蔡逸馨，王畇欽，王 娟，李 謹(jǐn)

隨著微創(chuàng)理念和生物活性材料的發(fā)展，活髓保存治療受到了廣泛關(guān)注，其可最大限度保留剩余健康牙髓組織，提高牙齒遠(yuǎn)期保存率，但長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為適用范圍有限，療效不穩(wěn)定。這一治療的生物學(xué)基礎(chǔ)在于人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)具有良好的增殖與成牙/成骨向分化能力。

目前關(guān)于hDPSCs的研究多局限于乳牙、根尖未發(fā)育完成的年輕恒牙以及40歲以下患者根尖已發(fā)育完成的恒牙[1-4]，對(duì)40歲以上患者恒牙研究較少[5-6]。至2020年底，我國(guó)60歲及以上人口比重已達(dá)到18.7%，老年人牙齒保存不容忽視。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，牙髓組織中細(xì)胞成分減少，纖維成分增加，同時(shí)牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)活性也可能存在增齡性的改變[7-8]，然而關(guān)于hDPSCs生物學(xué)行為隨年齡變化的基本規(guī)律尚不可知。

本研究擬比較不同年齡患者h(yuǎn)DPSCs的生物學(xué)特性，了解增齡因素對(duì)其影響的基本規(guī)律，以期為老年人活髓保存治療提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、0.25%胰酶、Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(FBS)(Sciencell，美國(guó))；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Biosharp，中國(guó))；油紅O染色試劑盒、茜素紅染液、維生素C、氯化十六烷基吡啶(Solarbio，中國(guó))；雙抗(新賽美，中國(guó))；β甘油磷酸鈉、吲哚美辛(Sigma，美國(guó))；地塞米松、胰島素、CCK8檢測(cè)試劑盒(APExBIO，美國(guó))；CD34-FITC、CD90-APC、CD73-PEcy、CD146-PE(BD Pharmingen，美國(guó))；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；qPCR試劑盒(Vazyme，美國(guó))。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、二氧化碳恒溫孵箱(Thermo，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Leica，德國(guó))；多色分析流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))；微孔板分光光度計(jì)(MD，美國(guó))；ABI熒光定量PCR儀(QuantStudio7，美國(guó))。

1.2 研究對(duì)象

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PJ2020-094-001)，選擇2020年4月至2020年9月就診于江蘇省口腔醫(yī)院口腔頜面外科門(mén)診患者，獲取拔除的完整前磨牙或磨牙共計(jì)15顆。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者無(wú)系統(tǒng)性疾病，口腔衛(wèi)生狀況良好；②牙齒無(wú)累及牙髓的病變；③牙齒根尖已發(fā)育完成。

根據(jù)Harms等[9]研究及我國(guó)年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)分為3組：A組患牙提供者≤18歲，共5例；B組19～59歲，共6例；C組≥60歲，共4例。

1.3 hDPSCs體外分離、培養(yǎng)與傳代

牙齒拔除后立刻浸泡于含2%雙抗的PBS溶液中，置于超凈臺(tái)，PBS充分沖洗血塊等表面雜質(zhì)，無(wú)菌紗布包裹，砸開(kāi)牙齒，取出牙髓組織，胰酶、膠原酶聯(lián)合處理，放入37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液。細(xì)胞從組織塊中爬出，達(dá)到80%～90%融合后，37 ℃胰酶消化，按1∶3比例傳代。倒置顯微鏡下觀察各組原代和傳代后細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 hDPSCs表面抗原測(cè)定

選取第2代hDPSCs，以1×103個(gè)/μL密度置于EP管內(nèi)，每管100 μL，在避光條件下分別加入抗體CD34-FITC、CD90-APC、CD73-PEcy、CD146-PE，4 ℃避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.5 成骨向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

提取第2代hDPSCs，以1×105個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，A、B、C組均設(shè)置對(duì)照組及成骨誘導(dǎo)組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，每3 d換一次液。成骨誘導(dǎo)組常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d后更換為成骨誘導(dǎo)液(α-MEM+10%FBS+2%雙抗+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 mg/L維生素C+10 nmol/L地塞米松)，每3 d換一次液，培養(yǎng)2周。2周后PBS清洗各組細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，棄固定液。雙蒸水清洗細(xì)胞3次，茜素紅染色液染色10 min，雙蒸水洗去殘留染液，每孔加1 mL PBS，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。鏡下觀察后，用10%氯化十六烷基吡啶溶解，置于脫色搖床上30 min，至礦化結(jié)節(jié)全部無(wú)色，將洗脫液轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，于酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.6 成脂向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

