張漫漫 何騰霞 丁晨雨 陳夢蘋 吳啟鳳

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽 550025）

氮化合物在生命代謝過程中起著重要的作用，通常以有機(jī)氮和無機(jī)氮兩種形式存在，有機(jī)氮包括蛋白質(zhì)、氨基酸、酰胺和尿素等；無機(jī)氮主要為銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮等［1］。然而水體中積累過多的無機(jī)氮，尤其是銨態(tài)氮大量積累易消耗水體中的溶解氧，阻礙氧在魚鰓中傳遞，威脅水生生物的生存，并引發(fā)大量細(xì)菌繁殖，使水體進(jìn)一步惡化并發(fā)出難聞的氣味，從而影響人體健康［2］；硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮作為銨態(tài)氮的硝化產(chǎn)物，會(huì)阻礙血氧的正常運(yùn)輸，引起機(jī)體缺氧窒息。此外，還會(huì)引發(fā)氯離子流失，擾亂細(xì)胞內(nèi)外鉀離子水平等［3-5］。因此，高效去除水體中的無機(jī)氮成為近些年的熱點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生物脫氮具有高效、低耗及綠色環(huán)保等特點(diǎn)，涉及微生物的硝化和反硝化過程，其中硝化過程是在硝化菌的作用下將銨鹽逐步氧化為硝酸鹽，反硝化除氮是在反硝化細(xì)菌的作用下將硝酸鹽或亞硝酸鹽逐步還原為氣態(tài)氮的過程，該過程可從根本上解決污水中無機(jī)氮超標(biāo)的問題［6］。

然而，脫氮過程中會(huì)受到各種因素的影響，自2005年以來，新型污染物納米顆粒（nanoparticles，NPs）逐漸興起，根據(jù)其性質(zhì)可分為金屬納米顆粒和非金屬納米顆粒，按其來源可分為天然納米顆粒和工程納米顆粒（engineering nanoparticles，ENPs），因ENPs的徑粒較小而具有獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)、量子效應(yīng)等物理化學(xué)性質(zhì)［7-8］，被廣泛開發(fā)應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、航天航空等領(lǐng)域，在生產(chǎn)發(fā)展及不合理的使用過程導(dǎo)致大量ENPs排放到土壤及水體中，據(jù)研究，全球超過 26-30.9 萬t的ENPs產(chǎn)量中有 63%-91% 最終進(jìn)入垃圾填埋場，8%-28%、0.4%-7%和0.1%-1.5%的ENPs分別釋放到土壤、地表水和大氣中［9］。目前國內(nèi)外均有報(bào)道ENPs對(duì)污水處理中脫氮微生物的影響，如1.25 mg/L的CuNPs會(huì)抑制硝化過程的厭氧氨氧化活性［10］；CuONPs能阻礙一些硝化或反硝化細(xì)菌的生物活性及代謝過程［11］；ZnONPs通過影響污泥中硝化細(xì)菌的生物活性進(jìn)而抑制硝化過程等［12］。此外，Gatti作為ENPs毒理學(xué)領(lǐng)域研究的首發(fā)者，也揭示了ENPs會(huì)對(duì)人類生命健康造成威脅［13］。因此，明確ENPs對(duì)生物的毒害作用尤為重要。

目前降低ENPs毒害作用的研究主要集中在抑制金屬納米顆粒的釋放以及提高細(xì)菌的抗性方面，通過包裹顆粒［14］、添加硫化物［15］、加入配體［16］或上調(diào)細(xì)菌糖代謝途徑［17］來達(dá)到降低毒害作用，但脫氮細(xì)菌如何降低ENPs的毒害作用及解毒方式缺乏系統(tǒng)性研究。此論文為進(jìn)一步研究ENPs在水環(huán)境毒害作用提供參考，并為提高生物脫氮處理工藝提供理論支撐。

1 環(huán)境中納米顆粒的來源

環(huán)境中存在大量的NPs，源于自然及人為活動(dòng)，自然存在的NPs包括黏土、多糖、肽聚糖等，生物對(duì)自然存在的NPs有較強(qiáng)的適應(yīng)性，且目前關(guān)于天然納米顆粒在脫氮過程中的相關(guān)影響未見報(bào)道；人為來源的NPs即ENPs主要是指在人類活動(dòng)中所產(chǎn)生的NPs如納米Cu、Ag和ZnO等［18］。與天然NPs相比，ENPs使用更廣、生產(chǎn)量更大，由此產(chǎn)生的環(huán)境危害更嚴(yán)重。

