研究指出ERRγ在胎兒大腦和胎盤中均有表達(dá)，并且ERRγ可能參與前列腺的生長(zhǎng)和發(fā)育[100]。而不少體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ERRγ-LBD的實(shí)驗(yàn)中表明BPA與ERRγ有很強(qiáng)的結(jié)合親和力并且通過(guò)保持或鎖定ERRγ-LBD的helix12的活性構(gòu)象而維持ERRγ的高轉(zhuǎn)錄活性[73, 101-102]。BPA可與下丘腦[103]、海馬區(qū)神經(jīng)元[104]和胎盤[105]中的ERRγ結(jié)合而影響下游生殖調(diào)控、棘突發(fā)生(MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo))及BPA在胎盤中的積累。體外實(shí)驗(yàn)表明，BPA以時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)ERRγ核易位并增加BPA/ERRγ靶基因的表達(dá)，BPA通過(guò)促進(jìn)Ca2+的內(nèi)流和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的分泌，導(dǎo)致EGFR/ERK通路被激活，最終使得BPA通過(guò)BPA/ERRγ/EGF/EGFR/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[106]。BPS、BPF、BPAF、BPB、BPC、BPE、BPZ、BPAP、BPP和BPM與ERRγ的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)同樣證明這些BPs具有較高的ERRγ受體親和力，且BPB和BPE的結(jié)合親和力與BPA相當(dāng)[73]。Okada等[107]在2008年也得到類似的結(jié)果，而且部分BPs的結(jié)合活性與人ERRγ熒光素酶報(bào)告基因的測(cè)定結(jié)果吻合。低濃度BPA、BPS和BPF暴露小鼠精母細(xì)胞GC-2會(huì)顯著提高細(xì)胞中Errγ的轉(zhuǎn)錄，表明ERRγ也是BPS和BPF對(duì)生物體生殖產(chǎn)生影響的靶點(diǎn)之一[108]。而對(duì)BPAF和BPC進(jìn)行分子比較對(duì)接的結(jié)果顯示，BPAF和BPC在與ERRγ-LBD結(jié)合時(shí)也表現(xiàn)為激動(dòng)構(gòu)象，發(fā)揮關(guān)鍵作用的可能是ERRγ-LBD的helix7上的N346與BPs形成的氫鍵，且這一計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)結(jié)果與HG5LN GAL4-ERRγ細(xì)胞暴露的活性檢測(cè)結(jié)果相關(guān)聯(lián)[109]。雖然通過(guò)體外的配體-受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞活力及基因表達(dá)測(cè)定研究可知曉大部分BPs都可與ERRγ進(jìn)行結(jié)合，但是BPs在ERRγ相關(guān)通路上對(duì)生物體產(chǎn)生生殖毒性的研究仍然有限，也需要更進(jìn)一步的探究。

2.5 甲狀腺激素相關(guān)受體途徑

甲狀腺激素(TH，包括T3和T4)是哺乳動(dòng)物卵巢正常發(fā)育所必需的激素，可改變促性腺激素的釋放進(jìn)而影響卵泡命運(yùn)，甲狀腺激素失衡則會(huì)導(dǎo)致卵巢質(zhì)量下降，精子發(fā)生、數(shù)量及活力下降，生殖激素合成和分泌紊亂，甚至增加不孕風(fēng)險(xiǎn)[110-111]。在非洲爪蟾[112]、青鳉[113]、嚙齒動(dòng)物[111-112]和豬顆粒細(xì)胞[110]中的實(shí)驗(yàn)均表明BPA可通過(guò)干擾TH與TR的結(jié)合影響信號(hào)的傳導(dǎo)。BPA暴露促進(jìn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)甲狀腺激素運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(TTR)的表達(dá)，且體外熒光競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)也表明BPA可與TTR結(jié)合，干擾體內(nèi)正常TH的運(yùn)輸[114-115]。另外也有證據(jù)表明BPA可能會(huì)通過(guò)干擾TH的合成而對(duì)生物體產(chǎn)生干擾，BPA暴露斑馬魚(yú)后，TH合成相關(guān)基因(tg、tshr)的表達(dá)量顯著上調(diào)，而大鼠甲狀腺腫瘤細(xì)胞FRTL-5暴露于較低濃度BPA后同樣使得TH合成相關(guān)基因(tg、tshr、nis和tpo)的表達(dá)上調(diào)[114, 116]。綜上所述，BPA可通過(guò)對(duì)TH的產(chǎn)生、運(yùn)輸和作用環(huán)節(jié)產(chǎn)生干擾效應(yīng)，從而間接影響生殖健康。雖然BPA類似物于甲狀腺干擾的研究較少，但是已有研究均表明BPA類似物會(huì)造成甲狀腺干擾。Lu等[117]利用MD模擬結(jié)合體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BPA、BPS等BPs對(duì)TRβ有不同程度的抗甲狀腺激素活性。而暴露于BPF和BPS的斑馬魚(yú)甲狀腺發(fā)育相關(guān)基因(hhex和tg)、甲狀腺激素運(yùn)輸相關(guān)基因(ttr)和甲狀腺激素代謝相關(guān)基因(ugt1ab)的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了變化，且幼魚(yú)體內(nèi)的T3和T4含量顯著增加，說(shuō)明BPS和BPF同樣可能干擾TH的合成、分泌及運(yùn)輸[114]。分子對(duì)接結(jié)果提示BPS與BPF對(duì)TR有結(jié)合能力，體外熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能與TR結(jié)合(與BPA類似)；此外，3種BPs均能誘導(dǎo)TH依賴的垂體GH3細(xì)胞增殖，而在T3存在時(shí)抑制T3的誘導(dǎo)，表明BPS和BPF與BPA一樣具有干擾TH信號(hào)通路的潛力[118]。類似的結(jié)果也在BPAF、BPAP、BPC、BPB和BPZ暴露大鼠垂體GH3細(xì)胞后產(chǎn)生，表明BPA類似物的TH干擾能力[119]。結(jié)合上述研究可知這些BPA類似物的甲狀腺干擾效應(yīng)和機(jī)制與BPA類似，需引起研究者的關(guān)注并進(jìn)一步研究。

