關(guān)怡 李新 王定一 杜茜 張龍斌 葉秀云

（1. 福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點實驗室，福州 350108；2. 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福州 350007；3. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是當(dāng)前世界上研究和應(yīng)用最廣泛的生防真菌之一，已被開發(fā)成為多種制劑用于農(nóng)林害蟲的生物防治［1-2］。作為典型的絲狀昆蟲病原真菌，良好的菌絲生長狀態(tài)是保證球孢白僵菌完整、穩(wěn)定完成生活史及宿主侵染的重要前提。因此，對影響球孢白僵菌菌絲生長的功能基因研究多年來仍方興未艾。

Rho蛋白是一類小GTP酶（small GTPase），歸屬于Ras蛋白超家族（Ras superfamily），在細(xì)胞中作為保守的分子開關(guān)，被證明調(diào)控多種細(xì)胞活動［3-4］。在真菌中，Rho蛋白多被證明參與細(xì)胞壁合成及完整性調(diào)控、細(xì)胞極性維持以及肌動蛋白骨架重組，而這些活動與細(xì)胞的生長密切相關(guān)。在酵母和絲狀真菌中，Rho1被證明影響細(xì)胞壁完整性并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架重組從而影響酵母細(xì)胞極性生長，在黑曲霉中，RhoA缺失同樣引起菌絲極性生長缺陷［5-7］。Rho2的功能大多與其他Rho蛋白重疊。Rho3可通過與For3等蛋白結(jié)合或減少菌絲端ROS聚集從而參與調(diào)控酵母和灰葡萄孢的生長［8-9］。Rho4的N端延伸在酵母極性生長過程中發(fā)揮重要功能，并通過調(diào)節(jié)葡聚糖酶Eng1和Agn1的分泌從而調(diào)控酵母的分裂［10］；在粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉中，Rho4則通過參與肌動蛋白環(huán)的形成過程從而影響其菌絲分隔和極性生長［11-12］。Cdc42在酵母或絲狀真菌的細(xì)胞極性維持和生長過程中發(fā)揮中心調(diào)控作用［6，13］。Rac1蛋白同樣也被證明在多種絲狀真菌中調(diào)控細(xì)胞生長［14-16］。在球孢白僵菌中，同樣擁有數(shù)個Rho家族蛋白，其中Miro蛋白的功能已被解析［17］，而其余Rho家族蛋白功能仍待研究。

組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成內(nèi)容，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、表型組學(xué)、微生物組學(xué)等，旨在從整體上揭示生命活動規(guī)律，促進(jìn)對復(fù)雜生物體的整體認(rèn)識［18］。其中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法已在球孢白僵菌生防潛能研究中成熟應(yīng)用。Shao等［19］通過轉(zhuǎn)錄譜分析，闡明ΔBbRei菌株嚴(yán)重的生長缺陷可能是因為消耗更多能量用于外源性物質(zhì)降解。此外，通過對胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平分析還有助于理解球孢白僵菌中VeA、BbGlc8、BrlA和AbaA等蛋白功能缺失菌株導(dǎo)致的分生孢子減少或毒力減弱的現(xiàn)象［20-22］。

本研究關(guān)注球孢白僵菌Rho家族蛋白成員之一Bbrho5，通過同源重組方式構(gòu)建單基因敲除株ΔBbrho5及對應(yīng)回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5。通過在不同培養(yǎng)基上，以野生型菌株WT作為對照，測定菌落直徑，闡明BbRho5對球孢白僵菌菌絲生長的影響。進(jìn)一步從基因轉(zhuǎn)錄水平探討B(tài)bRho5影響的胞內(nèi)代謝通路，以豐富小GTP酶對昆蟲病原真菌生防潛能的調(diào)控作用及機(jī)理認(rèn)識，為進(jìn)一步拓展開發(fā)環(huán)保高效的微生物殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 以浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存的野生型球孢白僵菌ARSEF 2860（即野生菌株WT）、Bbrho5基因缺失菌株ΔBbrho5及回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5為實驗菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 富營養(yǎng)培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar plus yeast extract，SDAY）：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母提取物1%、瓊脂1.5%。1/4 SDAY即SDAY培養(yǎng)基配方稀釋4倍使用。

