葉鵬林 Kwasi Kyere-Yeboah 高惡斌

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212000）

隨著煤炭、石油等化石燃料的大量消耗，引起了一系列問(wèn)題［1］。一方面，化石燃料的大量燃燒造成了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，如酸雨、溫室效應(yīng)等［2］；另一方面，化石燃料作為不可再生資源，面臨著能源枯竭的問(wèn)題［3］。因此，可再生生物燃料的開(kāi)發(fā)引起了全世界的關(guān)注［4］。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用藍(lán)藻作為光合微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)各種化學(xué)燃料，吸引了越來(lái)越多學(xué)者的興趣［5］。其中乙醇作為重要的化工產(chǎn)品與清潔能源，通過(guò)在藍(lán)藻中引入外源合成途徑，雖被多次成功合成，然而產(chǎn)量卻并不樂(lè)觀［5］。

先前的研究表明，合成過(guò)程中啟動(dòng)子的選擇對(duì)所合成的化合物產(chǎn)量有重大影響［6］。為進(jìn)一步探究啟動(dòng)子對(duì)工程集胞藻中乙醇合成的影響，并實(shí)現(xiàn)乙醇的高效合成。在本研究中首先選用來(lái)自運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）和來(lái)自大腸桿菌的NADPH依賴型醛還原酶基因（yqhD）于集胞藻PCC 6803的slr0168位點(diǎn)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)以丙酮酸為合成前體，乙醇的生物合成（圖1）。

圖1 集胞藻PCC 6803的乙醇合成路線Fig.1 Ethanol synthesis route in Synechocystis sp. PCC 6803

在啟動(dòng)子的選擇上，本實(shí)驗(yàn)主要探究?jī)蓚€(gè)啟動(dòng)子對(duì)乙醇合成的影響。一是銅離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子PpetE，它被認(rèn)為是一種強(qiáng)度中等的啟動(dòng)子［6］。其表達(dá)受到銅離子濃度調(diào)節(jié)，已證明當(dāng)銅離子濃度大于6 nmol/L時(shí)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)［7］。另一種超強(qiáng)啟動(dòng)子Pcpc560是一種光強(qiáng)啟動(dòng)子，Pcpc560受到光照驅(qū)動(dòng)表達(dá)。Pcpc560含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，已證明可以提高功能蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)［8］。通過(guò)PpetE和Pcpc560兩個(gè)啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)外源pdc，yqhD基因表達(dá)，根據(jù)基因表達(dá)效果以及對(duì)乙醇產(chǎn)量的比較，從而具體了解啟動(dòng)子對(duì)乙醇合成的影響，實(shí)現(xiàn)集胞藻PCC 6803中乙醇的高效合成。

1 材料與方法

1.1 材料

利用大腸桿菌DH5α構(gòu)建質(zhì)粒。將不同抗性的大腸桿菌菌株分別在含有相應(yīng)抗生素的液體以及含有1.5% 瓊脂的固體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。野生型集胞藻PCC 6803和工程菌株在液體BG11培養(yǎng)基或含有1.5% 瓊脂的瓊脂平板上生長(zhǎng)。利用限制性內(nèi)切酶（NEB北京）構(gòu)建質(zhì)粒。除特別指出，所有試劑與材料均來(lái)自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)條件 大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃。除優(yōu)化培養(yǎng)外，工程藍(lán)藻于BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行光自養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30℃，光強(qiáng)為100 μE/m2/s［9］。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)造 以pMD18-T為簡(jiǎn)單載體（上海生工）構(gòu)建質(zhì)粒。利用PCR擴(kuò)增片段，將擴(kuò)增的片段與載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，T4連接酶（NEB 北京）連接來(lái)構(gòu)建新的目標(biāo)質(zhì)粒。通過(guò)在pMD18-T簡(jiǎn)單載體上擴(kuò)增并克隆slr0168基因上游600 bp片段，壯觀霉素（SpR）基因片段，和slr0168基因下游600 bp片段組成slr0168基因敲除暗盒，獲得質(zhì)粒pBE406。利用集胞藻PCC 6803基因組為模板擴(kuò)增slr0168的上下游基因，以生工優(yōu)化合成的SpR序列為模板，擴(kuò)增SpR基因。通過(guò)將PpetE-pdc-yqhD基因片段和TrbcL終止子擴(kuò)增并克隆到質(zhì)粒pBE406上，構(gòu)建質(zhì)粒pBE01。啟動(dòng)子PpetE和終止子TrbcL以集胞藻PCC 6803基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以生工優(yōu)化合成的核苷酸序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增pdc、yqhD基因。將PpetE啟動(dòng)子換成Pcpc560啟動(dòng)子構(gòu)建了質(zhì)粒pBE02。具體方法如表1所示，生工合成的引物序列如表2所示。