2.6 芳香烴受體途徑

芳香烴受體(AhR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，AhR與配體結(jié)合后會(huì)被芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(ARNT)帶入細(xì)胞核與特異性DNA反應(yīng)元件結(jié)合，從而啟動(dòng)包括細(xì)胞色素P450家族在內(nèi)的異源物質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，其在生物體的發(fā)育、代謝過(guò)程和免疫炎癥中起著重要的作用。野生型和AhR-KO小鼠卵泡的BPA暴露實(shí)驗(yàn)顯示，BPA可抑制2種卵泡生長(zhǎng)并降低E2水平，且BPA對(duì)AhR-KO卵泡生長(zhǎng)的抑制作用要弱于野生型，表明BPA可能通過(guò)AhR信號(hào)途徑部分抑制卵泡生長(zhǎng)[120]。BPA暴露妊娠期大鼠可誘導(dǎo)胚胎中芳香烴受體抑制劑(AhR repressor, AhRR)的基因表達(dá)上調(diào)從而抑制胚胎中AhR的功能[121]。此外，圍產(chǎn)期暴露BPA導(dǎo)致的雄性后代的精子發(fā)生能力降低及精子畸形率增加，可能與睪丸中AhR信號(hào)通路所激活的炎癥反應(yīng)有關(guān)[122]。最近的一項(xiàng)研究表明BPA類似物BPF、BPS和BPAF在低濃度(1～100 nmolL-1)下暴露HepG2細(xì)胞系均會(huì)誘導(dǎo)AhR的RNA和蛋白質(zhì)水平的增加，從而使受其調(diào)節(jié)的相關(guān)CYP酶的表達(dá)出現(xiàn)異常，最終加劇染色體損傷，且分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果也顯示上述BPs與AhR的結(jié)合親和力同強(qiáng)效激動(dòng)劑(PCB 126)的親和力水平相當(dāng)[123]。關(guān)于BPs與AhR相互作用的相關(guān)研究仍停留在計(jì)算模擬水平，需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)支撐這一觀點(diǎn)。

2.7 其他受體途徑

體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體測(cè)定的研究表明，除了能與上述幾種人核受體結(jié)合外，BPA、BPS、BPF、BPAF、BPB、BPC、BPE、BPZ、BPAP、BPP和BPM均可與孕烷X受體(PXR)進(jìn)行結(jié)合；除BPS和BPF外，其他測(cè)試的BPs可與組成型雄烷受體(CAR)結(jié)合，且結(jié)合作用極強(qiáng)；而除BPS外，其他BPs均可結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)[73]。Kojima等[99]在測(cè)定BPs暴露轉(zhuǎn)染人PXR的COS-7細(xì)胞的熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BPA、BPAF、BPB、BPZ、BPAP和BPP均是人PXR的激動(dòng)劑，且BPZ、BPAP和BPP比BPA的激動(dòng)效應(yīng)更強(qiáng)。另一項(xiàng)關(guān)于HG5LN-PXR的研究顯示BPM和BPBP同樣是PXR的激動(dòng)劑[79]。同時(shí)，Kojima等[99]還首次通過(guò)COS-7細(xì)胞的反式激活實(shí)驗(yàn)證明了BPA及其類似物BPAF、BPB、BPZ、BPAP和BPP具有CAR逆向激動(dòng)活性，同時(shí)通過(guò)基于CHO-K1細(xì)胞的反式激活實(shí)驗(yàn)證明這6種BPs都是GR的拮抗劑。在一項(xiàng)暴露于BPA、BPS和BPF的重組酵母(穩(wěn)定表達(dá)人GR)系統(tǒng)中GR激活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也同樣表明了BPs的GR拮抗作用[124]。

