鄒良平 郭鑫，2 起登鳳 翟敏 李壯 趙平娟 彭明 牛興奎

（1 . 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；3. 武警后勤部直屬保障大隊(duì)，北京 100089；4. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

花青素屬于內(nèi)黃酮家族中的一類，為水溶性色素，幾乎在所有的植物中存在，其作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物之一具有超強(qiáng)清除活性氧的功能［1］。當(dāng)植物處于生物或非生物脅迫環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，從而對(duì)植物造成損傷，為了抵御不良環(huán)境對(duì)植物的影響，合成花青素的相關(guān)酶基因此時(shí)被激活表達(dá)，植物體內(nèi)花青素合成增加，從而增強(qiáng)植物能夠順利度過(guò)脅迫環(huán)境的機(jī)會(huì)［2］。植物花青素的合成和積累受到多種生物或非生物因子的影響，如病毒、光、溫度、水分、糖、激素、磷和氮等都參與了花青素合成的調(diào)節(jié)和控制［3］。

氮素是植物花青素合成和積累中的一個(gè)重要調(diào)控因子。土壤中能夠被植物直接吸收利用的氮素主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。一般來(lái)說(shuō)，植物在低氮環(huán)境條件下能夠促進(jìn)花青素的合成，而高氮環(huán)境條件下則抑制其合成和積累［4-6］。但是對(duì)于不同作物，不同氮素濃度在影響花青素的合成方面卻有所不同：比如在紅色卷心菜中，增施150 kg/ha氮素能夠誘導(dǎo)高含量的花青素產(chǎn)生；在紫色水稻中施用氮肥也能夠增加花青素的積累［7］；但是在擬南芥［6，8-9］、蘋(píng)果［10］、葡萄［11］、紅色萵苣［12］等植物中，氮素缺乏或低氮環(huán)境條件下卻有利于促進(jìn)花青素的合成和積累。即使在低氮環(huán)境條件下，氮素的不同形態(tài)對(duì)花青素的誘導(dǎo)合成在不同作物中也表現(xiàn)各異：比如在對(duì)擬南芥紅色愈傷組織pap1-D（production of anthocyanin pigment 1-Dominant）中不同氮素濃度和形態(tài)配比的研究表明，銨態(tài)氮（9.8 mmol/L）會(huì)降低紅色愈傷組織花青素的含量［5］；在非洲菊中，低濃度的銨態(tài)氮抑制了花瓣花青素的積累［13］；氮在玉米B73中，1 mmol/L銨態(tài)氮卻能夠誘導(dǎo)花青素的累積，而1 mmol/L硝態(tài)氮和缺氮條件下卻不能誘導(dǎo)花青素的產(chǎn)生［14］，但是在蘋(píng)果［15］和擬南芥［16］中，低濃度硝態(tài)氮卻能夠促進(jìn)花青素的合成。由此可見(jiàn)，即使在氮素水平受到控制的環(huán)境條件下，花青素的合成也可能與植物發(fā)育的不同階段及各種環(huán)境因子相關(guān)，并且各因子之間相互作用復(fù)雜，因此，植物花青素的合成和積累是植物與各種環(huán)境因子相互作用后最終達(dá)成的結(jié)果。

木薯屬于大戟科雙子葉短日照熱帶作物［17］，是世界上繼玉米、水稻、小麥、馬鈴薯和大豆后的第六大類糧食作物。木薯塊根中淀粉含量高、品質(zhì)優(yōu)良［18-19］，被稱為“淀粉之王”，是非洲及南亞等發(fā)展中國(guó)家8億人的口糧。木薯作為一種熱帶經(jīng)濟(jì)作物，粗生易栽、適應(yīng)性強(qiáng)，在干旱貧瘠的山地丘陵地也能獲得較高的產(chǎn)量。木薯作為一種經(jīng)濟(jì)作物，其基礎(chǔ)研究近年得到了國(guó)家和地方的大力支持，木薯的高產(chǎn)高效栽培成為當(dāng)前研究的主要方向，但相對(duì)于其他作物而言總體上還是比較薄弱。本研究通過(guò)設(shè)置不同的氮肥濃度及形態(tài)處理對(duì)木薯植株花青素合成和積累以及植株農(nóng)藝性狀的影響進(jìn)行研究，以期通過(guò)花青素直觀表型變化來(lái)作為木薯對(duì)氮素需求的可視化指標(biāo)，并結(jié)合植物的生長(zhǎng)狀態(tài)，為木薯高效栽培的合理施氮提供理論參考和直觀判斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯無(wú)菌苗材料Arg7號(hào)得益于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所趙平娟副研究員的饋贈(zèng)。木薯無(wú)菌苗培養(yǎng)用的廣口玻璃瓶購(gòu)置于?？诃偵角缹?shí)驗(yàn)用品中心。