表1 本文使用的質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本文使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 集胞藻PCC 6803的轉(zhuǎn)化 按之前文獻(xiàn)所述的方法［9］，具體來(lái)說(shuō)，在藻細(xì)胞生長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)階段后，用新鮮的BG11培養(yǎng)基收集細(xì)胞，并將質(zhì)粒與新鮮的藻細(xì)胞混合?；旌衔镌?0℃下恒定光照孵育5 h，并定期搖動(dòng)。然后吸取混合物轉(zhuǎn)移至BG11固體培養(yǎng)基上的無(wú)菌核孔膜（Whatman）上，并在30℃下恒定光照孵育24 h。孵育24 h后，將無(wú)菌核孔膜轉(zhuǎn)移到帶有相應(yīng)抗性的固體BG11培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)相應(yīng)的單菌落。單菌落在逐步增加抗生素濃度的新的固體BG11培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)染色體分離，并在液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)進(jìn)行分析。

1.2.4 HPLC分析 在乙醇分析試驗(yàn)中，所有改造菌株保持初始OD730=0.1，在新鮮BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SYN01的BG11培養(yǎng)基含有50 nmol/L的銅離子，誘導(dǎo)PpetE的表達(dá)。利用高效液相色譜儀（HPLC）（AgilentTechnologies1200系列）進(jìn)行乙醇產(chǎn)量檢測(cè)。高效液相色譜系統(tǒng)配備了示差檢測(cè)器（RID），使用BioradAminex HPX-87H柱（300 mm×7.8 mm）。設(shè)置溫度條件為50℃，以0.6 mL/min的流速使用0.5 mmol/L的H2SO4進(jìn)行洗脫。HPLC實(shí)驗(yàn)中所使用的流動(dòng)相為0.5 mmol/L的硫酸溶液，固定相為聚苯乙烯二乙烯苯樹(shù)脂。

定期取1 mL藻細(xì)胞培養(yǎng)物在10 000 ×g條件下離心2 min（MRK MG1450），用0.22 μm（Sigma-Aldrich）的特殊濾膜過(guò)濾離心得到的上清液。過(guò)濾后的上清液直接用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行乙醇產(chǎn)量分析；過(guò)濾后獲得的沉淀進(jìn)行細(xì)胞破碎后利用無(wú)菌水洗滌并離心，保留上清液，繼續(xù)過(guò)濾進(jìn)行乙醇產(chǎn)量分析。最后的乙醇產(chǎn)量為工程藍(lán)藻上清液與沉淀所測(cè)的數(shù)值之和。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析 將藻細(xì)胞培養(yǎng)物（30mL，OD730≈0.6）于3 500×g（BIORIDGETGL-16M，上海，中國(guó)）條件下離心15 min，保留沉淀。保留的沉淀用于提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析［9］。用2-△△CT的計(jì)算方法可以估計(jì)不同mRNA分子的相對(duì)表達(dá)水平；△CT值越高，對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平越低［10］。本實(shí)驗(yàn)選擇編碼16SrRNA的內(nèi)源基因作為內(nèi)參基因。

1.2.6 優(yōu)化培養(yǎng) 在設(shè)置光強(qiáng)為100 μE/m2/s的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)體系中分別通入5% CO2+95% 空氣與100% 空氣分別對(duì)兩種菌株進(jìn)行曝氣培養(yǎng)。