除了PXR、CAR和GR，BPAF、BPC、BPM和BPZ被證明可與人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(hPPARs)和人視黃X受體(hRXRs)相互作用[125]，且與它們相比BPA具有更高的hPPARs和hRXRs結(jié)合親和力。綜上所述，BPA及其類似物同樣會(huì)對(duì)PXR、CAR、GR、PPAR和RXR這些同屬核受體家族的受體蛋白產(chǎn)生結(jié)合作用，即便最終激動(dòng)或拮抗效應(yīng)有所不同，但由于核受體作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子在特異性調(diào)節(jié)參與代謝、發(fā)育和繁殖的靶基因的表達(dá)上起著至關(guān)重要的作用，理應(yīng)對(duì)這些污染物的核受體影響做更深層次的機(jī)制相關(guān)研究。

3 BPA類似物的人體生殖健康風(fēng)險(xiǎn)(Human reproductive health risks of BPA analogues)

BPA類似物主要通過(guò)消化道被人體接觸吸收，2013年的研究估算人體每日通過(guò)膳食攝入BPs的量為幼兒243 ng·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))和成人58.6 ng·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))，表明了BPs對(duì)人體的較高濃度持續(xù)暴露，由于BPA類似物在環(huán)境中的檢出量日益增多，人類對(duì)BPs的接觸也呈上升趨勢(shì)[126]。最近一項(xiàng)基于廢水流行病學(xué)評(píng)估人類暴露于BPA類似物的研究則表明，人類平均每日BPF、BPS、BPP、BPZ、BPB、BPAF和BPAP的暴露水平分別為10.2、5.21、1.15、0.66、0.61、0.58和0.35 μg，說(shuō)明BPA類似物的人體暴露風(fēng)險(xiǎn)正在升高[32]。相較于多數(shù)模式動(dòng)物研究中的BPs暴露濃度而言，人類暴露劑量水平相對(duì)較低，但已有環(huán)境相關(guān)濃度的研究表明在人類可接觸的BPs濃度下，動(dòng)物研究仍顯示出了BPs的生殖毒性，提示BPA類似物的人體生殖健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視[40, 47, 49, 65]。BPS、BPAF和BPB被人體攝入后主要在肝臟和腸道中被代謝為BPs-葡糖苷酸，少量代謝為BPs-硫酸鹽、羥基化BPs和其他代謝產(chǎn)物，而B(niǎo)PF主要代謝為BPF-硫酸鹽后隨尿液排出[31, 126]。一項(xiàng)d4-BPS于人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，與BPA相比，BPS吸收快、代謝慢，其在口服后1 h內(nèi)被迅速吸收，人體內(nèi)半衰期為6.8 h，且在人體內(nèi)主要以毒性更強(qiáng)的未偶聯(lián)形式存在，48 h時(shí)BPS在男性中通過(guò)尿液排泄率約為92.17%，女性排泄率為70.36%，提示女性可能有更高的BPs暴露風(fēng)險(xiǎn)[127]。BPF和BPAF同樣在動(dòng)物研究中被報(bào)道有比BPA更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和更高的殘留量[128]。Karrer等[129]基于生理毒物動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)模型分析發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境相關(guān)濃度下BPs在腸道和肝臟中代謝速率的排序?yàn)椋築PA>BPF>BPS。此外，BPs在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物同樣存在健康風(fēng)險(xiǎn)，研究表明BPAF的主要代謝產(chǎn)物BPAF-葡糖苷酸可對(duì)PXR和PPARγ產(chǎn)生拮抗作用[130]；BPB、BPC和BPF可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生二聚代謝產(chǎn)物，盡管對(duì)其毒性研究甚少，但由于BPA的二聚代謝物被證明比BPA具有更強(qiáng)的雌激素效應(yīng)，故而B(niǎo)Ps的代謝產(chǎn)物毒性也應(yīng)引起關(guān)注[9]。雖然大部分BPs可能通過(guò)人體代謝降低毒性后排出，但因環(huán)境中BPs的廣泛存在和日益升高的含量，人體處在持續(xù)暴露中，使得體內(nèi)游離BPs暴露風(fēng)險(xiǎn)增加。