提取第2代hDPSCs，以1×105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，每組均設(shè)置對(duì)照組及成脂誘導(dǎo)組。陰性對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)3周，每3 d換一次液。成脂誘導(dǎo)組常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞1 d后更換成脂誘導(dǎo)液(α-MEM+10%FBS+2%雙抗+1 mg/mL胰島素+0.5 mmol/L IBMX+0.2 mmol/L吲哚美辛+2 mmol/L地塞米松)。每3 d換一次液，誘導(dǎo)3周。3周后PBS清洗各組細(xì)胞，按油紅O染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，4%多聚甲醛固定30 min，棄固定液。雙蒸水沖洗3次，加入油紅O染色工作液染色30 min，雙蒸水沖洗2～3次后顯微鏡下觀察脂滴形成情況。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

提取第4代hDPSCs，以1×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，每3 d換液，培養(yǎng)1周。分別于第1、3、5、7天加入CCK-8，加入2 h后分光光度計(jì)450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.8 成骨誘導(dǎo)下不同年齡組成牙/成骨礦化基因表達(dá)的差異

選取第4代hDPSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和成骨誘導(dǎo)組，對(duì)照組采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)組采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，每2～3 d換液。7 d后，RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、核心結(jié)合因子α1(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，COL-1)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由北京擎科生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs體外分離、培養(yǎng)與傳代

各年齡組hDPSCs貼壁后基本呈長(zhǎng)梭形，胞體較大，胞核居中。其中C組細(xì)胞出現(xiàn)衰老征象：細(xì)胞拉長(zhǎng)，多形性細(xì)胞增多，且細(xì)胞核溶解、破裂情況增多(圖1)。患者年齡直接影響細(xì)胞爬出時(shí)間，隨著年齡增長(zhǎng)，細(xì)胞爬出所需時(shí)間更長(zhǎng)，A組、B組與C組之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表2)。

P0：原代細(xì)胞培養(yǎng)；P1：傳代后的細(xì)胞

表2 各組細(xì)胞爬出時(shí)間比較

2.2 hDPSCs表面抗原測(cè)定

本研究將各組分離培養(yǎng)的hDPSCs培養(yǎng)擴(kuò)增后，用熒光標(biāo)記的流式抗體CD146-PE、CD90-APC、CD73-PEcy、CD34-FITC檢測(cè)hDPSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組hDPSCs均高表達(dá)CD73、CD90(表達(dá)率>90%)，低表達(dá)CD146(表達(dá)率<20%)，不表達(dá)CD34(表達(dá)率<1%)(圖2)。

圖2 各組牙髓干細(xì)胞表面抗原測(cè)定

2.3 成骨向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

茜素紅染色大體觀察發(fā)現(xiàn)各成骨誘導(dǎo)組染色均呈陽(yáng)性，與對(duì)照組有明顯差異(圖3a)。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各誘導(dǎo)組細(xì)胞均可見(jiàn)散在的、密度與大小不一的紅色礦化結(jié)節(jié)。且年齡越大，礦化結(jié)節(jié)分布越松散、數(shù)量減少、單個(gè)結(jié)節(jié)面積減少(圖3b)。茜素紅半定量分析鈣鹽沉積量結(jié)果顯示，3組hDPSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)處理后， 細(xì)胞鈣鹽沉積量均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)，而且隨著年齡的增長(zhǎng)，鈣鹽沉積量明顯下降(P<0.05)(圖3c)。

a：茜素紅染色結(jié)果肉眼觀；b：茜素紅染色鏡下觀( ×4)；c：茜素紅半定量測(cè)定;*：P<0.05

2.4 成脂向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞經(jīng)3周成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)后油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察均可發(fā)現(xiàn)明顯的脂滴，與對(duì)照組有明顯差異(圖4)。此外，鏡下觀察顯示C組較其余兩組脂滴形成明顯增多。

圖4 油紅O染色結(jié)果

2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長(zhǎng)的第1～5天，各組均具有較強(qiáng)的增殖能力，至第7天時(shí)生長(zhǎng)基本進(jìn)入平臺(tái)期，甚至較第5天有所下降(圖5)。第1天至第5天，各組間具有明顯的差異(P<0.05)。第7天時(shí)，A、B兩組增殖能力無(wú)明顯差異，但C組增殖能力較其余兩組明顯下降(P<0.05)。

*：P<0.05

2.6 各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)下成牙/成骨基因表達(dá)情況

在成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)下，A、B組成骨誘導(dǎo)細(xì)胞DSPP、OCN、RUNX2、OPN mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，COL-1 mRNA與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)；C組DSPP、OCN的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上升(P<0.05)，RUNX2的表達(dá)與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異(P>0.05)，OPN、COL-1的表達(dá)較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