蔗糖，硝酸鉀，硝酸鈉等購(gòu)于海南合輝實(shí)業(yè)有限公司；植物凝膠、琥珀酰胺，MS缺氮培養(yǎng)基，矢車菊素-3-氧-槐糖苷，甲酸，RNA提取試劑盒，cDNA合成用FastQuant RT Ki試劑盒等購(gòu)買于北京艾科懷曼生物科技有限公司；RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 不同氮素形態(tài)和濃度配比培養(yǎng)基準(zhǔn)備及培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基除了缺氮外與MS（Murashige和Skoog）完全相同。用于本實(shí)驗(yàn)中的不同培養(yǎng)基是在MS缺氮培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同氮素濃度和形態(tài)配備而成。具體培養(yǎng)基配比為：（1）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+；（2）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 40 mmol/L NO3-；（3）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 20 mmol/L NH4+；（4）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+；（5）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.4 mmol/L NO3-；（6）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.2 mmol/L NH4+；（7）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 1 mmol/L（N）；（8）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 5 mmol/L（N）；（9）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 9 mmol/L（N）；（10）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 13 mmol/L（N）；蔗糖濃度3%（W/V），植物凝膠0.4%（W/V），pH5.8，121℃滅菌20 min。本實(shí)驗(yàn)所用材料均在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所光照培養(yǎng)房中處理，培養(yǎng)房生長(zhǎng)條件為28℃光照16 h，26℃黑暗8 h。

1.2.2 花青素合成相關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量RT-PCR 培養(yǎng)40 d的無(wú)菌苗去除根后用剪刀把莖和葉片剪碎后用液氮快速冷凍，樣品總RNA提取用植物RNA提取試劑盒（OMEGA），cDNA合成用FastQuant RT Kit（TIANGEN）試劑盒。Real-Time PCR在StepOneTMReal-Time PCR儀器（Applied Biosystems）上進(jìn)行，所 用試劑為SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit（Takara）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品生物學(xué)重復(fù)3次。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；45個(gè)循環(huán)?；ㄇ嗨睾铣山Y(jié)構(gòu)基因特異引物見(jiàn)表1。

表1 花青素合成相關(guān)基因特異引物Table 1 Specific primers for the genes related to anthocyanin biosynthesis

1.2.3 總花青素含量測(cè)定 木薯樣品去除根部，用剪刀將莖段、葉柄及葉片剪碎后置入加有液氮的研缽中研磨成粉，稱取0.1000 g樣品，加入1 mL 5%甲酸溶液，渦旋混勻，超聲提??；12 000 r/min 4℃離心10 min；收集上清于新的離心管中；向沉淀中加入1 mL 5%甲酸溶液繼續(xù)提??；重復(fù)上述步驟數(shù)次，直至上清無(wú)色為止；530 nm處測(cè)定吸光度值，以5%甲酸溶液作為空白。所用儀器為多功能酶標(biāo)儀（賽默飛Multiskan GO，美國(guó)），酶標(biāo)板為康寧（美國(guó)），要求目標(biāo)波長(zhǎng)下孔間差異小于0.02。按照如下公式計(jì)算花青素含量：花青素含量（μg/g）=C×V/M。

其中C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的結(jié)果；M為實(shí)際稱量質(zhì)量；V為提取液總體積，具體操作請(qǐng)見(jiàn)參考文獻(xiàn)［20-21］。GraphPad Prism 8和SPSS軟件用于花青素含量與氮素濃度之間的相關(guān)性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 氮素濃度和形態(tài)對(duì)木薯品種Arg7幼苗的影響

硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是植物利用的主要氮素來(lái)源，為了闡明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮不同濃度配比對(duì)木薯相關(guān)性狀的影響，本研究在MS缺氮培養(yǎng)基中分別配比了6種氮素濃度對(duì)Arg7幼苗進(jìn)行處理。結(jié)果表明，木薯品種Arg7無(wú)菌苗在添加有40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+（對(duì)照），40 mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+的MS缺氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至40 d時(shí)整個(gè)植株之間沒(méi)有觀察到有差異表型（圖1-A，B和C）；與對(duì)照相比，在40 mmol/L NO3-條件下的株高和初生根根長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異（圖1-J，K），但初生根根數(shù)顯著減少（圖1-L），而在20 mmol/L NH4+條件下其株高、初生根根長(zhǎng)和初生根根數(shù)都受到極顯著抑制（圖1-J，K，L）。