限制營養(yǎng)培養(yǎng)基（minimal czapek-dox，CZA）：蔗糖3%、NaNO30.3%、K2HPO40.05%、KCl 0.05%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、瓊脂1.5%。

1.2 方法

1.2.1Bbrho5單基因敲除及回補(bǔ)菌株的構(gòu)建 設(shè)計特異性引物（表1），從野生株基因組中擴(kuò)增各Bbrho5基因的5′和3′端同源臂Bbrho5-up（1 452bp）、Bbrho5-dn（1 329 bp），插 入 質(zhì) 粒p0380-bar，獲得敲除質(zhì)粒p0380-Bbrho5-up-bar-Bbrho5-dn。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化法將重組敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生株中，在選擇性平板上根據(jù)bar對草丁膦（200 μg/mL）的抗性篩選疑似敲除突變子，獲得單基因敲除菌株ΔBbrho5。擴(kuò)增Bbrho5基因包括側(cè)翼在內(nèi)的全長序列Bbrho5-comp（2 725 bp），插入p0380-surgateway中替換gateway片段，獲得回補(bǔ)質(zhì)粒p0380-sur-Bbrho5。將回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對應(yīng)的敲除株中，根據(jù)sur對氯嘧磺?。?0 μg/mL）的抗性篩選疑似回補(bǔ)突變子，獲得回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5。

表1 Bbrho5單基因缺失及回補(bǔ)菌株構(gòu)建引物Table 1 Primers for constructing single gene deletion mutant or complementary strains of Bbrho5

1.2.2Bbrho5單基因缺失對球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響 分別刮取野生菌株WT、敲除菌株ΔBbrho5、回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5的分生孢子懸液，分散于吐溫-80液體中，將濃度調(diào)整為1×107個/mL，懸液均勻涂布于貼有玻璃紙的SDAY平板上，在25℃和光周期12 h∶12 h條件下培養(yǎng)3 d后，用打孔器鉆取直徑5 mm的菌絲圓片，貼于SDAY、1/4 SDAY或CZA平板上，在25℃和12 h∶12 h條件下培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量各菌落直徑（cm），作為菌落生長速率的指標(biāo)。

多菌靈耐受性試驗采用貼濾紙片法，分別取100 μL野生株WT、敲除菌株ΔBbrho5及回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5的分生孢子懸液（1×106個/mL），涂布在1/4 SDAY 平板上，待溶液在平板上風(fēng)干后，在平板中央貼上直徑5 mm 的無菌濾紙片，在濾紙片上添加10 μL濃度為 0.25 μg/mL的多菌靈溶液。

生物防治能力測試方法：以大蠟螟（Galleria mellonella）幼蟲（～300 mg/只）為試蟲，將40只為一組，分別置于20 mL孢子的懸液（107個/mL）和等量0.02% 吐溫-80液中浸漬5 s，作為體壁侵染的實驗組及對照組。各菌株每個處理包含3組試蟲。接種后的幼蟲在25℃和光照∶黑暗=12 h∶12 h條件下保持8 d，每隔24 h 觀察并記錄試蟲死亡數(shù)，以計算各菌株對試蟲的半致死時間LT50（d），作為生物防治能力指標(biāo)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組樣品制備及送測 分別取WT和ΔBbrho5的分生孢子，分散于0.01% 吐溫-80溶液，用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1×107個/mL。取200 μL菌懸液均勻涂布在鋪有玻璃紙的SDAY 固體培養(yǎng)基上，置于25℃、12 h∶12 h（光照∶黑暗）條件下培養(yǎng)5 d后提取RNA。將RNA送上海美吉公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。RNA質(zhì)量的測定及定量分別由2100 Bioanalyser（安捷倫）和ND-2000（NanoDrop Technologies）完成。使用高質(zhì)量的RNA樣品（OD260/280=1.8-2.2，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S∶18S≥1.0，＞2 μg）來構(gòu)建測序文庫。