此外，ENPs可在水、土壤與空氣中進(jìn)行交換和轉(zhuǎn)移，例如汽車及工廠排放的廢氣含有ENPs，與空氣中的微小顆粒發(fā)生吸附包裹，伴隨降雨進(jìn)入土壤，隨后滲入土壤進(jìn)而影響地下水或飲用水源，最后危及人類健康。圖1概括了ENPs在環(huán)境中的存在及轉(zhuǎn)移方式，目前，ENPs主要通過3個(gè)途徑進(jìn)入水環(huán)境中：（1）通過工業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水、生活污水等大量排放到污水處理系統(tǒng)，隨后進(jìn)入水環(huán)境；（2）由于地表垃圾堆積和土壤垃圾填埋所產(chǎn)生的垃圾滲濾液，通過地表與地下徑流進(jìn)入水環(huán)境；（3）通過汽車尾氣及工業(yè)燃燒排放進(jìn)入到大氣，隨著降雨或薄霧流進(jìn)入水環(huán)境［19］。進(jìn)入水體的ENPs會(huì)對(duì)水生植物或微生物的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生潛在的破壞作用，而污水處理收集管網(wǎng)作為ENPs進(jìn)入環(huán)境的重要環(huán)節(jié)，迫切需要對(duì)ENPs在水處理系統(tǒng)的毒害作用進(jìn)行系統(tǒng)分析及安全性評(píng)價(jià)。

圖1 納米粒子在環(huán)境中的存在和轉(zhuǎn)移方式Fig. 1 Existence and transfer of nanoparticles in the environment

2 工程納米顆粒對(duì)水處理系統(tǒng)的影響研究

隨著科技發(fā)展，ENPs對(duì)水處理系統(tǒng)的影響研究已取得一定的進(jìn)展，主要集中于ENPs對(duì)活性污泥系統(tǒng)與生物膜廢水處理系統(tǒng)的影響，其中對(duì)脫氮除磷與化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）的去除及水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化方面的探究較廣泛。大多數(shù)ENPs都對(duì)廢水處理過程存在一定的阻礙作用，其抑制程度與ENPs的濃度及暴露時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，如Gu等［20］在研究絮凝污泥和顆粒污泥對(duì)AgNPs的去除效果中發(fā)現(xiàn)，該ENPs會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）并破壞細(xì)胞膜進(jìn)而抑制生物脫氮過程，具體表現(xiàn)為：在短時(shí)間內(nèi)（12 h）分別添加1、10、50和100 mg/L AgNPs會(huì)使絮凝污泥的氨氧化率降低21.0%-24.9%。同樣，在Yuan等［21］的研究中，5 mg/L AgNPs會(huì)減小活性污泥的絮凝物尺寸，改變生物膜與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低COD和磷的去除效率，但在持續(xù)暴露下會(huì)趨向穩(wěn)定。與之類似，如Zhang等［22］研究AgNPs對(duì)生物膜活性和脫氮的效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.1 mg/L的AgNPs不會(huì)顯著抑制生物膜的活性，其可能原因?yàn)榈蜐舛鹊腁gNPs可通過生物膜吸附或者沉淀作用降低毒性，而當(dāng)AgNPs的濃度增加至5 mg/L時(shí)，細(xì)胞的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）濃度會(huì)明顯增加，導(dǎo)致膜污染進(jìn)而抑制生物膜活性。以上結(jié)果表明AgNPs的抑制程度與自身的濃度及暴露時(shí)間相關(guān)。此類情況在其它納米顆粒的研究中也有體現(xiàn)，如Zheng等［23-24］在研究SiO2NPs對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響發(fā)現(xiàn)，添加1 mg/L的SiO2NPs對(duì)短期和長期系統(tǒng)的脫氮效率均沒有顯著抑制作用，但當(dāng)SiO2NPs濃度增加至50 mg/L并暴露70 d后，總氮的去除率從79.6%降至51.6%；而ZnONPs存在條件下，添加10和50 mg/L的ZnONPs于脫氮除磷活性污泥系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，與不存在ZnONPs時(shí)總氮去除率（81.5%）相比，4.5 h后總氮的去除率分別降至75.6%和70.8%，相應(yīng)的出水磷濃度從0 mg/L分別增加至10.3和16.5 mg/L，可能是污泥對(duì)其具有聚磷作用，加入ENPs可能會(huì)使其從污泥中釋放出來，高于進(jìn)水中磷的濃度（9.8 mg/L），這表明較高濃度的ZnONPs能同時(shí)抑制氮和磷的去除。Ni等［25］研究發(fā)現(xiàn)，向活性污泥系統(tǒng)添加1 mg/L的ZnONPs，10 h后氨氮去除率從100%降為87%。Tan等［26］研究ZnONPs對(duì)MBR系統(tǒng)性能的長期影響及其在系統(tǒng)中的去除行為時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZnONPs濃度為10.0 mg/L時(shí)，污泥絮凝物尺寸減小，沉降性較差，引起COD、氮和磷的去除率下降，其原因是納米粒子吸附到生物膜上使其功能受損。盡管對(duì)于ENPs在廢水處理方面已經(jīng)有了大量探究，但主要集中在活性污泥中開展，而活性污泥是一個(gè)比較復(fù)雜的系統(tǒng)，對(duì)ENPs具有吸附和沉淀作用，且存在著多種污染物，會(huì)影響對(duì)ENPs毒害強(qiáng)度的評(píng)估。所以，采用活性污泥作為研究對(duì)象很難準(zhǔn)確地反應(yīng)ENPs對(duì)硝化與反硝化過程的影響。