1.2.7 PCR分析 選擇編碼16SrRNA的內(nèi)源基因作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證基因組DNA提取的正確性。通過(guò)采用整合基因引物與整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)引物相結(jié)合進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，以驗(yàn)證整合基因是否完整，整合基因位置是否正確以及原始基因是否完全消除。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 差異顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析，比較兩組間差異用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)。采用origin 9.0作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［11］。

2 結(jié)果

2.1 工程藻株的成功構(gòu)建

將質(zhì)粒pBE01、pBE02分別轉(zhuǎn)入野生型集胞藻PCC 6803中。pBE01中slr0168上下游片段間的PpetE-SpR-pdc-yqhD-TrbcL經(jīng)同源重組整合到集胞藻PCC 6803中slr0168基因位點(diǎn)上。通過(guò)抗性篩選，將含有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)并驗(yàn)證。菌株構(gòu)建與驗(yàn)證具體如圖2所示，以提取的轉(zhuǎn)化子和野生型集胞藻基因組DNA為模板分別擴(kuò)增編碼16S rRNA的內(nèi)源基因，結(jié)果均呈陽(yáng)性（600 bp）。以提取的轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，通過(guò)PCR整合擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出符合整合基因預(yù)期大小的條帶（3.6 kb，2.9 kb，2 kb）。而以提取的野生型集胞藻PCC 6803基因組DNA為模板，均無(wú)法擴(kuò)增。經(jīng)PCR分析，擴(kuò)增片段大小正確的轉(zhuǎn)化子即為成功轉(zhuǎn)化的菌株SYN01。同理，pBE02中slr0168上下游片段間的Pcpc560-SpR-pdc-yqhD-TrbcL經(jīng)同源重組整合到集胞藻PCC 6803中slr0168基因位點(diǎn)上（圖3），驗(yàn)證大小正確（3.9 kb，2.9 kb，2 kb）的轉(zhuǎn)化子為成功轉(zhuǎn)化的菌株SYN02。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子送生工測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 SYN01菌株的構(gòu)建示意圖與PCR分析Fig.2 Construction diagram and PCR analysis of the SYN01 strain

圖3 SYN02菌株的構(gòu)建示意圖與PCR分析Fig.3 Construction diagram and PCR analysis of the SYN02 strain

2.2 乙醇合成基因的表達(dá)

從SYN01和SYN02中提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析，以確定SYN01和SYN02中乙醇合成基因的表達(dá)水平。用2-△△CT計(jì)算方法估計(jì)不同mRNA分子的相對(duì)表達(dá)程度（表3）。數(shù)據(jù)表明，與SYN01菌株相比，SYN02菌株的pdc和yqhD基因表達(dá)增加了2.55倍和2.31倍（圖4）。

圖4 外源乙醇合成基因的表達(dá)情況Fig.4 Expressions of exogenous ethanol-producing genes

表3 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的結(jié)果Table 3 Reverse transcription of quantitative PCR results

2.3 光自養(yǎng)條件下乙醇的合成

在乙醇測(cè)定試驗(yàn)中，野生型PCC 6803在14 d培養(yǎng)周期內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生任何乙醇。根據(jù)光自養(yǎng)條件下的乙醇生產(chǎn)曲線所示（圖5-圖6），菌株SYN01與SYN02均成功合成乙醇。在14 d的培養(yǎng)周期內(nèi)其乙醇合成產(chǎn)量均逐步上升，且SYN02的乙醇合成產(chǎn)量一直領(lǐng)先于SYN01。根據(jù)3次平行實(shí)驗(yàn)，同樣在光自養(yǎng)的第14天，SYN01合成的乙醇產(chǎn)量為389 mg/L（OD730≈1.12），而SYN02的乙醇合成產(chǎn)量為591.7 mg/L（OD730≈1.08）。因此，在相同的14 d培養(yǎng)周期內(nèi)，菌株SYN02的乙醇產(chǎn)量約為菌株SYN01的1.5倍。