根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行RNA純化、反轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建和測序。按照來自Illumina（加利福尼亞州圣地亞哥）的TruSeqTM RNA樣品制備試劑盒使用1 μg總RNA制備RNA-seq轉(zhuǎn)錄組文庫。根據(jù)polyA選擇方法，通過oligo（dT）珠子分離mRNA，首先通過片段緩沖液進(jìn)行片段化；其次，使用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen，CA），用隨機(jī)六聚體引物（Illumina）合成雙鏈cDNA；然后根據(jù)Illumina 的文庫構(gòu)建方案對合成的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，磷酸化和A堿基添加。選擇大小為200-300 bp 大小的cDNA目標(biāo)片段，使用Phusion DNA聚合酶（NEB）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過TBS380定量后，用Illumina Novaseq 6000（2×150 bp讀長）對雙端RNA-seq測序文庫進(jìn)行測序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 為了鑒定2個不同樣品之間的DEGs，根據(jù)每百萬個外顯子、每千個堿基對的片段數(shù)（FPKM）方法，計算每個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。RSEM（http://deweylab.biostat. wisc. edu/ rsem/）用于定量基因豐度［23］。R統(tǒng)計軟件包EdgeR（http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html）用于差異表達(dá)分析［24］。此外，還進(jìn)行了功能富集分析，包括GO分析（https://github.Com/tanghaibao/Goatool） 和KEGG分 析（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php），以確定與整個轉(zhuǎn)錄組背景，在Bonferroni校正的P值≤0.05時DEGs在基因功能和代謝途徑中顯著富集情況［25］。

2 結(jié)果

2.1 Bbrho5單基因敲除及回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化法和PEG介導(dǎo)的芽孢子轉(zhuǎn)化法，成功獲得Bbrho5單基因缺失菌株ΔBbrho5及回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5陽性菌株。結(jié)果通過菌落PCR進(jìn)行驗證（圖1）。

圖1 Bbrho5敲除及回補(bǔ)菌落PCR鑒定Fig. 1 PCR verification for Bbrho5 deletion or complementary

2.2 Bbrho5單基因缺失對球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響

在富營養(yǎng)培養(yǎng)基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%。在貧瘠培養(yǎng)基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上實驗結(jié)果表明，Bbrho5缺失會引起球孢白僵菌生長速率減緩（圖2）。

圖2 野生菌株、敲除菌株和回補(bǔ)菌株的生長速率測定Fig. 2 Colony diameters of WT，Bbrho5 deletion or complementary stains

此外，Bbrho5缺失對球孢白僵菌多菌靈耐受性及生物防治能力的影響也被檢測。結(jié)果表明，不同于Bbrho5對生長的顯著影響，Bbrho5缺失菌株在多菌靈脅迫條件下，菌落生長直徑僅略微下降11%（圖3-A）。以大蠟螟幼蟲為試蟲探究Bbrho5缺失對球孢白僵菌毒力的影響，結(jié)果表明，ΔBbrho5對大蠟螟體壁侵染的致死中時LT50相比于野生菌株WT同樣表現(xiàn)出略微的延遲（5.07%）（圖3-B）。

圖3 球孢白僵菌對多菌靈的耐藥性（A）及對大蠟螟的生物防治能力（B）Fig.3 Fungal tolerance to carbendazim（A）and the virulence for G. mellonella larve infection（B）

2.3 ΔBbrho5和WT菌株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.3.1 質(zhì)控 WT的3組RNA序列和ΔBbrho5的3組RNA序列的堿基質(zhì)量大于20（Q20）的占98%以上，堿基質(zhì)量大于30（Q30）的占94%以上，堿基G和C的數(shù)量總和超過總的堿基數(shù)量55%，說明本次實驗提取的RNA 序列質(zhì)量較高，可以用來比較野生型和缺陷型菌株的基因差異表達(dá)（表2）。

表2 WT和ΔBbrho5的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Table 2 Quality statistics of the WT and ΔBbrho5 transcriptome data

2.3.2 序列比對 以相關(guān)實驗不存在污染為前提，若參考基因組選擇合適，實驗所產(chǎn)生的測序序列的mapping 率通常會高于65%。Multiple mapped（小片段多為點比對）一般3%左右較好。如表3所示，6組數(shù)據(jù)的Total mapped均超過95%，Multiple mapped均低于0.6%，說明本次實驗不存在污染及所選的參考基因組較好，可以滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的需要。