3 工程納米顆粒對(duì)微生物脫氮過程的毒害效應(yīng)

3.1 工程納米顆粒對(duì)微生物硝化過程的毒害作用

硝化過程是指微生物在氨單加氧酶（Amo）、羥胺氧化還原酶（Hao）和亞硝酸鹽氧化還原酶（Nxr）的作用下將銨鹽（NH4+）逐步氧化為硝酸鹽（NO3-）的過程，分為氨氧化（NH4+-NO2-）和亞硝酸鹽氧化（NO2--NO3-）兩個(gè)階段，分別由氨氧化微生物和亞硝化鹽氧化菌完成，氨氧化微生物又包括氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌，古菌的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了氨氧化細(xì)菌不是唯一的氨氧化微生物［27］。催化氨氧化過程的Amo是由3種不同亞基構(gòu)成的三聚體膜結(jié)合蛋白，只能催化非離子氨（NH3）的氧化，而不能催化NH4+的氧化，這是Amo限速氨氧化過程的主要原因［28］；亞硝酸鹽氧化需要在亞硝酸鹽氧化還原酶的催化作用下進(jìn)行，Nxr由Nxr A、Nxr B和Nxr C三個(gè)不同亞基構(gòu)成，可催化亞硝酸鹽的氧化及硝酸鹽的還原，可誘導(dǎo)細(xì)菌完成不同的代謝途徑，具有多樣功能［29］。隨著對(duì)脫氮過程的深入研究，近年來全程氨氧化微生物（一種可同時(shí)進(jìn)行氨氧化和亞硝酸鹽氧化的微生物）［30］的發(fā)現(xiàn)打破了硝化階段分兩步反應(yīng)的結(jié)論，且細(xì)菌和硝化古菌均可以進(jìn)行硝化過程。

目前報(bào)道的ENPs對(duì)硝化過程的影響，主要集中于硝化細(xì)菌介導(dǎo)的硝化途徑，而對(duì)于硝化古菌、全程氨氧化微生物的影響未見報(bào)道，其毒害作用主要概括為兩方面：一是通過銨鹽或羥胺的去除效率來反映ENPs對(duì)硝化過程的抑制，且抑制程度與顆粒濃度、種類、大小及時(shí)間有關(guān)，通常來說，納米顆粒比表面積越大、濃度越高、暴露時(shí)間越長、對(duì)硝化作用抑制程度越高；第二方面是通過影響硝化菌來反映ENPs對(duì)硝化過程的毒害。參與硝化過程的氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）較敏感，與亞硝化細(xì)菌（NOB）相比，更易受到ENPs的抑制，致使豐度下降，且ENPs的存在會(huì)使類核仁解體并聚集在細(xì)胞膜附近進(jìn)而破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，甚至造成細(xì)胞畸形［31］；從酶活性檢測可知，ENPs能抑制Amo、Hao、Nxr酶活；在基因表達(dá)方面，也會(huì)抑制與硝化相關(guān)的基因例如AmoA1、AmoC2表達(dá)；再者，通過抑制硝化細(xì)菌蛋白質(zhì)的功能進(jìn)而影響菌體內(nèi)物質(zhì)合成、能量產(chǎn)生、電子傳遞等［32-33］。綜上，ENPs就是通過抑制銨鹽或羥胺去除、破壞硝化細(xì)菌、降低硝化相關(guān)基因表達(dá)來抑制硝化過程的。雖然研究表明了ENPs會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌酶活、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能有一定的抑制作用，但是具體的抑制途徑及機(jī)理并未明確，未來還有待研究。