圖5 乙醇的液相色譜檢測(cè)Fig.5 HPLC detection of ethanol

圖6 乙醇的生產(chǎn)情況Fig.6 Production of ethanol under the autotrophic conditions

2.4 光自養(yǎng)條件下突變株之間的生長(zhǎng)比較

在光自養(yǎng)過(guò)程中，觀察了兩株工程菌株SYN01和SYN02的生長(zhǎng)狀態(tài)，繪制了周期為14 d內(nèi)的生長(zhǎng)曲線并與野生型集胞藻PCC 6803的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行比較。在恒定光照條件下，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，構(gòu)建的菌株在遺傳上是穩(wěn)定的。生長(zhǎng)比較顯示（圖7），在光自養(yǎng)14 d的周期內(nèi)，基于OD730測(cè)量的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異（P＞0.05），兩株產(chǎn)乙醇的突變體生長(zhǎng)正常，外源產(chǎn)乙醇基因的導(dǎo)入與乙醇的合成并沒(méi)有對(duì)集胞藻PCC 6803細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響。

圖7 自養(yǎng)條件下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth condition of the strain under the autotrophic conditions

2.5 優(yōu)化培養(yǎng)下的藻株的生長(zhǎng)與乙醇合成情況

在優(yōu)化培養(yǎng)條件下觀察藻株生長(zhǎng)情況并記錄乙醇產(chǎn)量。結(jié)果如圖8所示，向培養(yǎng)體系中，通入5%CO2（實(shí)線）相較于只通空氣（虛線）更有助于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)且藻細(xì)胞繁殖速度更快。如圖9所示，根據(jù)乙醇合成情況，繪制了優(yōu)化培養(yǎng)下的乙醇合成曲線。結(jié)果顯示，隨著藻細(xì)胞密度的增大，乙醇產(chǎn)量相對(duì)于光自養(yǎng)情況下并沒(méi)有顯著升高，最高產(chǎn)量仍保持在600 mg/L左右，且通空氣與通5% CO2+95%空氣最終乙醇合成產(chǎn)量結(jié)果相近，說(shuō)明在僅僅優(yōu)化啟動(dòng)子的情況下，突變株乙醇的合成可能已經(jīng)達(dá)到了上限。

圖8 優(yōu)化培養(yǎng)下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth condition of the strains under the optimized culture

圖9 優(yōu)化培養(yǎng)下菌株的乙醇生產(chǎn)情況Fig.9 Ethanol production of the strains under the optimized culture

3 討論

為了使光合藍(lán)藻盡可能的合成所需的化合物，大多數(shù)生物合成途徑都是以中間代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A或丙酮酸為初始前體進(jìn)行設(shè)計(jì)［12］。這些代謝物在藍(lán)藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中常常被生理性活動(dòng)的內(nèi)源性途徑所消耗（例如氨基酸合成、脂肪酸合成、TCA循環(huán)）［13］。因此，藍(lán)藻中乙醇合成前體的含量大小可能是決定乙醇生產(chǎn)的重要因素。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，以乙酰輔酶A作為乙醇合成的前體，是一種效率較低的方案［12，14］。與乙酰輔酶A相比，丙酮酸作為糖酵解途徑產(chǎn)生的中間代謝物，在藍(lán)藻碳代謝途徑中占據(jù)中心位置，與CO2中心固定點(diǎn)僅僅距離4個(gè)反應(yīng)［15］。因此，我們認(rèn)為以丙酮酸作為代謝前體的生物合成途徑將更有效地合成乙醇。

