程 靜，王海莉，郭 焱

膿毒癥是指由多種病原微生物及其產(chǎn)物(毒素)作用于機(jī)體導(dǎo)致臟器功能受累的一類疾病，即嚴(yán)重感染引起臟器功能受損甚至衰竭。急性肺功能衰竭和膿毒性心肌病是膿毒癥及膿毒性休克常見(jiàn)的并發(fā)癥，直接影響膿毒癥病人預(yù)后[1]。急性肺功能衰竭早期表現(xiàn)為急性肺損傷，病理變化為肺組織中性粒細(xì)胞聚集、水腫及組織纖維化[1]。盡管眾多研究者采用不同的治療方法控制膿毒癥病人急性肺損傷和心肌受累，病人死亡率仍居高不下。目前，針對(duì)急性肺損傷和膿毒性心肌病多采用對(duì)癥支持治療，療效欠佳，急需有效的治療方案改善癥狀[2-3]。科學(xué)的液體管理對(duì)膿毒癥病人預(yù)后有重要影響，危重病醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，關(guān)于液體管理策略存在爭(zhēng)議[4]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，高滲鹽水(hypertonic saline，HS)復(fù)蘇的效果較好[5-6]。既往研究表明，HS可降低膿毒癥小鼠內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及肺纖維化程度[7]。雖然HS復(fù)蘇在控制炎癥過(guò)程和降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退劳雎史矫嬗泻锰?，但臨床實(shí)踐尚未得到證實(shí)。相關(guān)研究表明，通過(guò)HS與生理鹽水(normal saline，NS)治療創(chuàng)傷的病人28 d后生存期無(wú)明顯改善[8]。有研究顯示，盡管HS復(fù)蘇未明顯降低死亡率，但其降低了多器官衰竭的發(fā)生率并改善了血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[9]。臨床研究未得到滿意效果的原因，可能與使用HS治療時(shí)體內(nèi)白細(xì)胞活化有關(guān)，亦有研究表明，HS復(fù)蘇可直接調(diào)節(jié)體內(nèi)多形核白細(xì)胞的功能，多形核白細(xì)胞的調(diào)節(jié)及炎癥和組織損傷的預(yù)防需在疾病發(fā)作后立即進(jìn)行充分的液體復(fù)蘇[10]。

盡管明確了早期液體復(fù)蘇的重要性，臨床實(shí)踐中較難在早期采用這種措施治療。實(shí)驗(yàn)研究中，通常在注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或盲腸結(jié)扎和穿刺術(shù)后15 min使用HS。本研究建立細(xì)菌性LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷家兔模型后，觀察不同復(fù)蘇液、早期與晚期液體復(fù)蘇對(duì)心肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100只健康雄性新西蘭白兔，3～4月齡，體質(zhì)量2.0～2.6 kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物健康且符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)混合物(腹腔內(nèi))麻醉動(dòng)物。100只雄性新西蘭白兔經(jīng)腹腔注射LPS后分為兩部分，一部分家兔模型中，50只用于生存率研究(每組10只)；一部分家兔模型中，50只動(dòng)物用于測(cè)定心肺功能及多種細(xì)胞因子表達(dá)(每組10只)。每部分家兔模型隨機(jī)分為5組，脂多糖感染組(LPS組)：通過(guò)單次腹腔注射LPS(10 mg/kg)誘導(dǎo)；早期高滲鹽水治療組(HS15組)：腹腔注射LPS并采用HS處理，4 mL/kg(靜脈注射)，注射LPS后15 min；早期生理鹽水治療組(NS15組)：腹腔注射LPS并采用NS處理，34 mL/kg(靜脈注射)，注射LPS后15 min；晚期高滲鹽水治療組(HS90組)：腹腔注射LPS并采用HS處理，4 mL/kg(靜脈注射)，LPS注射后90 min；晚期生理鹽水治療組(NS90組)：腹腔注射LPS并采用NS處理，34 mL/kg(靜脈注射)，LPS注射后90 min。本研究LPS劑量(10 mg/kg體重)可引起敗血癥和急性器官損傷。LPS注射后90 min，炎癥過(guò)程已確定。膿毒癥治療指南(Surviving Sepsis Campaign，SSC)要求在發(fā)病后90 min內(nèi)進(jìn)行液體復(fù)蘇，因此將發(fā)病15 min作為早期復(fù)蘇時(shí)間點(diǎn)，發(fā)病90 min作為晚期液體復(fù)蘇時(shí)間點(diǎn)。HS和NS在兩種治療中的輸注時(shí)間相同。LPS誘導(dǎo)急性肺損傷和心肌損傷后24 h采集右肺和右心室進(jìn)行組織學(xué)分析，采集左肺和左心室并冷凍，進(jìn)行細(xì)胞因子定量、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)量并分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 TRIzol試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBRTMPremix Ex TapTM均購(gòu)自日本TaKaRa公司。DW-3000型小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和白細(xì)胞介素10(IL-10)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司，Nano-500型分光光度計(jì)購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)MyCycler公司，所有引物均由北京奧克鼎盛生物公司合成。