3.2 納米顆粒對(duì)微生物反硝化過程的毒害作用

反硝化過程作為氮循環(huán)的重要組成部分，對(duì)硝酸鹽從陸地和水生環(huán)境返回大氣具有重要意義，其主要過程包括硝酸鹽（NO3-）還原為亞硝酸鹽（NO2-），再通過亞硝酸鹽還原為一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N2O）、二氧化氮（NO2）氣體和氮?dú)猓∟2），參與此過程的重要酶包括硝酸還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）和一氧化二氮還原酶（Nos），這些酶分別由基因NarA及NarG、NirS及NirK、NorB及NorC、Nos編碼［34］。

目前對(duì)于ENPs在反硝化過程中的毒害機(jī)制具體分析已有大量的研究報(bào)道，與硝化過程抑制作用類似，根據(jù)去除率的降低以及反硝化細(xì)菌的損傷來反映ENPs對(duì)反硝化過程的毒害程度。首先，由于ENPs的大小、種類、比表面積等本身的性質(zhì)會(huì)延遲硝酸鹽還原過程以及增加亞硝酸鹽的積累量，導(dǎo)致硝酸鹽或亞硝酸鹽的去除率降低［35］，ENPs通過與反硝化細(xì)菌接觸產(chǎn)生活性氧、釋放游離金屬離子，破壞膜蛋白使乳酸脫氫酶滲漏并進(jìn)一步阻礙電子傳遞呼吸鏈、電子轉(zhuǎn)移和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，關(guān)鍵電子轉(zhuǎn)移蛋白包括NADH脫氫酶的活性和細(xì)胞色素的表達(dá)都會(huì)受到抑制，從而改變反硝化細(xì)菌的生長和代謝［36-37］；除此之外，在ENPs的作用下，與反硝化作用直接相關(guān)的重要基因如NarI、NarP、NapD表達(dá)均下調(diào)，參與葡萄糖降解的葡萄糖激酶和醛縮酶的酶活、硝酸還原酶（Nar）和亞硝酸還原酶（Nir）的活性均下降［38-39］。由此可知，與之相關(guān)的抑制機(jī)理除了納米顆粒本身的性質(zhì)外，還與反硝化細(xì)菌接觸有關(guān)，通過這些方式來破壞反硝化細(xì)菌進(jìn)而抑制反硝化途徑（表1）。

綜上，ENPs對(duì)硝化和反硝化過程的毒害作用主要概括為：（1）抑制脫氮菌的酶活性，包括硝化過程的Amo、Hao和Nxr及反硝化過程的Nar、Nir、Nor和Nos酶活性，抑制酶活使脫氮效率降低；（2）破壞硝化或反硝化細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及膜蛋白，阻礙生物脫氮過程；（3）抑制基因表達(dá)，包括硝化過程的AmoA1、AmoC2基因及反硝化過程的NarI、NarP和NapD基因等，進(jìn)而延緩或抑制脫氮作用；（4）抑制硝化或反硝化細(xì)菌蛋白質(zhì)的功能進(jìn)而影響菌體內(nèi)物質(zhì)合成、能量產(chǎn)生和電子傳遞。通過以上幾方面來抑制脫氮過程。故探明ENPs對(duì)脫氮過程造成的風(fēng)險(xiǎn)，更有利于采取合適措施減小其毒害作用。

表 1 工程納米顆粒對(duì)脫氮過程的毒害作用Table 1 Toxic effects of engineered nanoparticles on the nitrogen-removing process

