彭國穎 胡亮 黃超 楊坤 萬瑋 黃長干

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學 南昌市植物資源化學利用重點實驗室，南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學校友辦，南昌 330045）

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益成為危害糧食作物生產(chǎn)的因素，重金屬污染的治理亦是當前環(huán)境科學研究的一個重點領域，重金屬污染包含銅、汞和鎘等污染。植物修復技術是一種新興的、高效的生物修復途徑，已得到科學界和政府機構的認可和運用。植物修復技術是運用綠色植物來容納、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移污染物來修復環(huán)境。植物修復具有成本低、不破壞土壤和河流生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點。因此，具備生長周期短、生物產(chǎn)量高及富集能力強的超積累植物對于植物修復技術的重要因素［1］，自然界的超積累植物一般很難同時具備這3點條件，而利用基因工程技術對植物進行基因改造可以有效的解決這一問題。重金屬耐受性是超積累植物的重要特性，目前對重金屬脅迫的分子生物學研究越來越受到重視，許多學者已經(jīng)從不同角度探討了植物對重金屬的耐受機制［2］。

目前對植物修復技術的研究主要集中在兩個方面，一方面是尋找、篩選、培育超積累植物，另一方面是研究超積累植物對重金屬的耐受機制和富集機制。許多研究人員提出了植物對重金屬的耐受性機制［3-7］，然而植物對重金屬的超積累機理尚未闡明。目前發(fā)現(xiàn)的超積累植物有700多種，有20多種是銅超積累植物，其中高山木薯（Ipomoca alpina）是最典型的銅超積累植物，其銅的富集量可高達12 300 mg/kg［8］；紫鴨跖草（Setcreasea purpurea）也是一種銅超積累植物，其根部銅累積量能達1 210 mg/kg［9］。

銅是植物重要的一種微量元素，是許多酶（包括細胞色素氧化酶、質(zhì)體藍蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶）所需的氧化還原輔助因子。由于銅的氧化還原反應使其在高濃度下是一種強效毒素，因此植物會利用體內(nèi)平衡機制嚴格控制細胞內(nèi)銅的濃度和活性，從而避免植物細胞銅中毒［10］。銅的解毒方法包括金屬結合配體的合成和重金屬轉(zhuǎn)運蛋白的運輸，金屬結合配體的主要類型是金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）和植物螯合肽（Phytochelatins，PCs），金屬硫蛋白的氨基酸序列是由基因編碼的，而植物螯合肽則由植物螯合素酶合成的，這兩種金屬結合配體在重金屬解毒和平衡體內(nèi)重金屬濃度中具有重要作用［11-12］；重金屬轉(zhuǎn)運蛋白包含重金屬吸收蛋白和重金屬排出蛋白兩種蛋白，重金屬轉(zhuǎn)運蛋白通過將重金屬吸收或轉(zhuǎn)移至特定的細胞部位［13］，從而降低重金屬對細胞的毒害，重金屬轉(zhuǎn)運蛋白包含ABC轉(zhuǎn)運蛋白［14］、P1B-ATPase蛋白［15］、CDF蛋白［16］、COPT蛋白［17］和YSL蛋白［18］等蛋白。植物在重金屬脅迫下，金屬結合配體與重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在抵御重金屬中具有重要的作用。

紫鴨跖草整個植株全年呈紫紅色，枝或蔓或垂，特色鮮明，具有較高的觀賞價值。課題組以在中國最大的銅礦——江西德興銅礦區(qū)篩選并報道的銅超積累植物紫鴨跖草為實驗材料。轉(zhuǎn)錄組測序是一種全面而準確的工具，可以用于闡明植物應對重金屬、堿和低溫［20-22］等環(huán)境脅迫的反應，李小毛等［19］發(fā)現(xiàn)紫鴨跖草在銅脅迫下會誘導表達特異蛋白以增強對銅的耐受性。因此本課題組采用高通量測序技術獲取銅脅迫下紫鴨跖草中的轉(zhuǎn)錄本并進行分析，然后對紫鴨跖草在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及各代謝通路中對差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行分析，以期揭示紫鴨跖草在應對銅脅迫的響應機制，同時為分子水平上為研究紫鴨跖草的耐銅機制提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

