王可，李建波，曹曉菲

（1.達州職業(yè)技術學院，四川達州635000；2.達州職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院外科，四川達州635000；3.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安710038）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是原發(fā)性肝癌的主要亞型，是一種高度致命的惡性腫瘤，具有早期診斷困難、極易復發(fā)和轉移等特點，在全球癌癥相關死亡原因排名中位列第四[1-3]。盡管在診斷過程和治療方面取得了重大進展，但在過去5年里，HCC 的病死率依舊居高不下[4]。因此，迫切需要研究HCC 細胞增殖和轉移的作用機制。

目前研究顯示，HCC 是由許多基因表達失調介導的。如凝縮蛋白復合物亞基G2（NCAPG2）在HCC 組織中表達上調，促進HCC 細胞增殖和轉移[5]。Huang 等[6]報道過表達核糖體結合蛋白2（RPN2）可促進HCC 細胞增殖、轉移、侵襲和上皮-間充質轉化。磷酸絲氨酸磷酸化酶（PSPH）屬于磷酸轉移酶亞家族，位于染色體7p11.2 上，參與細胞增殖所必需的L-絲氨酸的合成途徑[7]。既往研究表明，異常表達的PSPH 與多種惡性腫瘤相關，包括乳腺癌[8]和非小細胞肺癌[9]。然而PSPH 在HCC進展中的作用及其潛在的機制研究十分稀少，仍需進一步完善。

本研究通過分析PSPH 在HCC 組織和細胞中的表達水平及過表達或沉默PSPH 對HCC 細胞行為的影響，從而闡明其在HCC 中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取2012年7月—2016年8月達州職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院手術切除的20 例HCC 患者的癌組織及其癌旁組織進行研究。所有患者均提供了書面知情同意書。本研究得到了達州職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院科研倫理委員會的批準。

1.2 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胎牛血清購自Invitrogen 公司。二甲亞砜（DMSO）購自上海阿拉丁公司。CCK‐8 試劑盒和EdU 試劑盒購買于中國銳博公司。SYBR PremixEx Taq II 試劑盒和PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉錄試劑盒購自Takara公司。BCA 蛋白檢測試劑盒購自碧云天公司。ImageQuanTMLAS 4000 和ChemiDocTMXRS +分別購買于GE 和Bio‐Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)將來自中國科學院生物科學研究所的人正常肝細胞系（HL‐7702）和人HCC 細胞系（HepG2、Huh‐7 和HCCLM3）培養(yǎng)于富含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含有5%的CO2，95%濕化的培養(yǎng)箱進行孵育。

1.3.2 CCK‐8 法檢測細胞增殖將HepG2 細胞以每孔1×103個接種于96 孔培養(yǎng)板中。分別經過24、48、72 和96 h 的孵育后，向每孔加入100 μL CCK‐8 溶液。隨后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，通過Multiscan‐Go 分光光度計 （Thermo Fisher Scientific）檢測450 nm 處的吸光值。

1.3.3 EdU 法檢測細胞增殖采用EdU 試劑盒進行檢測。將每個孔中接種約1×103個細胞，加入50 μmol/L EdU 試劑于HepG2 轉染細胞中培養(yǎng)2 h后，PBS 洗滌2 次，然后用4% 多聚甲醛固定30 min。隨后加入100 μL 新鮮Apollo 染色反應液對細胞進行染色，100 μL Hoechst 33342 染色細胞核，最后通過熒光顯微鏡（Olympus BX51）分析細胞活力。

1.3.4 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲采用涂有基質凝膠的Transwell 室（Millipore）檢測細胞侵襲。將1×104個HepG2 細胞接種到含有無血清培養(yǎng)基的上腔中，而在下腔中加入含有10%血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，使用4%多聚甲醛固定下腔細胞，0.1%結晶紫染色，并在倒置顯微鏡下計算侵襲細胞數量（Olympus）。