3.3 工程納米顆粒對(duì)脫氮微生物的毒性機(jī)制及影響

充分了解ENPs在廢水處理系統(tǒng)及脫氮微生物的毒害機(jī)制對(duì)減緩ENPs在脫氮微生物的毒害作用和提高廢水處理效率十分重要。目前ENPs在微生物毒害機(jī)制方面已有大量研究，主要概括為兩方面：（1）根據(jù)ENPs自身的性質(zhì)（如尺寸、形狀和表面電荷等）產(chǎn)生的毒害；（2）通過納米顆粒與微生物的相互作用而產(chǎn)生毒害。造成的影響主要包括細(xì)菌群落的豐度及結(jié)構(gòu)被破壞；單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的物質(zhì)被破壞。

據(jù)報(bào)道，粒徑越小的納米顆粒，比表面積越大，其表面的原子、分子和活性基團(tuán)的數(shù)量越多，更易聚集并增強(qiáng)反應(yīng)活性，導(dǎo)致更多的金屬離子釋放，所以對(duì)生物脫氮菌的毒性越強(qiáng)［41-42］。此外，納米顆粒的表面特征如表面電荷是導(dǎo)致納米毒性的另一個(gè)因素，因?yàn)閹щ姾傻牧Ｗ幽芡ㄟ^靜電作用與硝化菌接觸，降低硝化菌膜電位及還原酶活性，進(jìn)而抑制脫氮過程［43］。

除了自身性質(zhì)，ENPs毒害作用還可通過與細(xì)菌接觸產(chǎn)生，如圖2所示，主要體現(xiàn)在：（1）ENPs附著到細(xì)胞表面。金屬納米能吸附到EPS上，當(dāng)ENPs聚集在EPS中時(shí)，會(huì)減少EPS的含量并破壞其結(jié)構(gòu)，可降低微生物群落的豐度和破壞群落結(jié)構(gòu)［45］。此外，部分ENPs還會(huì)附著到細(xì)胞膜上，而細(xì)胞膜是控制物質(zhì)自由進(jìn)入胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，其上含有多種酶，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞代謝或維持穩(wěn)態(tài)都起著非常重要的作用，且膜上也含有一些基團(tuán)，如磷酸根、羥基、含硫基團(tuán)，這些是可以供ENPs結(jié)合的位點(diǎn)［46］。故細(xì)胞膜常為ENPs及其釋放的金屬離子攻擊的部位，通過吸附在膜表面上，破壞一些基團(tuán)或蛋白進(jìn)而影響膜的完整性，如ZnONPs能夠阻斷大腸桿菌膜中的磷酸二酯鍵進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)［47］，還會(huì)與呼吸鏈上的蛋白結(jié)合，進(jìn)而干擾細(xì)菌呼吸過程，使細(xì)菌脫氮能力減弱［48-49］。此外，一些具有還原性的納米顆粒如Fe0NPs，可還原分解細(xì)胞膜的一些脂多糖和蛋白質(zhì)官能團(tuán)，從而降低微生物的活性。帶有負(fù)電荷的AgNPs可與細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)菌表面產(chǎn)生小孔，納米粒子進(jìn)入胞內(nèi)與胞內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)紊亂，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不利于進(jìn)行各項(xiàng)功能的表達(dá)；（2）在ENPs的刺激下，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生活性氧，高濃度的活性氧會(huì)破壞胞內(nèi)物質(zhì)、中斷電子傳遞、降低反硝化酶活性，使代謝失衡、部分蛋白功能喪失等，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡，進(jìn)而抑制脫氮過程，降低氮污染物的去除率［50-51］。（3）ENPs金屬離子的釋放。納米顆粒暴露時(shí)間長會(huì)使大部分納米粒子團(tuán)聚體溶解，釋放出大量金屬離子，進(jìn)而產(chǎn)生毒害作用，如氧化鋅納米粒子的毒性主要源于從納米粒子上解離下來的鋅離子，這些離子可與細(xì)胞內(nèi)功能基團(tuán)或與酶代謝位點(diǎn)的金屬離子結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞失活［52］。此外，不同微生物對(duì)金屬離子的敏感度具有差異性，如在AgNPs的亞致死濃度下，與反硝化菌及固氮菌相關(guān)的基因表達(dá)沒有很顯著的差異，但調(diào)控硝化細(xì)菌硝化過程的基因表達(dá)量明顯下降［53］。綜上，通過ENPs的毒害作用，對(duì)脫氮微生物造成的危害概括如表2所示，且不同的脫氮菌對(duì)同種ENPs和同一種類細(xì)菌對(duì)不同種ENPs的敏感性不同，故探明ENPs的毒害作用及對(duì)脫氮微生物的影響有利于提高廢水脫氮效率。