木薯品種Arg7幼苗在含有0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+的MS缺氮培養(yǎng)基中處理至15 d，在葉柄處出現(xiàn)淡紅色表型，這種表型隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加深；在處理至40 d時(shí)，葉柄處深紅色表型已延展至木薯莖段部位（圖1-D，E和F）；與對(duì)照相比，在0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+條件下的株高、初生根根長(zhǎng)和根數(shù)都極顯著降低（圖1-J，K，L），葉片退綠變黃老化（圖1-D，E和F）；當(dāng)處理至90 d時(shí)，葉片黃化更明顯，深紅色表型出現(xiàn)在葉片主脈中（圖1-G，H，I）。

圖1 氮素濃度和形態(tài)對(duì)木薯Arg7幼苗的影響Fig.1 Influences of the concentration and the forms of nitrogen onsterile cassava variety Arg7 seedling

2.2 木薯品種Arg7花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)

為了明確木薯品種Arg7在低氮條件下在葉柄和莖段處產(chǎn)生的深紅色表型與花青素合成過(guò)程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的相關(guān)性，本研究根據(jù)擬南芥和矮牽牛中花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因序列，在phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show= KEYWORD &method=Org_Mesculenta）網(wǎng)站上通過(guò)BLAST查找出木薯相關(guān)基因，篩選出與擬南芥和矮牽牛同源性高的木薯相關(guān)基因合成特異引物（表1）并進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果（圖2）表明，花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因PAL，4CL，CHS，F(xiàn)3H，DFR，ANS在低濃度氮素（0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+）處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄水平比高濃度氮素（40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+，40 mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+）處理?xiàng)l件下的表達(dá)量高，即木薯花青素合成結(jié)構(gòu)基因PAL，4CL，CHS，F(xiàn)3H，DFR，ANS在Arg7品種中能夠被低濃度氮素誘導(dǎo)表達(dá)。由此表明，在木薯品種Arg7中產(chǎn)生的深紅色表型可能與花青素相關(guān)。

圖2 不同氮素處理?xiàng)l件下花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)Fig. 2 Expressions of genes related to anthocyan in biosynthesis under different concentration and forms of nitrogen

2.3 木薯品種Arg7產(chǎn)生的花青素與氮素的相關(guān)性分析

由于花青素水溶液在酸性條件下呈紅色，在520 nm存在特征吸收峰，并且吸收峰大小與樣品花青素含量呈正比例關(guān)系。據(jù)此原理，我們用酶標(biāo)儀對(duì)花青素總含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，在低氮（0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+）條件下的植株，其花青素含量相較于在高氮（40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+，40mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+）條件下的含量高，其最高含量（213.75 ± 3.22 μg/g）比最低含量（22.10± 1.51μg/g）增加了約10倍（圖3）。

圖3 不同氮素處理?xiàng)l件下的花青素含量Fig. 3 Content of anthocyanin under different nitrogen treatment conditions

為了進(jìn)一步明確木薯品種Arg7中產(chǎn)生的花青素與氮素之間的相關(guān)性，將該品種無(wú)菌苗分別轉(zhuǎn)接至含有1 mmol/L，5 mmol/L，9 mmol/L和13 mmol/L氮素的MS培養(yǎng)基中處理。當(dāng)處理至15 d時(shí)，含有1 mmol/L氮素的植株葉柄處即出現(xiàn)紅色花青素；處理至20 d時(shí)，含有5 mmol/L氮素的植株葉柄處開(kāi)始出現(xiàn)紅色花青素，而此時(shí)1 mmol/L氮素處理的植株葉柄處積累的紅色花青素開(kāi)始向莖段中擴(kuò)展；當(dāng)處理至30 d的時(shí)候，含有9 mmol/L氮素的植株葉柄處才開(kāi)始出現(xiàn)淡淡的紅色花青素；直至處理至40 d，在含有13 mmol/L氮素的植株中也沒(méi)有觀察到花青素產(chǎn)生（圖4-A-D）。

將上述處理40 d的植株進(jìn)行花青素含量測(cè)定，然后將氮素濃度與花青素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，木薯品種Arg7中產(chǎn)生的花青素含量隨著氮素濃度的增加而降低，即花青素含量與氮素濃度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.96，圖4-E）。

圖4 花青素含量隨著氮素濃度遞增而呈負(fù)相關(guān)關(guān)系Fig.4 Anthocyanin content negatively correlated with the increase of nitrogen concentration