1.3.5 Western blot采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細胞，提取蛋白。通過BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經SDS‐PAGE 分離后轉移至PVDF 膜上，室溫下使用脫脂牛奶封膜1 h，然后與一級抗體（PSPH、MMP‐9、CCND1、Ki‐67、LC3‐II/LC3‐I、p62、NF‐κB p65）4 ℃過夜孵育，再加入二抗（HRP 標記的羊抗兔IgG）室溫孵育1 h。最后，利用ImageQuanTMLAS 4000 和ChemiDocTMXRS +對條帶進行檢測和定量。

1.3.6 qRT‐PCR轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。采用SYBR PremixEx Taq II 試劑盒在7900HT system 進行擴增。具體程序如下：95 ℃10 s，95 ℃5 s 共40 個循環(huán)；60 ℃30 s,72 ℃15 s，GAPDH 作為內參。采用2-ΔΔCt方法檢測目標基因的相對表達水平。

1.3.7 免疫熒光將細胞接種在聚賴氨酸涂層的蓋玻片上，培養(yǎng)24 h，4% 多聚甲醛固定20 min，0.2% Triton‐X‐100 通透10 min。隨后使用一級抗體（NF‐κB p65），二級抗體（HRP 標記的羊抗兔IgG）和DAPI 依次與細胞孵育。采用Olympus 熒光顯微鏡觀察拍攝圖像。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據均以均數±標準差（±s）表示。兩組之間的差異通過t檢驗法分析，多組間的差異通過單因素方差分析（ANOVA）計算。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PSPH在HCC組織和細胞中表達

Western blot 結果顯示，與癌旁組織比較，HCC組織中PSPH 基因表達明顯上調（P＜0.05）（圖1A）。qRT‐PCR 結果顯示，與人正常肝細胞HL‐7702 比較，HCC 細胞系HepG2、Huh‐7 和HCCLM3 中的PSPH 表達均明顯增加（均P＜0.05）（圖1B）。

圖1 PSPH 在組織和細胞的表達A：Western blot 檢測PSPH 在HCC 患者組織和癌旁組織中的表達；B：qRT‐PCR 檢測PSPH在HCC細胞系（HepG2，Huh‐7，HCCLM3）及人正常肝細胞系（HL‐7702）中的表達Figure 1 PSPH expressions in tissue and cellsA:PSPH expressions in HCC and adjacent tissue determined by Western blot analysis; B:PSPH expressions in HCC cell lines(HepG2,Huh‐7,HCCLM3)and normal hepatic cell line(HL‐7702)determined by qRT‐PCR method

2.2 過表達PSPH對HepG2細胞增殖和侵襲的影響

為了研究PSPH 在HCC 發(fā)展過程中的生物學作用，通過轉染PSPH 過表達質粒（pcDNA‐PSPH）至HepG2 細胞中上調PSPH 的表達。qRT‐PCR 結果顯示，與空白質粒轉染組（vector 組）比較，過表達PSPH 可明顯提高HepG2 細胞中PSPH 的表達水平（P＜0.05）（圖2A）；CCK‐8 和EdU 實驗結果顯示，過表達PSPH 后，HepG2 細胞增殖能力明顯提高（圖2B-C）（均P＜0.05）；Transwell 侵襲實驗結果顯示，過表達PSPH 后細胞侵襲能力明顯增強（P＜0.05）（圖2D）；Western blot 結果顯示，過表達PSPH 后，細胞增殖標記蛋白CCND1 和Ki‐67 的表達均明顯上調（均P＜0.05）（圖2E）。

圖2 PSPH過表達對HepG2細胞增殖和轉移的影響A：qRT‐PCR檢測轉染pcDNA‐PSPH后的轉染效率；B：CCK‐8法測定轉染后不同時間點細胞增殖情況；C：EdU 法測定HepG2 細胞增殖；D：Transwell 細胞侵襲實驗測定細胞侵襲；E：CCND1和Ki‐67蛋白水平的檢測Figure 2 Influence of PSPH overexpression on proliferation and metastasis of HepG2 cellsA:Transfection efficiency of pcDNA‐PSPH transfection determined by qRT‐PCR;B:Proliferation activities at different time points determined by CCK‐8 assay; C:Proliferation of HepG2 cells determined by EdU assay; D:Cell invasion ability determined by Transwell assay;E:Determination of CCND1 and Ki‐67 protein expressions

