劉 洋,許 瑩，董丹江

牙周炎是由于細菌侵犯牙齦和牙周組織而引起的慢性炎癥，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，是世界范圍內最常見的口腔疾病之一[1]。研究表明，慢性牙周炎患者局部組織炎性細胞浸潤，唾液、齦溝中分泌大量的炎性因子，通過牙周袋潰瘍不斷進入血液循環(huán)系統(tǒng)，增加全身炎癥負荷[2]，有引起全身器官功能損傷的風險?，F(xiàn)在有大量的證據(jù)支持嚴重牙周炎和幾種非傳染性疾病之間的獨立聯(lián)系，如糖尿病[3]、心血管疾病[4]、慢性阻塞性肺疾病[5]、慢性腎臟疾病[6]。研究表明，嚴重牙周炎與全因死亡率及心血管風險增加相關[7]；牙周炎大鼠模型的肝組織出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、纖維化、肝小葉變性及局部壞死等病理表現(xiàn)[8]，牙周炎影響終末期腎臟病患者的發(fā)病率和死亡率[9]。目前認為牙周炎可能通過循環(huán)中的炎癥因子、氧化應激反應等影響全身多個臟器功能，但更加確切具體的機制仍不明確，有待于進一步探索。

P物質(substance P,SP)是一種小分子神經肽，由TAC1基因編碼，從感覺神經末梢釋放，并通過與神經激肽(neurokinin-1， NK-1)受體結合發(fā)揮生物學作用。作為一種較強的致炎因子，SP參與了機體的免疫調控。本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)重復牙周注射，誘導慢性牙周炎模型，并通過外周給予NK-1受體拮抗劑，探索SP在牙周炎誘導全身炎癥反應致多器官功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL小鼠，雄性，30只，6～8周齡(購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場)。本實驗通過南京大學實驗動物倫理委員會批準，實驗均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

牙齦卟啉單胞菌脂多糖P.gingivalisLPS(Sigma-Aldrich, 美國)，胎牛血清(Gibico，美國)，DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，青鏈霉素雙抗(Thermo,美國)，P物質白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Minneapolis,美國)，丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase, AST)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, Cr)試劑盒(南京建成生物研究所有限公司，中國)，NK-1受體拮抗劑L732138(TOCRIS，英國),P物質(Sigma-Aldrich，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 適應性喂養(yǎng)2周。隨機分為對照組和實驗組，各6只小鼠。4%戊巴比妥麻醉，仰臥位，四肢及上頜固定于手術板上，以乙醇消毒，在小鼠上頜右側第一和第二磨牙之間頰腭側自齦溝注射LPS，0.5 mg/kg。每周3次，連續(xù)6周，同時間在同部位重復。對照組以相同方法注射生理鹽水。觀察各組牙齦顏色充血狀況。6周后 4%戊巴比妥麻醉下處死小鼠，取其肝臟、腎臟及肺組織進行后續(xù)實驗。

1.2.2 動物分組 將小鼠隨機分為3組(每組6只):對照組、LPS組、LPS+NK-1受體拮抗劑組。LPS組按照1.2.1所示方法造模， LPS+NK-1受體拮抗劑組每次LPS給藥前L732138腹腔注射，5 mg/kg。

1.2.3 牙周檢查 肉眼觀察各組小鼠右側上頜第一磨牙牙齦情況，檢查牙周探診深度、牙齒松動度、齦溝出血指數(shù)等確認牙周炎模型成功。收集的齦溝液立即轉移到1.5 mL EP管中，-70 ℃儲存，備用。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 取部分肝、腎、肺組織置于4%中性甲醛固定液中48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(3 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，顯藍液返藍，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.5 ELISA 第6周時采集小鼠全血， 4 ℃條件下1 000 r/min離心1 min，分離血清。ELISA檢測血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度，按照說明書設復孔。對照組的血液樣本作為基線。

1.2.6 血清ALT、AST、BUN、Cr的測定 采集小鼠全血， 4 ℃條件下1 000 r/min離心1 min，分離血清。根據(jù)試劑盒使用說明進行操作。

1.2.7 巨噬細胞培養(yǎng)及實驗 小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7來自本實驗室細胞庫保存。予含 10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7，培養(yǎng)環(huán)境：5% CO2、37 ℃，每 24 h更換一次培養(yǎng)基，每2～3 d以 1∶3 的比例進行傳代。使用0.1 μg/mL LPS刺激、0.1 μg/mL SP、1 μg/mL SP分別刺激RAW264.7細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，檢測上清液中細胞因子的分泌情況；將1 μg/mL SP與10 μg/mL的L732178 同時刺激RAW264.7細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，檢測上清液中細胞因子的分泌情況。