剪取紫鴨跖草4 cm-6 cm的嫩莖，置于培養(yǎng)箱中的Hoagland’s（霍格蘭氏）營養(yǎng)液中培養(yǎng)，光周期為光照14 h/黑暗10 h，晝夜溫度為（25±1）℃/（20±1）℃，光照的強度為300 μmol/（m2·s）。待培養(yǎng)長出1 cm-3 cm的嫩根，依次在0、10、50、100、200、300、500、1 000 μmol/L Cu2+的Hoagland’s營養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，對0 μmol/L（CK）、300 μmol/L（CT1）、1 000 μmol/L（CT2）Cu2+營養(yǎng)液培養(yǎng)紫鴨跖草的根進行取樣，迅速用液氮進行冷凍處理，并保存在-80℃冰箱中用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灐?/p>

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序 利用RNeasy Plus Mini Kit試劑 盒（Qiagen）提 取CK、CT1和CT2根 組 織 的總RNA，每個實驗組進行3次生物學重復，運用Bioanalyzer 2100儀器（Agilent）驗證RNA的質(zhì)量。3組總RNA分為兩部分，一部分用于轉(zhuǎn)錄組測序，另一部分用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證轉(zhuǎn)錄組測序獲得的DEGs數(shù)據(jù)的可重復性。利用Truseq RNA試劑盒（Illumina）合成cDNA文庫，由上海派森諾生物科技有限公司運用Illumina NextSeq500平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析 獲取測序的圖像文件后，利用由Illumina測序平臺軟件生成原始數(shù)據(jù)。低質(zhì)量的Reads會對后續(xù)的信息分析造成很大的干擾，因此采用Cutadapt去除接頭，將長度小于50 bp、序列平均質(zhì)量在Q20以下的序列平均質(zhì)量在Q20以下的Reads進行去除，將獲取的Clean Reads使用trinity軟件拼接到轉(zhuǎn)錄本中，unigene為每個基因下最長的轉(zhuǎn)錄本［23］。將篩選出的unigene在NR數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、eggNOG數(shù)據(jù)庫、SwissProt數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中進行比對（E value≤1E-5）及功能注釋。篩選銅脅迫下紫鴨跖草根組織的差異表達基因閥值為：表達差異倍數(shù)|log2FoldChange|≥1，且P-value＜0.05。

1.2.3 差異表達基因的qRT-PCR驗證 為了驗證紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選取10個DEGs進行qRT-PCR驗證［24］，使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）試劑盒將CK、CT1和CT2的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（TaKaRa）為熒光染料。qRT-PCR實驗運用LightCycler?480 II實時熒光定量PCR儀（Roche）進行，選用泛素連接酶基因（UBI）作為內(nèi)參基因。各個反應進行3次生物學重復，利用2-△△Ct算法計算基因的相對表達量。利用Prime5軟件設計的特異性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

2 結果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與unigene功能注釋

紫鴨跖草CK、CT1和CT2的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中，登錄號為SAMN-11265427。測序下機數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果如表2所示CK、CT1和CT2的raw reads數(shù)在40.67 Mb-50.21 Mb之間，堿基總數(shù)在6.14 Gb-7.58 Gb之間，過濾后的Clean Reads數(shù)在38.21 Mb-47.17 Mb之間，可以發(fā)現(xiàn)Q20＞90%、Q30＞85%、Clean Reads比例＞90%，說明9組樣品的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量均合格。通過Trinity軟件對raw reads進行組裝，共獲得82 471條長度從200 bp到13 305 bp不等的高質(zhì)量unigene（圖1），其N50長度、N90長度和平均長度分別為2 299 bp、1 149 bp、1 946 bp，表明組裝的unigene質(zhì)量高。

表2 下機數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Data statistics of disembarkation

圖1 序列長度分布圖Fig. 1 Sequence length distribution

將82 471條unigene在6個生物數(shù)據(jù)庫（NR、GO、KEGG、Pfam、eggNOG和Swissprot）中 進 行功能注釋（表3），有8 422條unigene在5個數(shù)據(jù)庫中均得到注釋，占總unigene的10.20%，unigene在NR數(shù)據(jù)庫中獲得注釋率最高，占總unigene的82.73%；其次注釋率較高是eggNOG數(shù)據(jù)庫（81.97%）；unigene在GO、KEGG、Pfam和Swissprot的4個數(shù)據(jù)庫注釋率依次為28.17%、42.59%、33.72%和64.26%。