2.3 敲低PSPH對HepG2細胞增殖和侵襲的影響

qRT‐PCR 結果顯示：轉染PSPH shRNA 后，HepG2 細胞中PSPH 的表達較陰性對照組（sh‐NC組）明顯降低（P＜0.05）（圖3A）；CCK‐8 和EdU 實驗結果顯示，敲低PSPH 后，HepG2 細胞增殖能力明顯降低（均P＜0.05）（圖3B-C）；Transwell 侵襲實驗結顯示，敲低PSPH 后，HepG2 細胞侵襲能力明顯下降（P＜0.05）（圖3D）；Western blot 結果顯示，敲低PSPH 后，CCND1 和Ki‐67 蛋白的表達均明顯下調（均P＜0.05）（圖3E）。

圖3 敲低PSPH對HepG2細胞增殖和轉移的影響A：qRT‐PCR檢測轉染PSPH shRNA后的PSPH表達；B：CCK‐8法測定轉染后不同時間點細胞增殖情況；C：EdU 法測定HepG2 細胞增殖；D：Transwell 細胞侵襲實驗測定細胞侵襲；E：CCND1和Ki‐67蛋白水平的檢測Figure 3 Influence of PSPH knockdown on proliferation and metastasis of HepG2 cellsA:PSPH expression after transfection of PSPH shRNA determined by qRT‐PCR; B:Proliferation activities at different time points determined by CCK‐8 assay; C:Proliferation of HepG2 cells determined by EdU assay; D:Cell invasion ability determined by Transwell assay; E:Determination of CCND1 and Ki‐67 protein expressions

2.4 PSPH對HepG2細胞自噬的影響

過表達和敲低HepG2 細胞中PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 和p62（自噬進程中主要指標）表達均發(fā)生明顯變化。過表達PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 表達上調而p62 表達下調；敲低PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 表達降低而p62 表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 PSPH對HepG2細胞自噬的影響A：過表達PSPH后相關蛋白的表達；B：敲低PSPH后相關蛋白的表達Figure 4 Effect of PSPH on autophagy in HepG2 cellsA:Expressions of autophagy‐related proteins after PSPH overexpression;B:Expressions of autophagy‐related proteins after PSPH knockdown

2.5 PSPH對NF‐κB/MMP‐9信號通路的影響

免疫熒光結果顯示：與vector 組比較，過表達PSPH 后NF‐κB p65 蛋白在細胞核中明顯富集，而NF‐κB 通路抑制劑shikonin 可減少PSPH 過表達對NF‐κB p65 蛋白核轉位的促進作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5A）；與sh‐NC 組比較，敲低PSPH 可明顯抑制細胞核中NF‐κB p65 的表達，PSPH 明顯促進NF‐κB p65 蛋白在細胞核中的表達，而NF‐κB 通路激動劑TNF‐α 可逆轉PSPH 敲低對NF‐κB p65 核轉位抑制作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5B）。Western blot 結果顯示，HepG2 細胞中的MMP‐9 的表達明顯上調，而shikonin 可逆轉PSPH 過表達對MMP‐9 的上調作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5C）；敲低PSPH 可明顯下調MMP‐9 表達，而TNF‐α 可逆轉PSPH 敲低對MMP‐9 表達的下調作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5D）。

圖5 PSPH 對NF‐κB/MMP‐9 信號通路的影響A-B：免疫熒光檢測PSPH 過表達或敲低后p65 亞單位核轉位情況；C-D：Western blot 檢測PSPH過表達或敲低后MMP‐9的表達水平Figure 5 Effect of PSPH on NF-κB/MMP-9 pathwayA-B:Nuclear translocation of the p65 submit after PSPH overexpression or knockdown determined by fluorescence staining; C-D:Expression levels of MMP‐9 after PSPH overexpression or knockdown determined by Western blot analysis