1.2.8 肺組織病理學評分 根據(jù)管腔周圍浸潤的細支氣管數(shù)目、管腔周圍浸潤情況、管腔內滲出情況、血管周圍浸潤、實質性肺炎5個項目進行計分，總分26分，具體方法參考文獻[10]。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計通過SPSS 20.0或GraphPad Prism 5進行。所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差。組間比較采用單因素方差分析。如果觀察到顯著性差異，則使用Bonferroni多重檢驗來比較組間差異。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 建立牙周炎誘導全身炎癥反應致多器官功能損傷的模型

與對照組相比，LPS誘導牙周炎組齦溝液中、血清中的SP含量均明顯升高(P<0.001)，同時血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平也較對照組升高(P<0.001)(圖1)。對照組小鼠肺組織、肝臟及腎臟組織的HE染色，無明顯組織學改變。LPS誘導牙周炎小鼠的各器官HE染色，可見肝細胞形態(tài)喪失，呈微泡性脂肪變性；腎小球腫脹，血管充血；肺間質大量的炎性細胞浸潤，平滑肌增殖，小血管閉塞(圖2)。LPS組的ALT和AST輕度升高(P<0.05)，而Cr和BUN較對照組無顯著性差異(P>0.05)，兩組的肺組織病理學評分有顯著性差異(P<0.001)(圖3)。

A:兩組小鼠齒齦溝液及血清中的SP水平;B:兩組小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；***：P<0.001

圖2 兩組小鼠肺、肝臟、腎臟的HE染色(n=6， ×200)

*：P<0.05；***：P<0.001

2.2 NK-1受體拮抗劑改善牙周炎誘導全身炎癥反應致多器官功能損傷

與LPS組相比，NK-1受體拮抗劑L732138改善了全身炎癥反應，血清中IL-1β水平較LPS組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，血清中的TNF-α和IL-6水平較LPS有輕度下降，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。HE染色顯示，與LPS組相比，加NK-1受體拮抗劑后，小鼠的肺組織炎癥細胞浸潤減少，肝細胞形態(tài)改善，腎小球腫脹、血管充血均有所好轉。相較于LPS組，NK-1受體拮抗劑降低了ALT的水平，改善了肺組織病理學評分；而對于AST無明顯影響(P>0.05),見圖4、5。

*：P<0.05；**：P<0.01;***：P<0.001

圖5 三組小鼠肺、肝臟、腎臟的HE染色(n=6, ×200)

2.3 SP及NK-1受體拮抗劑對于小鼠巨噬細胞活化分泌IL-1β的作用

分別以LPS和不同濃度的SP孵育小鼠巨噬細胞48 h，上清液中均能檢測到IL-1β，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，LPS 0.1 μg/mL，SP 0.1 μg/mL及SP 1 μg/mL誘導巨噬細胞產生IL-1β的能力相似，三組間無統(tǒng)計學差異。NK-1受體拮抗劑L732138能夠部分逆轉SP誘導巨噬細胞產生IL-1β的作用，且有統(tǒng)計學差異(P<0.001)，圖6。

與對照組比較，***：P<0.001；與SP 1 μg/mL組比較，###：P<0.001)；n=6

3 討 論

在牙周炎和牙周膿腫患者的牙周袋中存在多種細菌和炎性滲出物。嚴重牙周炎患者拔牙后短暫性菌血癥發(fā)生率為86%。大多數(shù)免疫功能正常者有能力清除細菌，但對于高齡、免疫功能抑制、心臟瓣膜病患者而言，極大地加重了感染風險。有研究表明，8%的感染性心內膜與牙周炎及其他口腔疾病相關[11]。Watanabe等[12]報告1例牙周炎導致了膿毒性肺栓塞；Balbierz等[13]報道了1例牙周膿腫伴廣泛頸部軟組織感染，并發(fā)膿毒性休克、缺血性腦病、壞死性筋膜炎的病例;Foronda等[14]報道了1例牙源性頸部膿腫導致感染性休克、多器官功能損傷的病例。由此可見，重度牙周炎及其伴發(fā)癥狀牙周膿腫，不僅僅影響局部牙周健康，且可能作為感染播散的來源，對全身多器官功能造成損傷。