表3 數(shù)據(jù)庫注釋結果匯總Table 3 Summary of database annotation results

2.2 差異表達基因分析

差異表達基因的篩選標準為P-Value＜0.05，CK、CT1和CT2中的DEGs統(tǒng)計結果如表4所示。CT1與CK相比，DEGs的數(shù)目為5 028條，占總unigene的7.37%，其中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因分別有3 138條和1 890條；CT1與CK相比，DEGs的數(shù)目為9 982條，占總unigene的14.63%，其中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因分別有5 061條和4 921條。運用R語言ggplots 2軟件繪制CT1與CK、CT2與CK差異表達基因的火山圖（圖2），火山圖可以展示基因的差異表達和顯著性結果?？梢缘贸?，CT1、CT2與CK的DEGs差異倍數(shù)大都集中在-5-5之間，說明紫鴨跖草在不同銅濃度脅迫下的DEGs具有相似的表達趨勢。

圖2 差異表達基因的火山圖Fig. 2 Volcano map of differentially expressed genes

表4 紫鴨跖草根組織的差異表達基因分析結果統(tǒng)計Table 4 Statistical analysis of differentially expressed genes in S. purpurea roots

2.3 GO功能分類

Unigene在GO數(shù)據(jù)庫注釋中的基因功能劃分為三大類：生物學過程（biological process，BP）、細胞的組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），注釋在GO功能項（GO term）上的unigene有23 236條（占總unigene的28.17%），如圖3所示。unigene注釋數(shù)量較大的有生物過程中的“細胞過程”“代謝過程”“單組織過程”；細胞組分中的“細胞”“細胞部分”“細胞器”“膜部分”；分子功能中的“催化活性”和“結合蛋白”。

圖3 GO注釋統(tǒng)計Fig. 3 GO annotation statistics.

有5 028條DEGs富集在GO的332類GO term中，CT1與CK、CT2與CT1在BP、CC和MF中DEGs數(shù)量最多的前10個GO term如圖4所示。在CT1 vs CK中（圖4-A），DEGs在生物學過程的“定位”“轉(zhuǎn)運”“氧化還原過程”、細胞組分的“細胞膜”“膜成分”和分子功能的“催化活性”“水解酶活性”“轉(zhuǎn)移酶活性”等方面顯著富集。在CT2 vs CT1中（圖4-B），增加的DEGs主要富集在生物學過程的“氧化還原過程”“小分子代謝過程”“應激反應”、細胞組分的“細胞膜”“膜成分”和分子功能的“碳環(huán)化合物結合”“雜環(huán)化合物結合”“氧化還原酶活性”“碳水化合物代謝”等方面。

圖4 紫鴨跖草根組織在銅脅迫下差異基因的GO功能項注釋Fig. 4 GO function annotation of DEGS in S. purpurea root tissue under copper stress

2.4 eggNOG注釋分析

共有67 602條unigene在eggNOG獲得注釋，占總unigene的81.97%，將最佳比對結果的eggNOG編號賦值給相應的基因，在以eggNOG上編號與分類目錄的對應關系，將每一個基因歸類到eggNOG分類目錄上，獲得注釋的67 602條unigene被分為26類，注釋的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果見圖5。在這26種分類中，“一般功能預測基因”的unigene數(shù)量最多（13 278條），其次是“未知功能”（10 357條）和“翻譯后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)、伴侶”（7 493條），數(shù)量最少的unigene分類為“細胞活性”類（4條）。其中與植物體防御機制相關的“復制、重組和修復”和“防御機制”的unigene分別有2 652條、643條。eggNOG注釋在GO注釋的基礎上互為補充，使得unigene功能注釋更為完善。

圖5 eggNOG注釋統(tǒng)計Fig. 5 eggNOG annotation statistics

2.5 KEGG富集分析

為進一步獲得銅脅迫下紫鴨跖草根組織在各代謝路徑上的相關基因和基因的復雜生物學行為，將紫鴨跖草的unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行注釋（圖6），共有35 123條unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，涉及35個路徑。紫鴨跖草unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的功能分為五類：代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程和生物有機系統(tǒng)。在代謝中注釋的unigene的最多，有24 433條，其次是遺傳信息處理（7 197條）、生物系統(tǒng)（6 547條）、細胞過程（4 338條）和環(huán)境信息處理（3 346條）。