3 討論

HCC 是發(fā)生率和病死率較高的惡性腫瘤，其發(fā)生機制與多種基因轉錄和信號轉導密切相關。無限增殖和轉移是癌癥的主要特征，也是HCC 導致死亡的主要原因。因此，迫切需要識別潛在的治療靶點，了解HCC 進程中的潛在分子機制。

已有研究報道PSPH 在多種惡性腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。例如，PSPH 通過激活Akt/AMPK 通路促進非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲[9]。Michael 等[10]發(fā)現PSPH 在皮膚鱗狀細胞癌中高表達，敲低PSPH 抑制鱗狀上皮細胞的增殖。在結腸癌中，通過抑制PSPH 的表達能增強5-氟尿嘧啶的抗癌療效[11]。臨床研究表明，高表達的PSPH 在乳腺癌[8]、子宮內膜癌[12]和甲狀腺癌[13]中是一種有前途的預后生物標志物。既往研究中有關PSPH 在HCC 中的作用機制研究極其稀少。Sun等[14]表明在HCC 患者中，PSPH 與病死密切相關。在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，c‐Myc 激活絲氨酸生物合成途徑增加PSPH 的表達，從而促進HCC 進展。本研究結果顯示PSPH 在HCC 組織和細胞中表達上調，過表達PSPH 可顯著促進HCC 細胞增殖和侵襲，而下調PSPH 顯著抑制細胞增殖和侵襲。進一步研究表明，PSPH 通過增LC3‐II/LC3‐I 和減少p62 的表達，誘導自噬。自噬的特征是通過雙層膜或多層膜的自噬小泡包裹細胞質和細胞器，隨后被傳遞到細胞中進行降解。Gao 等[15]表明激活AMPK/mTOR 通路可誘導細胞自噬，從而促進HCC 細胞的侵襲和遷移。Zhang 等[16]表明PSPH 通過激活LKB1 和TAK1調節(jié)AMPK/mTOR/ULK1 通路促進HCC 細胞增殖和遷移，誘導自噬。此外，TAK1 通過激活NF‐κB 信號，增強卵巢癌細胞的致癌能力[17]。Tey 等[18]表明，通過上調TAK1 激活NF‐κB 信號通路促進HCC 的發(fā)生和轉移。隨后，本研究發(fā)現PSPH 通過調節(jié)NF‐κB p65 的表達促進MMP‐9 的表達。

MMP‐9 來源于基質金屬蛋白酶家族，主要通過降解細胞外基質促進癌細胞向鄰近正常細胞侵襲[19-20]。眾所周知，MMP‐9 等因子在惡性腫瘤侵襲、轉移和血管形成過程具有不可或缺的地位[21-23]。既往研究表明，MMP‐9 在頭頸部鱗狀細胞癌高表達[24]，并與淋巴轉移和喉癌呈正相關[25-26]。目前研究表明，HCC 中過表達PSPH 后MMP‐9 表達上調，NF‐κB p65 表達水平升高。當加入NF‐κB 通路抑制劑后，MMP‐9 表達降低。敲低PSPH 后觀察到與上述相反的現象。已有證據表明，NF‐κB p65與頻發(fā)的HCC 腫瘤細胞侵襲轉移行為密切相關[27]。此外，已有研究表明MMP‐9 啟動子包含與NF‐κB p65 蛋白結合位點同源的基序，通過上調NF‐κB p65，促進MMP‐9 的轉錄和表達，從而導致HCC 細胞侵襲和轉移[28-30]。本研究首次證明，在HepG2 細胞中PSPH 通過NF‐κB 通路誘導MMP‐9 表達升高，可能部分解釋了PSPH 介導HepG2 細胞侵襲行為。

綜上所述，本研究揭示了PSPH 是一個參與HCC 增殖、轉移和自噬的重要致癌基因。PSPH 可以激活NF‐κB 信號通路調節(jié)MMP‐9 的表達促進HepG2 細胞增殖和轉移，為了解HCC 進展提供了理論基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。