肝臟是人體最大的消化器官，對外界的各種刺激都比較敏感。在牙周炎誘導的肝損傷中，可以看到肝細胞原有的形態(tài)喪失，肝小葉結構被破壞，呈現(xiàn)空泡改變[15]。用LPS誘導的牙周炎模型中，6周左右ALT和AST輕度升高。牙周炎和慢性腎臟病的關系也有較多研究。2005 年，Kshirsagar等[16]首次觀察到牙周炎患者腎功能下降的發(fā)生率顯著高于非牙周炎患者，認為重度牙周炎是腎功能下降的危險因素。另一項針對699例非裔美國人的回顧性隊列研究發(fā)現(xiàn)，患有重度牙周炎者發(fā)生慢性腎功能不全的概率較非牙周炎者高4倍[17]。由于腎臟有很強的儲備代償能力，只有當50%以上的腎小球受損時，傳統(tǒng)的腎病實驗室診斷指標才會發(fā)生異常。因而，在單純性重癥牙周炎的小鼠模型上，很難看到肌酐水平的明顯升高，本研究雖然在腎組織的HE染色中看到了腎小球形態(tài)的變化，但生化中的肌酐和尿素氮水平均在正常范圍內。而在糖尿病性腎病、慢性腎炎等腎功能不全的小鼠模型上，則很容易看到重度牙周炎加重了腎功能的損傷[18]。目前慢性牙周炎和肺部疾病的關系主要聚焦在慢性阻塞性肺疾病上。周政權等[19]研究認為，牙周炎與慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)可能存在相互促進作用，血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)可能在一定程度上反應COPD患者牙周炎嚴重程度及急性加重風險；莊賢文等[20]認為，牙周炎伴AECOPD患者牙周損傷程度高于單純牙周炎患者，TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子水平升高以及細菌種類與牙周炎存在密切關系。除了慢性炎癥以外，LPS還常常誘導急性肺損傷。我們在LPS誘導的牙周炎小鼠模型上，見到肺間質大量的炎性細胞浸潤，可見肺組織也是重度牙周炎的常見靶器官。

SP是一種小分子神經肽，主要通過與NK-1受體結合，發(fā)揮多種生物學效應。SP有較強的致炎效應，能夠刺激多種免疫細胞釋放大量的炎癥因子。在全身炎癥性疾病如膿毒癥中，患者血清中SP水平明顯升高。Lorente等[21]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清SP水平與30 d死亡率相關；牙周炎時,牙齦成纖維細胞中的SP呈現(xiàn)高濃度狀態(tài)，SP引發(fā)神經源性炎癥,增加免疫和炎癥應答[22-23]。倪杰等[24]研究認為：牙周炎患者齦溝液中SP含量與牙周組織的破壞程度明顯相關。Pradeep等[25]發(fā)現(xiàn)牙周破壞部位齦溝液中SP含量最高；齦溝液與血漿SP水平呈顯著正相關。Ozturk等[26]發(fā)現(xiàn)，在控制不良的糖尿病患者中，牙周炎癥可能影響循環(huán)和齦溝液中SP的水平。重度牙周炎的患者循環(huán)中的炎癥因子顯著高于非牙周炎患者，說明局部的炎癥可以通過血液循環(huán)影響全身的臟器功能。本研究中，我們在LPS誘導的牙周炎模型中使用NK-1受體拮抗劑，拮抗SP的生物學作用，發(fā)現(xiàn)血清中IL-1β的含量下降，器官功能損傷減輕；在SP刺激的巨噬細胞模型中，使用NK-1受體拮抗劑，上清液中的IL-1β明顯減少。說明SP可能通過致炎作用參與牙周炎誘導的多器官功能損傷。

本研究具有一定的局限性。①雖初步闡明了SP 在牙周炎誘導的多器官功能不全中發(fā)揮作用，但是未動態(tài)觀察局部和全身不同階段SP的變化；②全身多器官功能損傷往往由促炎和抑炎因子的分泌失衡引起，本研究僅僅檢測了致炎因子，而未檢測抑炎因子的含量；③NK-1受體拮抗劑減輕了慢性牙周炎導致的多器官功能損傷，但未能回答究竟是NK-1受體對各個器官的直接作用，還是得益于牙周炎的改善。未來仍然需要設計實驗更加深刻地探索牙周炎和多器官功能損傷的關系和機制。