圖6 KEGG注釋統(tǒng)計Fig. 6 KEGG annotation statistics

為深入的了解DEGs的生物學功能，進一步利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析銅脅迫下紫鴨跖草根組織的DEGs主要謝途徑。CT1 vs CK有922條DEGs注釋在31條代謝途徑，主要涉及的代謝通路有類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導；CT2 vs CT1有1 981條DEGs注釋在38條代謝通路，主要涉及的代謝通路有MAPK信號轉(zhuǎn)導、植物激素信號轉(zhuǎn)導和過氧化物酶體。顯著KEGG富集通路前3的代謝通路如表5所示。DEGs在上述代謝通路具有顯著性差異，說明這些代謝通路在紫鴨跖草應對銅脅迫上具有重要的作用。

表5 紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組顯著KEGG富集通路Table 5 The significant KEGG enrichment pathway in S. purpurea transcriptome

2.6 NR注釋分析

在NR庫上進行注釋比對的結果匯總成比對的E-value分布圖、序列相似度分布圖和物種分布圖，如圖7所示。從E-value分布圖（圖7-A）可以看出，E-value＞1E-5的unigene是獲得注釋主要部分，共占NR數(shù)據(jù)庫注釋的71.17%；從序列相似度分布圖（圖7-B）可以得出序列相似度大于60%的有53 862條unigene，占NR數(shù)據(jù)庫注釋的78.95%。從的物種分布圖（圖7-C）可以得知，除去其它占比外，緣物種基因序列相似性最高的是芭蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）（18 098條unigene，占NR數(shù)據(jù)庫注釋的26.53%），其次是油棕（Elaeis guineensis）和海棗（Phoenix dactylifera）。

圖7 NR注釋統(tǒng)計Fig. 7 Statistics of NR annotation

2.7 銅脅迫相關基因的篩選與分析

本研究為找到紫鴨跖草在銅脅迫下潛在的銅脅迫應答基因，在GO富集和KEGG通路分析中，通過基因的注釋和閥值P-value ≤ 0.001的過濾，且篩選銅脅迫下在CT1和CT2中均有顯著性上調(diào)表達的基因，對這些基因進行數(shù)據(jù)分析和文獻查閱，獲得5條與銅脅迫相關的基因（c76816_g1、c34452_g1、c14543_g1、c11849_g1、c44409_g1）（表6），其 分別注釋為P1B型ATP酶5（HMA5）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、金屬硫蛋白基因（MT）、植物絡合素合酶（PCS）。c34452_g1、c11849_g1和c44409_g1的表達量均隨著Cu2+濃度的升高而升高，而c76816_g1和c14543_g1在CT2中表達的差異倍數(shù)略低于CT1。

表6 銅脅迫相關基因的分析Table 6 Analysis of genes related to copper stress

2.8 qRT-PCR驗證差異表達基因

為驗證銅脅迫下紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，隨機選取10個基因進行qRT-PCR分析（圖8），其中5個是上調(diào)的基因（MTAP1、MT、IPF1、PCS、PP2C）和5個下調(diào)的基因（GSTF2、ABP1、NRP1、AQP-TIP3、α-Amylase）。通 過 將qRT-PCR數(shù)據(jù)分析所得的基因相對表達量值轉(zhuǎn)化為log2FC值與RNA-Seq數(shù)據(jù)的log2FC值進行比較，盡管兩組數(shù)值的變化值存在差異，但兩者上下調(diào)表達趨勢與數(shù)值大致相同，表明RNA-seq所得數(shù)據(jù)具有真實性和可靠性。

圖8 差異表達基因 qRT-PCR 驗證Fig. 8 qRT-PCR verification of differential expressed genes

3 討論

高通量測序技術相對于第一代測序技術的主要優(yōu)勢是測序的速度和準確性，以及大量數(shù)據(jù)的可用性。高通量測序可以同時測量大量的序列，是研究未知物種轉(zhuǎn)錄組和基因組的有力工具［25］。轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量測序技術將mRNA從總RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，從而快速、全面地獲取特定樣本中幾乎所有cDNAs的序列信息和含量［26］。通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲得的信息可用于研究基因組功能元件的差異表達、轉(zhuǎn)錄分類和應激條件。因此，高通量轉(zhuǎn)錄組測序已成為研究基因表達的重要手段。高通量測序技術（NGS）被廣泛應用于模型和非模型生物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究以及全基因組水平的基因表達［27-28］。例如，Koenig等［29］運用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析了人工栽培與野生番茄的基因表達差異，Li等［30］利用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析篩選出參與茶樹耐鋁的候選響應基因，Rathi等［31］通過轉(zhuǎn)錄組分析闡明了豌豆幼苗發(fā)育過程中脫水耐性的表達特征。隨著技術的不斷創(chuàng)新發(fā)展，使得越來越多的有研發(fā)潛力的植物走進了測序的大門，豐富的資源也使得人類進一步邁進進基因的寶庫［32］。