表3 WT及ΔBbrho5序列比對分析結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Alignment and analysis of WT andΔBbrho5 sequence

2.3.3 表達(dá)量差異分析 分別對兩個樣本中基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量對數(shù)化處理后，以其為橫坐標(biāo)作圖，其中每個點代表一個特定的基因或轉(zhuǎn)錄本［26］。特定的一個點對應(yīng)的橫坐標(biāo)值為該基因在對照樣中的表達(dá)量，縱坐標(biāo)值為該基因在處理樣中的表達(dá)量。將所有基因映射上去后，越趨近于0的點，表達(dá)量越低，越偏離偏對角線程度的點，兩個樣本間表達(dá)差異越大。如圖4所示，ΔBbrho5vs WT顯著差異基因共有770個，其中顯著上調(diào)基因有395個，顯著下調(diào)基因有375個。

圖4 ΔBbrho5 vs WT差異表達(dá)基因散點圖Fig. 4 Scatter diagram of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.4 顯著差異基因功能注釋分析 ΔBbrho5vs WT中DEGs功能主要富集于分子功能部分（molecular function，MF），其中氧化還原酶活力（oxidoreductase activity）和單加氧酶活力（monooxygenase activity）功能極為顯著。在生物進(jìn)程部分（biological process，BP），氧化還原過程（oxidation-reduction process）和跨膜轉(zhuǎn)運（transmembrane transport）最為顯著（圖5）。

圖5 ΔBbrho5 vs WT差異基因GO富集分析柱形圖Fig. 5 GO analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.5 顯著差異基因功能富集分析 ΔBbrho5vs WT的顯著差異代謝通路最主要富集在氮代謝（nitrogen metabolism），此外，也有多數(shù)基因富集到甘氨酸/絲氨酸和蘇氨酸的代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪蛋白氨基酸、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸代謝途徑（圖6）。

圖6 ΔBbrho5 vs WT顯著差異基因功能富集分析Fig. 6 KEGG analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.6 差異次級代謝產(chǎn)物iPath 通路富集分析 iPath是一款交互式Pathway分析可視化工具，它總結(jié)了生物系統(tǒng)中的各種代謝通路，節(jié)點表示各種生化分子，線表示生化反應(yīng)。iPath 2.0（http:// pathways.embl. de）現(xiàn)有3個大類型的通路圖譜。Metabolic pathways：生物系統(tǒng)中整體代謝，包含146條KEGG通路；Regulatory pathways：包含22條KEGG 調(diào)控途徑；Biosynthesis of secondary metabolites：包括參與次生代謝產(chǎn)物生物合成的58個KEGG途徑。利用iPath 2.0可對基因集參與的代謝途徑進(jìn)行可視化分析，以查看整個生物系統(tǒng)的代謝通路信息，圖7為ΔBbrho5vs WT的iPath 代謝通路圖。

圖7 ΔBbrho5 vs WT的iPath代謝通路分析Fig. 7 iPath analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

3 討論

生長是球孢白僵菌重要的生防潛能指標(biāo)之一，影響球孢白僵菌生活史進(jìn)程，在球孢白僵菌侵染過程中，減緩菌絲生長速率可通過延緩產(chǎn)孢、緩慢侵染從而降低微生物殺蟲劑的生防效力。因此，對調(diào)控球孢白僵菌生長速率的基因功能研究具有重要的理論及應(yīng)用意義。近年來，已有眾多影響球孢白僵菌生長的基因或蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，包括MAPK激酶Pbs2、Mkk1和Ste7；熱休克轉(zhuǎn)錄因子Hsf1、Sfl1以及 Skn7；細(xì)胞質(zhì)60S前亞基輸出因子BbRei1及WSC1蛋白等，這些蛋白的缺失均引起球孢白僵菌菌落生長速率遲緩［27-30］。