表 2 工程納米顆粒對(duì)脫氮菌的影響Table 2 Influence of engineered nanoparticles on denitrification bacteria

圖2 納米顆粒毒害途徑Fig. 2 Poisoning pathway of nanoparticles［44］

4 工程納米顆粒脅迫條件下脫氮微生物的解毒機(jī)制及措施

4.1 解毒機(jī)制

近年來由于ENPs對(duì)水處理系統(tǒng)及脫氮微生物毒害的廣泛報(bào)道，有關(guān)降低ENPs毒性的探索研究也逐漸受到重視，據(jù)報(bào)道，細(xì)菌的氧化應(yīng)激機(jī)制是應(yīng)對(duì)ENPs脅迫條件下產(chǎn)生毒害的主要機(jī)制，了解細(xì)菌對(duì)ENPs的解毒機(jī)制可對(duì)采取減緩ENPs對(duì)微生物的毒害作用的具體措施提供理論依據(jù)。

目前的研究中，細(xì)菌的主要解毒機(jī)制包括：（1）基因表達(dá)的上調(diào)。Wu等［55］的研究中，在ZnONPS的刺激下，編碼亞硝酸鹽和硫酸鹽腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的基因cysN和yvg等表達(dá)上調(diào)，來應(yīng)對(duì)及減緩ENPs的毒害；（2）細(xì)菌可通過上調(diào)蛋白表達(dá)及糖代謝來減緩毒害作用，如Ma等［17］利用蛋白質(zhì)組分析了好氧反硝化菌株HNR對(duì)ZnONPs的適應(yīng)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，蛋白PhoQ、PhoP和PmrA的上調(diào)能間接誘導(dǎo)AMT上調(diào)，增加脂多糖脂質(zhì)A帶正電的L-Ara4N，增強(qiáng)了脂多糖表面的正電荷，正電荷的增加可排斥ZnONPS釋放出的Zn2+，也可通過上調(diào)淀粉、蔗糖、氨基酸和核苷酸等的代謝過程來增加EPS的產(chǎn)量，而EPS的增加可使細(xì)菌避免直接接觸ZnONPs，從而降低其毒害作用。此外，還可通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）抗性途徑的上調(diào)來抑制ZnONPs釋放Zn2+，進(jìn)一步降低其對(duì)細(xì)胞的毒害；（3）相關(guān)酶活的上調(diào)。在谷胱甘肽代謝途徑中，谷胱甘肽過氧化物酶（glycerophosphate oxidase，GPO）及主要參與解毒和氧化還原生化的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）均上調(diào)，這有助于減緩ENPs的毒害作用［59-60］。因此，細(xì)菌在ENPs脅迫條件下是可以啟動(dòng)某些應(yīng)激機(jī)制來維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，但僅靠細(xì)菌自身的調(diào)節(jié)不足以完全抵制ENPs的毒害，故應(yīng)從外界條件采取更加有效的措施進(jìn)行控制。