由于BPA類似物的酚類結(jié)構(gòu)與人體性激素結(jié)構(gòu)相似，被認(rèn)為可干擾人體內(nèi)雌二醇、孕酮、黃體生成素、促卵泡激素、睪酮和雄烯二酮等性激素水平，從而對(duì)人體的生殖系統(tǒng)造成擾亂，影響人類生殖健康[131-133]。BPE、BPF同BPA一樣可抑制人類睪丸外植體睪酮的生成，BPS和BPB則會(huì)加快睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3的生成，表明BPA類似物對(duì)雄性生殖具干擾效應(yīng)[134]。BPAF、BPB和BPC等BPs可通過(guò)激活CatSper影響人類精子細(xì)胞Ca2+信號(hào)通路，而破壞人類精子功能[135]。流行病學(xué)研究表明BPA類似物的暴露與男性生殖障礙、前列腺癌、女性不孕、乳腺癌和多囊卵巢綜合征等生殖相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)[2, 136-137]。除此之外，BPA類似物與女性孕產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)及胎兒生長(zhǎng)緩慢具有相關(guān)性。孕婦尿液中BPS含量與女性妊娠年齡和女嬰晚產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)[138]，另有報(bào)道孕婦尿液中BPS濃度與早產(chǎn)相關(guān)[139]。母親尿液BPS含量與女嬰體質(zhì)量偏低和下腹圍及股骨長(zhǎng)度相關(guān)[140]。而產(chǎn)前暴露于BPF可能與男嬰出生體質(zhì)量降低有相關(guān)性[141]。BPB則被報(bào)道與子宮內(nèi)膜異位有關(guān)[128]。最新的一項(xiàng)橫斷面分析顯示適孕女性尿液BPC含量與甲狀腺體積呈顯著負(fù)相關(guān)，與促甲狀腺激素含量呈顯著正相關(guān)，而B(niǎo)PC的持續(xù)暴露可能會(huì)導(dǎo)致甲狀腺功能退化進(jìn)而造成孕婦先兆子癇、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)以及流產(chǎn)等生殖健康風(fēng)險(xiǎn)[142]。此外，在葉酸補(bǔ)充不足條件下，孕期女性尿液中總雙酚類物質(zhì)(包括BPA、BPS、BPF、BPAF、BPZ、BPB、BPAP和BPP)含量與孕期時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)[143]。綜上所述，盡管BPs在人體內(nèi)可能被代謝排出，但是持續(xù)暴露于BPs仍然可能引發(fā)生殖健康風(fēng)險(xiǎn)。

綜合計(jì)算機(jī)模擬(QSAR和MD模擬)和體外實(shí)驗(yàn)(酵母或細(xì)胞報(bào)告基因檢測(cè))的結(jié)果，對(duì)各BPA類似物的ER結(jié)合親和力和類雌激素或抗雌激素效應(yīng)作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估得知，相較于BPA而言，除BPS外，其他BPA類似物均表現(xiàn)出與BPA相似或更強(qiáng)的ER結(jié)合能力且體外實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)這一結(jié)果(表3)[79, 81, 83-85]。在眾多BPs中，BPAF所展現(xiàn)出的類雌激素作用最強(qiáng)，而這與BPAF分子結(jié)構(gòu)中酚環(huán)間烷基部分的鹵化作用相關(guān)，其對(duì)配體-ERα結(jié)合過(guò)程中的靜電相互作用和氫鍵的產(chǎn)生有較大影響[144]。相比之下，BPS表現(xiàn)出比BPA更低的ER結(jié)合親和力以及更弱的雌激素效應(yīng)，這可能與其結(jié)構(gòu)中碳氧雙鍵飽和的連接方式有關(guān)，在今后新型BPA類似物的設(shè)計(jì)中應(yīng)充分考慮。這提示我們計(jì)算機(jī)模擬是對(duì)新型BPA替代物毒性預(yù)測(cè)的有效手段，未來(lái)應(yīng)該綜合開(kāi)發(fā)基于不同核受體(NRs)的毒性預(yù)測(cè)模型以期更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)新型化合物毒性。