*:與對(duì)照組相比，P<0.05

3 討 論

老年人群口腔保健意識(shí)較差，中重度牙周炎、根面齲發(fā)病率較高[10-11]，牙齒拔除時(shí)牙髓大多已被炎癥累及。另外，患者牙齒長(zhǎng)期受到磨耗及生理或病理性刺激，大量反應(yīng)性牙本質(zhì)形成，髓腔縮窄甚至閉鎖。這些均導(dǎo)致牙髓組織提取難度較大，使老年患者活髓保存治療的相關(guān)研究受到一定限制。本研究中，60歲及以上患者4例，最高供體年齡76歲，均成功分離培養(yǎng)hDPSCs。

之前研究中將所有年齡的牙髓干細(xì)胞同等化，忽略了其增齡性的改變，具有局限性。因此，本實(shí)驗(yàn)將患牙按患者年齡階段進(jìn)行分組，以體現(xiàn)增齡性因素對(duì)hDPSCs生物學(xué)行為影響。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，乳、恒牙牙髓干細(xì)胞的免疫表型、周期分布等并無(wú)明顯差異[12]，提示乳、恒牙均可嘗試活髓保存治療。本研究中流式測(cè)定結(jié)果顯示各組細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)表面標(biāo)志物CD73、CD90(>90%)，低表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD146(<20%)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34(<1%)，證實(shí)了各年齡組牙髓細(xì)胞確實(shí)為MSC，同時(shí)提示老年人hDPSCs也可以擁有良好的增殖和分化能力。

本研究中，各組hDPSCs均具有一定的增殖能力，并存在增齡性降低。老年人的牙髓組織中，細(xì)胞成分減少，纖維成分增加。并且隨著年齡增加，成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生退行性變，出現(xiàn)空泡、萎縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，嚴(yán)重時(shí)部分或全部細(xì)胞消失[13-14]，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖減弱。Wu等[15]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較了不同年齡患者h(yuǎn)DPSCs的分化能力，發(fā)現(xiàn)55～67歲組分化能力部分減弱。本研究發(fā)現(xiàn)年齡越大，成骨能力越低，60歲及以上患者h(yuǎn)DPSCs雖然有一定的成牙/成骨向分化能力，但是明顯較低年齡患者h(yuǎn)DPSCs差，且形態(tài)欠佳。隨著年齡增長(zhǎng)，牙髓干細(xì)胞自我調(diào)節(jié)能力改變，最終導(dǎo)致喪失一部分生物學(xué)效能，機(jī)體抗氧化能力不斷下降，體內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)不斷蓄積，使得細(xì)胞內(nèi)氧化及抗氧化機(jī)制失調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生理生化和代謝功能障礙，誘發(fā)細(xì)胞衰老[16]。但是，牙髓干細(xì)胞衰老對(duì)其成牙/成骨向分化的具體影響機(jī)制尚缺乏研究。Bakopoulou等[17]證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可提高牙髓干細(xì)胞RUNX2、COL-1等礦化基因的表達(dá)水平，促進(jìn)其成骨向分化，而年齡增長(zhǎng)引起的細(xì)胞應(yīng)激增加導(dǎo)致叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O的激活，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)，最終抑制骨形成[18]。由此可以推測(cè)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制可能是牙髓干細(xì)胞增齡性功能下降的重要原因之一。因此，臨床上應(yīng)用活髓保存治療老年患者時(shí)需要更加謹(jǐn)慎。MTA、iRoot BP、Biodentine等改良生物活性蓋髓材料的出現(xiàn)或?qū)⒂兄谠鰪?qiáng)老年人hDPSCs的增殖和分化能力，提高該人群活髓保存治療的成功率，已有研究證實(shí)了它們對(duì)hDPSCs的增殖和成牙/成骨向分化能力具有明顯的促進(jìn)作用[19-21]。

雖然本研究中，60歲及以上患者h(yuǎn)DPSCs成脂誘導(dǎo)后形成的脂滴明顯較其余各組多，但這并不能說(shuō)明其功能良好，可能是過(guò)多ROS引起脂肪代謝功能障礙，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，最終促成細(xì)胞損傷、衰老甚至死亡。p21、p53、pRb、p16是參與細(xì)胞衰老最重要的分子，已有大量實(shí)驗(yàn)證明，這些分子可直接或間接調(diào)控hDPSCs的衰老進(jìn)程[22-26]。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞層面上為老年人牙髓的保存提供了參考，對(duì)于hDPSCs的衰老影響成牙/成骨向分化的具體機(jī)制以及機(jī)制的合理調(diào)控方法，仍有待于今后的進(jìn)一步研究。