本研究對不同Cu2+濃度處理的紫鴨跖草根組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝拼接得到82 471條紫鴨跖草unigene，為紫鴨跖草挖掘銅脅迫下重要的功能基因提供了基礎。由紫鴨跖草DEGs的GO term可知紫鴨跖草受到Cu2+脅迫時的防御機制。在300 μmol/L Cu2+脅迫時，一方面，膜結構組成被激活，膜上的轉(zhuǎn)運蛋白將銅離子直接跨膜轉(zhuǎn)運至細胞的不同拓撲空間，從而降低了銅離子的毒性作用，另一方面紫鴨跖草受到銅離子刺激產(chǎn)生氧化應激，激活轉(zhuǎn)移酶功能和機體轉(zhuǎn)運功能，以此維持機體的離子平衡；在1 000 μmol/L Cu2+脅迫時，與Rai等［33］利用高通量測序技術組裝鎘脅迫下獐牙菜（Swertia japonicato）代謝路徑中涉及的DEGs富集GO term結果相近，表明這些功能項中可能存在與抵抗外界脅迫相關的差異表達基因。相比于CT1，紫鴨跖草根組織在CT2的應答機制有所改變，可能是高濃度的Cu2+嚴重損傷紫鴨跖草的細胞壁與膜結構，一方面，大量的膜結構成分的破壞激活膜結構修復功能，細胞內(nèi)部代謝路徑激活產(chǎn)生一系列氧化還原反應還原Cu2+，并產(chǎn)生大量的環(huán)狀化合物來結合Cu2+和Cu2+脅迫產(chǎn)生的有機酸；另一方面，由于脅迫下糖代謝和三羧酸循環(huán)等能量供應系統(tǒng)受阻導致機體通過小分子代謝過程來補充需求的能量。在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析中，紫鴨跖草的根組織在應對Cu2+脅迫時，涉及許多重要的代謝過程，有類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導、植物激素信號轉(zhuǎn)導和過氧化物酶體等代謝途徑。在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了5個和響應重金屬誘導有關且顯著上調(diào)的基因，注釋分別為HMA5、GPX、Cu/Zn-SOD、MT和PCS的基因，這5類基因具有應對銅脅迫的相關依據(jù)。銅脅迫下擬南芥根系的HMA5能將Cu2+逆電化學勢差排出細胞［34］；Wang等［35］首次報道了植物AtGPX6與銅離子在分子水平上的直接結合方式和相互作用機理；Cu/Zn-SOD能夠?qū)⒅参镌阢~脅迫產(chǎn)生的活性氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫和分子氧［36］；過度表達的金屬硫蛋白能夠顯著降低銅脅迫下水稻細胞的死亡率［37］；Imahara等［38］發(fā)現(xiàn)植物的PCS對植物細胞的銅具有抗性。表明紫鴨跖草在銅脅迫下應對Cu2+脅迫是一個復雜的生理過程，不僅僅是單一的基因響應的，而是需要植物功能的整體運作和協(xié)調(diào)來維持植物的正常生長。本文基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索了紫鴨跖草根組織與重金屬銅脅迫和耐銅機制的相關信息，為研究銅超積累植物紫鴨跖草應對銅脅迫的解毒機制提供了初步的基因資源和參考依據(jù)。

4 結論

GO分析表明，DEGs在CT2、CT1富集的GO term有所異同，其中在氧化還原過程、細胞膜、膜成分等GO term均顯著富集；KEGG分析表明，類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導和植物激素信號轉(zhuǎn)導等代謝通路參與紫鴨跖草應對銅脅迫；NR分析了紫鴨跖草與芭蕉、油棕和海棗等物種的基因序列相似性；在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出了5個潛在響應重金屬誘導有關且顯著上調(diào)的基因，通過分析比較基因的qRT-PCR表達譜與轉(zhuǎn)錄組測序的表達變化，驗證了銅脅迫下紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有準確性和可靠性。