基于丙酮酸為合成前體合成生物乙醇，丙酮酸脫羧酶和醛還原酶的組合是最簡(jiǎn)便的方案。來(lái)自于運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）普遍應(yīng)用于催化丙酮酸的脫羧，生成乙醛和CO2［16］。因此在本研究中，繼續(xù)選擇來(lái)自運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶催化內(nèi)源性丙酮酸，轉(zhuǎn)化生成乙醛。通過(guò)選擇醛還原酶，脫羧生成的乙醛在醛還原酶和 NAD（P）H 為輔酶催化下，生成目標(biāo)乙醇。目前研究普遍認(rèn)為藍(lán)藻的NADPH/NADP池大于其NADH/NAD池，除此之外NADPH/NADP比值高于NADH/NAD比值［17］。大量的實(shí)驗(yàn)例證，引入的“發(fā)酵反應(yīng)”與NADPH聯(lián)系，是增加藍(lán)藻生成產(chǎn)物的驅(qū)動(dòng)力的有效途徑［15，18］。因此選用NADPH依賴型醛還原酶被認(rèn)為比選擇NADH依賴型醛還原酶能更有效率地合成乙醇。通過(guò)對(duì)各種NADPH依賴型醛還原酶的篩選，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自大腸桿菌的醛還原酶yqhD相對(duì)于其他NADPH醛還原酶如slr1192，slr0942等具有更高的催化活性［18］。因此組合表達(dá)來(lái)自運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶和來(lái)自大腸桿菌的NADPH依賴型醛還原酶，能更好地合成乙醇。

過(guò)去多個(gè)啟動(dòng)子用來(lái)驅(qū)動(dòng)外源乙醇合成基因，如PsbA［19］、Prbc［9］和NblA［20］。啟動(dòng)子的選擇對(duì)外源基因的表達(dá)水平至關(guān)重要。首先選擇Cu2+誘導(dǎo)啟動(dòng)子PpetE驅(qū)動(dòng)乙醇合成基因。根據(jù)以往的研究，Cu2+誘導(dǎo)啟動(dòng)子PpetE的強(qiáng)度被歸類為“中等”［6］。中等啟動(dòng)子誘導(dǎo)的乙醇合成基因的低表達(dá)可能導(dǎo)致生物乙醇的低產(chǎn)率。另一方面，高濃度的金屬離子可能導(dǎo)致關(guān)鍵酶活性的降低［21］。為了促進(jìn)外源基因的表達(dá)，采用光敏超強(qiáng)啟動(dòng)子Pcpc560來(lái)排除SYN02菌株中這些可能的不良影響［22］。RT-qPCR分析表明，與SYN01菌株相比，SYN02菌株的pdc和yqhD基因表達(dá)增加了2.55倍和2.31倍。同時(shí)SYN02的乙醇產(chǎn)量約為SYN01的1.5倍，而SYN02和SYN01的唯一區(qū)別是啟動(dòng)子。結(jié)合以上的結(jié)果，強(qiáng)啟動(dòng)子促進(jìn)了乙醇合成基因的表達(dá)，并促進(jìn)乙醇合成。因此，使用天然超強(qiáng)啟動(dòng)子Pcpc560來(lái)驅(qū)動(dòng)外源乙醇合成基因是一個(gè)更好的選擇。

考慮到工程菌株中乙醇的合成同時(shí)受到光照與營(yíng)養(yǎng)條件的影響。研究證明在光照條件為100 μE/m2/s時(shí)，集胞藻PCC 6803的生長(zhǎng)條件最佳且完全驅(qū)動(dòng)Pcpc560啟動(dòng)子的表達(dá)［23-24］。因此在設(shè)置光照條件為100 μE/m2/s的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行曝氣優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中合成的乙醇與光自養(yǎng)檢測(cè)的乙醇產(chǎn)量相比沒(méi)有明顯的變化，且不同的優(yōu)化方式最后獲得的乙醇產(chǎn)量接近。這很可能是由于改造菌株的乙醇合成達(dá)到了上限。因此，為了利用集胞藻PCC 6803合成更高產(chǎn)量的乙醇，需在高效選擇啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化合成方法。例如，在集胞藻PCC 6803中，通過(guò)過(guò)表達(dá)乙醇合成基因同時(shí)阻止儲(chǔ)存聚合物（糖原和PHB）的產(chǎn)生來(lái)增加PCC 6803中合成的生物乙醇產(chǎn)量［25］。在以強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源乙醇合成基因的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，可以在未來(lái)更高效地合成乙醇。

4 結(jié)論

在集胞藻乙醇生物合成過(guò)程中，超強(qiáng)啟動(dòng)子Pcpc560的選擇可以促進(jìn)乙醇的合成。同時(shí)外源乙醇合成基因的引入對(duì)集胞藻的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，合成過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇并沒(méi)有對(duì)集胞藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制。