3 討論

氮素是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素［22］。其不僅作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)參與生物大分子如核苷酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、葉綠素、激素、生物堿、酶等的構(gòu)成，同時(shí)也作為一個(gè)重要信號(hào)分子參與植物的多個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程［23-24］。植物在低氮環(huán)境條件下生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到嚴(yán)重影響。一系列的研究表明，植物中積累的花青素在抵御低氮生長(zhǎng)環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。通常情況下，低氮環(huán)境能夠通過(guò)促進(jìn)苯丙烷途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因，包括PAL，4CL，CHS，CHI，F(xiàn)3H，DFR，ANS和UFGT的增量表達(dá)來(lái)達(dá)到增加花青素產(chǎn)生和積累的目的，從而增加在低氮脅迫環(huán)境中存活的機(jī)會(huì)。這些結(jié)構(gòu)基因受到包 含TTG1-TT8/GL3-PAP1，TTG1-TT8/GL3-PAP2，TTG1-TT8/GL3-MYB113和TTG1-TT8/GL3-MYB114在內(nèi)的保守MBW（MYB-bHLH-WD40/WDR）蛋白復(fù)合體的調(diào)控［1，10，25-26］。擬南芥中過(guò)量表達(dá)柑橘CsMYB3能有效抑制AtCHS、AtF3H、AtDFR和AtANS等花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，并最終影響氮缺失條件下花青素的積累［27］。在低氮條件下，擬南芥tt3（DFR）突變體表現(xiàn)出非常低的存活率，說(shuō)明花青素對(duì)擬南芥耐低氮脅迫至關(guān)重要［1］。過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因PAP1，能夠顯著提高PAL1，C4L，CHS，F(xiàn)3`H，F(xiàn)3H，DFR，ANS和GT的 表 達(dá)［28］?；ㄇ嗨氐暮铣沙耸艿組BW的調(diào)控外，還受到花青素合成負(fù)調(diào)控因子LBD（lateral organ boundary domain，LBD）37，LBD38和LBD39的調(diào)控［4］。增施氮素，能夠激活LBD37，LBD38和LBD39基因的表達(dá)，花青素合成被抑制。

土壤中能夠被植物直接吸收利用的氮素主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。目前研究更多的是不同濃度的硝態(tài)氮對(duì)花青素合成的影響。相對(duì)于硝態(tài)氮而言，銨態(tài)氮對(duì)植物花青素的影響研究較少，且其研究結(jié)果還因植物不同而出現(xiàn)對(duì)花青素合成產(chǎn)生不一樣的效果［5，13-14］。本研究通過(guò)木薯品種Arg7在缺氮MS培養(yǎng)基中添加不同氮素濃度和形態(tài)處理后發(fā)現(xiàn)，該品種花青素的產(chǎn)生只受到氮素濃度而非形態(tài)影響，并且花青素的產(chǎn)生和積累與氮素濃度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

在擬南芥中，氮素受到限制或者在氮饑餓生長(zhǎng)條件下，葉綠體含量降低，葉片中花青素含量增加，并且促進(jìn)根特別是側(cè)根的生長(zhǎng)［29］。在本實(shí)驗(yàn)中，木薯品種Arg7在低濃度的氮素生長(zhǎng)條件下，花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平升高，花青素含量增加，葉片由黃變白，根和地上部分生長(zhǎng)都受到抑制，與玉米B73的研究結(jié)果比較相似［14］。

花青素能夠在非生物脅迫條件下被誘導(dǎo)產(chǎn)生和積累，對(duì)于提高應(yīng)對(duì)不利脅迫環(huán)境的生存能力極其重要。花青素的這種可視化生理現(xiàn)象在擬南芥中已經(jīng)作為氮缺乏等營(yíng)養(yǎng)不足的一種代謝標(biāo)記［3］，這種標(biāo)記也為我們?cè)趯?shí)驗(yàn)可控條件下研究木薯在生長(zhǎng)過(guò)程中花青素產(chǎn)生和積累所需要的最大氮素濃度閾值提供了可能。我們后續(xù)目標(biāo)主要集中在研究這種最大氮素濃度閾值與木薯產(chǎn)量之間的相關(guān)性。如果木薯產(chǎn)量（木薯塊莖）在這種氮素濃度下與常規(guī)栽培條件下的產(chǎn)量沒(méi)有顯著性差異，就可以在栽培中利用花青素作為一個(gè)需肥可視生理指標(biāo)用于指導(dǎo)實(shí)踐。當(dāng)然，花青素的產(chǎn)生受到多種脅迫（氮素脅迫，磷脅迫，光脅迫，低溫脅迫，干旱脅迫等自然環(huán)境非生物脅迫）影響，要利用花青素在栽培上作為一個(gè)可靠的可視生理指標(biāo)，還需要對(duì)影響花青素合成的主要脅迫因子進(jìn)行詳細(xì)研究，在實(shí)驗(yàn)可控條件下分別闡明影響花青素產(chǎn)生的最大閾值，建構(gòu)木薯最優(yōu)栽培模型并應(yīng)用于生產(chǎn)，從而為木薯在未來(lái)栽培過(guò)程中減施增效提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

木薯品種Arg7幼苗植株中花青素的誘導(dǎo)表達(dá)和積累只與氮素濃度相關(guān)，而與氮素形態(tài)無(wú)關(guān)。