表3 BPA類似物的內(nèi)分泌干擾能力(基于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人雌激素受體(ER)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果)[79, 81, 83-85]Table 3 Endocrine activity of BPA analogues (based on the competitive receptor-binding assays of human estrogen receptor (ER)) [79, 81, 83-85]

4 展望(Perspectives)

BPs作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，盡管BPA在人類直接接觸途徑上因各國(guó)政策的調(diào)整而使其風(fēng)險(xiǎn)降低，但是BPA類似物的開(kāi)發(fā)以及應(yīng)用已然成了新的問(wèn)題，且目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)多種人體樣本中普遍存在，其能通過(guò)胎盤屏障和血睪屏障影響生殖腺而最終可能對(duì)子代產(chǎn)生危害，在職業(yè)接觸人群的分析中也發(fā)現(xiàn)這類化學(xué)品的長(zhǎng)期接觸會(huì)對(duì)人類生殖產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致不孕不育。通過(guò)在哺乳類模式動(dòng)物和水生魚(yú)類模式動(dòng)物上的研究也進(jìn)一步說(shuō)明了其在雄性和雌性生殖系統(tǒng)上的毒性作用，但目前關(guān)于BPA類似物在動(dòng)物模型研究中的暴露濃度主要是基于BPA對(duì)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的最低可見(jiàn)有害作用濃度和人體每日耐受攝入量進(jìn)行設(shè)置，普遍高于環(huán)境濃度且暴露時(shí)間相對(duì)較短，真實(shí)環(huán)境濃度下BPA類似物對(duì)生物體長(zhǎng)期暴露的研究偏少，不利于評(píng)估BPA類似物對(duì)人體健康的影響。隨著相關(guān)研究的增多，環(huán)境相關(guān)濃度已經(jīng)受到更多國(guó)際同行的重視，所以暴露劑量的降低、暴露時(shí)間的延長(zhǎng)以及模擬人群的暴露途徑是環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注重點(diǎn)。另外，目前的研究仍舊以BPA環(huán)境檢測(cè)和人體檢出為基礎(chǔ)，但隨著B(niǎo)PA限用，多種類似物可能取而代之，因此化學(xué)品的實(shí)際使用情況在確定毒理研究的優(yōu)先次序中也很重要。此外，生活環(huán)境的復(fù)雜性使得人體暴露于多種BPs下，在單一BPA類似物的研究基礎(chǔ)上也應(yīng)考察復(fù)合暴露可能帶來(lái)的影響。

BPA類似物的生物利用度、偶聯(lián)度以及體內(nèi)半衰期存在差異，相關(guān)研究較少且多為體外代謝模型，無(wú)法模擬化合物的體內(nèi)Ⅱ期代謝，故而B(niǎo)PA類似物的動(dòng)物體內(nèi)代謝同樣是這一領(lǐng)域的新關(guān)注點(diǎn)。盡管進(jìn)入人體的BPs大部分可通過(guò)葡萄糖醛酸化和硫酸化而排出體外，但不少研究仍表明一些已投入生產(chǎn)應(yīng)用的新型BPA類似物(如BPAF、BPB)的生殖毒性相較BPA反而更高，而對(duì)這些類似物的生物安全性的研究仍然較少，在其生殖毒性的機(jī)制方面同樣需要更深的探究?，F(xiàn)有研究表明BPA的體內(nèi)代謝產(chǎn)物具有比BPA更強(qiáng)的雌激素效應(yīng)，但BPA類似物的相關(guān)研究同樣較少，了解BPs在體內(nèi)的代謝過(guò)程和代謝產(chǎn)物的毒性能對(duì)BPs生殖毒性發(fā)生的機(jī)制有更全面的解釋，在未來(lái)的研究中應(yīng)該更加關(guān)注BPA類似物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物的毒性評(píng)估。

伴隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)在環(huán)境領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法的日益成熟，開(kāi)發(fā)高通量、穩(wěn)定、易操作的體外模擬技術(shù)對(duì)化合物毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)同樣是毒理學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展重點(diǎn)，由于其在化學(xué)品毒性預(yù)測(cè)方面的極大潛力，如今已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用并受到了領(lǐng)域內(nèi)的認(rèn)可。依托于上述計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，BPA及其類似物對(duì)ER蛋白結(jié)合和效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制已得到了較為充分的研究，但隨著對(duì)其他核受體和膜受體在EDC引起生殖和其他內(nèi)分泌干擾研究中的關(guān)注，相關(guān)的機(jī)制研究仍然極為缺乏，也需要更多從業(yè)者探究和解釋，并且需要更多體內(nèi)研究以補(bǔ)充體外研究的不足。