4.2 具體措施

針對(duì)ENPs帶來的毒害，目前報(bào)道的措施主要有：（1）通過包裹納米顆粒、添加半胱氨酸來控制ENPs釋放金屬離子；（2）添加配體、硫酸鹽物質(zhì)形成復(fù)合物或者增強(qiáng)細(xì)菌的抗逆性，抵制ENPs的毒害。研究表明：（1）可通過各種包裹技術(shù)降低AgNPs毒害作用，如Ostermeyer等［14］和Amaout等［41］分別利用蛋白質(zhì)模型牛血清蛋白（BSA）和檸檬酸鹽包裹AgENPs，阻止Ag+的釋放，進(jìn)而降低納米粒子毒性；（2）半胱氨酸可抑制ENPs金屬離子釋放，如Guo等［15］在對(duì)不同硫化物緩解孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysospotium）膜系統(tǒng)中AgNPs的毒性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸可通過抑制AgNPs中Ag+的釋放來降低金屬離子對(duì)微生物的毒害作用。然而，這些含硫化合物是否能減輕ENPs對(duì)耐冷硝化或反硝化細(xì)菌的毒害作用還有待研究。（3）通過添加配體與納米顆粒反應(yīng)形成復(fù)合物，如Okkyoung等［16］通過添加SO42-、S2-、PO4-和CI-幾種不同配體來研究減緩AgNPs對(duì)硝化菌的毒害作用時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫化物是降低AgNPs毒性的最優(yōu)的配體，是因?yàn)榱蚧镞^量時(shí)會(huì)形成AgxSy復(fù)合物，可穩(wěn)定存在于厭氧環(huán)境中的，進(jìn)而會(huì)降低AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌的毒害作用；（4）硫酸鹽能增強(qiáng)細(xì)胞活性與微生物的抗逆性，其原因?yàn)榻饘匐x子與-SH基團(tuán)有較強(qiáng)的親和力，兩者可形成穩(wěn)定的化合物從而降低金屬離子對(duì)微生物的毒害作用。例如，Huang等［61］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Pb（II）在10 mg/L-200 mg/L時(shí)，加入500 μmol/L的NaHS，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporiumd）的生物活性可提高15%-39%。無機(jī)硫化物Na2S能通過提高硫氫基蛋白含量來調(diào)節(jié)EPS組成成分，從而增強(qiáng)EPS對(duì)胞外金屬離子的吸附作用，在Na2S為20 mg/L條件下，含有-SH基團(tuán)的蛋白濃度由104.15 μmol/L增加到154.36 μmol/L，含-SH基團(tuán)的蛋白濃度可顯著提高芽孢桿菌屬對(duì)重金屬的去除效率［62］。綜上，通過施加一些物質(zhì)對(duì)抑制ENPs的毒害均有很好的效果。

5 結(jié)語

目前關(guān)于ENPs在廢水活性污泥系統(tǒng)及脫氮微生物毒害方面的報(bào)道已經(jīng)證實(shí)了ENPs毒性與其尺寸、濃度、比表面積等自身特性相關(guān)，并通過與脫氮菌接觸釋放金屬離子，脅迫細(xì)菌產(chǎn)生ROS，進(jìn)而抑制酶活和基因表達(dá)、破壞蛋白質(zhì)，最終抑制脫氮過程。在已報(bào)道的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，本文系統(tǒng)總結(jié)了環(huán)境中ENPs的來源以及進(jìn)入水環(huán)境的方式。詳細(xì)闡述了ENPs對(duì)脫氮過程的毒害作用、ENPs毒性機(jī)制和對(duì)脫氮微生物細(xì)胞的影響以及在ENPs脅迫條件下脫氮微生物的解毒機(jī)制及措施。然而，以往對(duì)廢水處理多集中于活性污泥的研究，但活性污泥系統(tǒng)比較復(fù)雜且容易吸附和沉淀ENPs，很難準(zhǔn)確地評(píng)估納米顆粒對(duì)脫氮過程的毒害程度以及毒害機(jī)理。此外，已報(bào)道的耐冷異養(yǎng)硝化與好氧反硝化菌株比較單一，相關(guān)ENPs對(duì)純培養(yǎng)耐冷硝化與反硝化微生物影響的報(bào)道也較為缺乏，且未見ENPs對(duì)耐冷微生物脫氮過程及分子層面毒害的影響研究。再者，盡管環(huán)境中存在的ENPs種類多樣，但納米顆粒種類的研究多集中于ZnO、Ag和CuO等幾種常見ENPs對(duì)生物脫氮過程的毒害作用。因此，在今后的研究中可從以下幾個(gè)方面深入探索：

（1）脫氮技術(shù)在廢水處理中具有高效、低耗、綠色環(huán)保且沒有二次污染的特點(diǎn)，因此，可更新脫氮菌的分離篩選方法以獲得更高效去除無機(jī)氮且耐受ENPs的細(xì)菌。（2）低溫會(huì)顯著抑制嗜溫菌的脫氮效率，耐冷異養(yǎng)硝化與好氧反硝化微生物可提高低溫條件下的脫氮效率，目前，關(guān)于耐冷菌的報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究和開發(fā)，豐富耐冷菌的種類。（3）納米顆粒對(duì)于耐冷脫氮菌的毒害作用及相應(yīng)的減毒措施在分子層面上的機(jī)理有待深入研究。（4）環(huán)境中存在的納米顆粒種類豐富，而對(duì)影響生物脫氮過程的納米顆粒種類研究較為單一，今后可著手于多種類、多濃度、多用途的納米顆粒探索。（5）對(duì)于減緩ENPs對(duì)脫氮菌毒害作用的措施，可從分析環(huán)境因素著手，探索更高效的解毒措施。