小GTP酶作為調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的分子開關(guān)，行使各種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞極性生長、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分裂等［31-32］。在我們之前的工作中，已成功構(gòu)建球孢白僵菌小GTP酶Ras3和Miro單基因敲除菌株，并檢測了它們對球孢白僵菌菌絲生長速率的影響。在SDAY和1/4 SDAY培養(yǎng)基上，ras3缺失菌株Δras3顯示出增強(qiáng)的菌絲生長速率，表明Ras3負(fù)調(diào)控球孢白僵菌菌絲生長速率［33］。與此不同，Miro調(diào)控球孢白僵菌細(xì)胞內(nèi)線粒體總量、分布及ATP含量，而Miro功能缺失引起球孢白僵菌菌絲生長速率減緩［17］。在本實驗中，成功構(gòu)建球孢白僵菌Rho5蛋白單基因缺失菌株ΔBbrho5及其對應(yīng)回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷ΔBbrho5。在SDAY、1/4 SDAY及貧瘠培養(yǎng)基CZA培養(yǎng)基上，ΔBbrho5均表現(xiàn)出受抑制的菌絲生長速率：在富營養(yǎng)培養(yǎng)基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%；在貧瘠培養(yǎng)基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上結(jié)果表明，小GTP酶對球孢白僵菌生長速率的調(diào)節(jié)可能是多向的，因基因不同而異，BbRho5正向調(diào)控球孢白僵菌菌絲生長速率，這和Miro蛋白功能缺陷引起的表型類似。

提取ΔBbrho5及WT菌株RNA，借助Illumina Hiseq 測序平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ΔBbrho5vs WT共獲得顯著差異表達(dá)基因（DEGs）770個，其中顯著上調(diào)基因有395個，顯著下調(diào)基因有375個。對ΔBbrho5vs WT基因集中的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明DEGs功能主要富集于分子功能部分（molecular function，MF），其中氧化還原酶活力（oxidoreductase activity）和單加氧酶活力（monooxygenase activity）功能極為顯著。在生物進(jìn)程部分（biological process，BP），氧化還原過程（oxidation-reduction process）和跨膜轉(zhuǎn)運（transmembrane transport）最為顯著。通過KEGG富集通路分析，結(jié)果表明，ΔBbrho5vs WT的DEGs顯著差異代謝通路最主要富集在氮代謝（nitrogen metabolism），此外，也有多數(shù)基因富集到甘氨酸/絲氨酸和蘇氨酸的代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪蛋白氨基酸、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸代謝途徑。在微生物細(xì)胞中，氮源需要轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼岷凸劝滨０凡拍苓M(jìn)一步被利用，因此，谷氨酸和谷氨酰胺在氮代謝中發(fā)揮著重要作用。谷氨酸合酶被證明可正向調(diào)控靈芝菌絲生長［34］，谷氨酰胺合成酶是一個重要的氮源調(diào)節(jié)因子，影響微生物對氮源及能源的利用。在刺糖多孢菌中，谷氨酰胺合成酶基因的敲除同樣引發(fā)顯著的生長抑制［35］。在ΔBbrho5vs WT的DEGs中，富集到氮代謝通路中的功能基因有7個，其中5個上調(diào)，2個下調(diào)，說明敲除菌株可能采用增強(qiáng)氮源利用以應(yīng)對Bbrho5缺陷引起的生長遲緩。在上調(diào)基因中，包含了重要的谷氨酸合酶（glutamate synthase）基因和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）基因，這在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了ΔBbrho5細(xì)胞內(nèi)谷氨酸合成水平增強(qiáng)，暗示ΔBbrho5可能通過調(diào)節(jié)上升的氮代謝，進(jìn)而促進(jìn)谷氨酸合成，以應(yīng)對生長速率減弱的生防潛能缺陷。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建球孢白僵菌Bbrho5單基因缺失菌株ΔBbrho5，Bbrho5單缺失能夠引起球孢白僵菌的顯著生長缺陷，并對球孢白僵菌抗多菌靈能力及其生物防治能力效果極微。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明ΔBbrho5可能通過氮代謝及多種氨基酸代謝作為響應(yīng)通路調(diào)節(jié)菌體的生長速率。