1.4 方法

1.4.1 生存率 按1.2所述進(jìn)行內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肺損傷和治療，并分析72 h后各組生存率。LPS組、HS15組、NS15組、HS90組和NS90組均有10只家兔。麻醉恢復(fù)后，每12 h對(duì)動(dòng)物進(jìn)行1次監(jiān)測(cè)。通過(guò)注射CO2對(duì)家兔實(shí)施安樂(lè)死，生存率分析期為72 h后進(jìn)行頸椎脫位。

1.4.2 細(xì)胞因子定量 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定各組心、肺組織樣本TNF-α、TGF-β和IL-10水平?？偟鞍诐舛韧ㄟ^(guò)Bradford蛋白分析儀進(jìn)行測(cè)量。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子濃度，并以pg/mg總蛋白表示。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 通過(guò)qRT-PCR分別檢測(cè)各組家兔心、肺組織熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)、熱休克蛋白90(HSP90)和熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達(dá)。采用TRIzol提取組織樣本的總RNA，使用NANOVUE分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度。根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa的熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配備反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。按照預(yù)變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、15 s，退火與延伸60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。以循環(huán)閾值(Ct值)作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，測(cè)定的數(shù)據(jù)為目的Ct值與內(nèi)參Ct值(GAPDH為內(nèi)參)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-△△Ct(Livak法)進(jìn)行處理分析，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔生存率比較 經(jīng)LPS誘導(dǎo)后的家兔出現(xiàn)心肺功能衰竭，導(dǎo)致死亡，統(tǒng)計(jì)LPS誘導(dǎo)72 h后各組家兔生存情況。LPS組5只死亡，存活率為(50.0%)，HS15組家兔全部存活，HS90組4只死亡，NS15組3只死亡，NS90組3只死亡。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組家兔存活數(shù)量比較

2.2 各組心肺組織細(xì)胞因子含量比較 膿毒癥發(fā)作24 h后評(píng)估早期和晚期HS和NS治療對(duì)心、肺組織細(xì)胞因子濃度的影響。與LPS組、HS15組和NS15組比較，HS90組、NS90組TNF-α升高(P<0.05)。與LPS組、HS15組和NS15組比較，HS90組、NS90組IL-10降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肺組織細(xì)胞因子含量比較(A為TNF-α；B為IL-10)

2.3 各組心肺組織HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)比較 熱休克蛋白(HSP)作為免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑發(fā)揮著重要作用。與NS15組、HS90組和NS90組比較，HS15組HSP70 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與NS15組、HS90組和NS90組比較，HS15組HSP90 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肺組織HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)比較(A為HSP70 mRNA；B為HSP90 mRNA)

2.4 各組心肺組織TGF-β蛋白和HSP47 mRNA表達(dá)比較 心肺損傷及其組織修復(fù)發(fā)生在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷早期，TGF-β在這一修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ELISA結(jié)果顯示，與NS15組和NS90組比較，HS15組TGF-β表達(dá)降低(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與LPS組比較，HS15組HSP47 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組心肺組織TGF-β蛋白和HSP47 mRNA表達(dá)比較(A為TGF-β蛋白；B為HSP47 mRNA)

3 討 論

心和肺是膿毒癥及膿毒性休克病人最易受累的靶器官[1]?？茖W(xué)積極補(bǔ)液是危重病人治療的重要手段，處理不善導(dǎo)致心肺功能惡化，并嚴(yán)重影響病人預(yù)后。維持有效滲透壓，減少液體容積的有效替代方法是使用高滲溶液或膠體溶液，其對(duì)病人預(yù)后的影響尚不明確。有研究顯示，早期使用HS治療心肺損傷有效[11]，但后期使用HS進(jìn)行液體復(fù)蘇治療膿毒癥性急性肺損傷和膿毒性心肌受損療效尚不明確。本研究結(jié)果表明，早期HS治療改善家兔心肺損傷，降低了死亡率。晚期HS和NS在膿毒癥誘導(dǎo)的心肺損傷及死亡率方面均無(wú)改善。

目前，一種常用的動(dòng)物模型提供了關(guān)于急性肺損傷發(fā)病機(jī)制的重要信息，即腹腔注射細(xì)菌LPS引起的內(nèi)毒素血癥。LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷及膿毒性心肌病，由于炎性因子作用于器官小血管，引起毛細(xì)血管內(nèi)皮受損，滲漏造成器官組織水腫，進(jìn)而器官功能下降。急性肺損傷表現(xiàn)為肺順應(yīng)性降低及肺阻力升高的呼吸動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)[12]。膿毒性心肌病造成心肌彌漫性收縮力下降，甚至造成休克。與膿毒癥、多臟衰病人相似，造模的家兔中，觀察到肺功能和心功能下降。早期采用HS液體復(fù)蘇通過(guò)提高晶體滲透壓，增加有效血容量，提高血壓，減輕組織水腫，進(jìn)而改善臟器功能。對(duì)晚期液體復(fù)蘇來(lái)說(shuō)，由于已造成器官組織腫脹，功能受累甚至細(xì)胞壞死，無(wú)論采用何種液體改善療效均不明顯。本研究與既往研究[13]結(jié)果一致，表明急性肺損傷和膿毒性心肌病病人早期恰當(dāng)?shù)囊后w管理可影響預(yù)后，改善心肺功能，降低死亡率。

大量炎癥介質(zhì)在LPS誘導(dǎo)的心肺損傷發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這些細(xì)胞因子表達(dá)的最大量發(fā)生在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥早期[14]，即注射LPS后1.5～6.0 h，心肺損傷預(yù)防需要在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥臟器受累模型早期進(jìn)行干預(yù)，包括充分的液體復(fù)蘇。本研究結(jié)果表明，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)之前，HS早期液體復(fù)蘇在控制炎癥方面具有重要作用。炎癥發(fā)生后，不管采用何種液體均無(wú)效，原因可能是由于細(xì)胞因子釋放和炎癥狀態(tài)增加所致。肺部炎癥期間，熱休克蛋白的一過(guò)性產(chǎn)生與調(diào)節(jié)肺損傷有關(guān)。HSP70作為一種具有修復(fù)作用的蛋白分子，在抗炎過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究觀察到HS早期液體復(fù)蘇增加了HSP70表達(dá)。晚期液體復(fù)蘇時(shí)，HSP70表達(dá)無(wú)明顯改變。表明晚期液體復(fù)蘇的動(dòng)物體內(nèi)炎癥反應(yīng)已增加。

LPS誘導(dǎo)的心肺損傷表現(xiàn)為心和肺成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌，兩種現(xiàn)象在發(fā)病早期均可觀察到，可能與心肺順應(yīng)性降低有關(guān)[16]。有研究顯示，膿毒性休克中，Ⅲ型膠原(維持肺彈性)可能被Ⅰ型膠原(肺纖維化的標(biāo)志)取代，解釋了心和肺功能衰竭程度[17]。成纖維細(xì)胞合成膠原時(shí)需要細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其他生物活性分子參與[18]。相關(guān)研究顯示，TGF-β在炎癥修復(fù)過(guò)程中控制細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，HS15組肺組織TGF-β表達(dá)均低于其他組。膠原蛋白合成的另一個(gè)重要因素是HSP47，HSP47分子是膠原蛋白合成過(guò)程中特異性分子伴侶，與LPS誘導(dǎo)的家兔心肺Ⅰ型膠原表達(dá)增加相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，HS15組HSP47降低，晚期液體復(fù)蘇均無(wú)明顯改善。

綜上所述， HS進(jìn)行早期液體復(fù)蘇后多種炎性因子含量或活性均降低，即早期液體復(fù)蘇可減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥動(dòng)物心肺損傷，晚期液體復(fù)蘇無(wú)論使用哪種液體均不理想。上述結(jié)果表明HS在疾病治療早期有效，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)相關(guān)作用逐漸喪失，LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷和膿毒性心肌病模型中，晚期液體復(fù)蘇可能加重心肺組織炎癥和組織損傷。HS有效復(fù)蘇的治療窗口期較短，即在發(fā)病后15 min，這是臨床使用HS的一個(gè)重要限制，關(guān)于HS液體復(fù)蘇療效有待進(jìn)一步研究明確。