趙林艷 官會(huì)林 向萍 李澤誠(chéng) 柏雨龍 宋洪川 孫世中 徐武美

（1. 云南師范大學(xué) 高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測(cè)研究站，昆明 650500；2. 西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境修復(fù)與健康研究院，昆明 650224；3. 昆明英武農(nóng)業(yè)科技有限公司，昆明 650500）

白及（Bletilla striata）為蘭科白及屬多年生草本植物，具有收斂止血、消腫生肌等功效，常用于咳血吐血、外傷止血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、燙灼傷、肛裂等疾?。?］。我國(guó)有4種白及屬植物，其分布區(qū)北起江蘇、河南，南至我國(guó)臺(tái)灣，東起浙江，西至西藏東南部。白及人工種植區(qū)主要位于云南、貴州、四川等地，其中云南種植面積最大，約占全國(guó)種植面積的42%［2-3］。隨著白及種植年限的增加，土壤致病菌的積累也相應(yīng)增加，植物病害較為嚴(yán)重，特別是根腐病，以植物地下部分腐爛為特征，具體表現(xiàn)為塊莖呈水漬狀腐爛，隨后擴(kuò)散至根部，使其發(fā)黑壞死，葉片出現(xiàn)褐色長(zhǎng)型枯斑，最終導(dǎo)致全株枯死［4］，嚴(yán)重影響白及產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益。

根腐病是根莖類(lèi)藥用植物栽培過(guò)程中的一類(lèi)高發(fā)病害，其致病因素較為復(fù)雜。病原真菌被認(rèn)為是導(dǎo)致根腐病的主要原因之一［5］。廖作清等［6］研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、惡疫霉病菌（Phytophthora cactorum）等病原真菌可引起三七根腐??；畢武等［7］發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌、人參銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）等會(huì)導(dǎo)致西洋參根腐病。已有研究證實(shí)有絲核菌屬（Rhizoctonia）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可導(dǎo)致白及根腐?。?-9］，但尚未發(fā)現(xiàn)更多與白及根腐病相關(guān)的病原微生物。

根際微生物群落組成特征對(duì)作物營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)與抗病害等均具有重要影響［10-11］。根際微生物多樣性、相對(duì)豐度與植物病害有著密切關(guān)聯(lián)性［12-13］，如黃芪根際土壤細(xì)菌群落多樣性降低會(huì)加重根腐病害，且在發(fā)病黃芪根際土壤中有益微生物豐度也呈下降趨勢(shì)［14］。同樣，大蒜根腐病發(fā)病土壤中細(xì)菌多樣性降低，鐮刀菌屬（Fusarium）和匍柄霉菌屬（Stemphylium）等病原真菌相對(duì)豐度增加，而硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、木霉屬（Trichoderma）等有益微生物相對(duì)豐度降低［15］。Wu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，根腐三七根際土壤微生物群落與健康植株相比有明顯差異，其中患病三七根際土壤中放線菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、叢枝菌根真菌等的相對(duì)豐度顯著降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)西洋參根腐病株根際土壤真菌豐度顯著低于健康植株，且紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、Kaistobacter、鞘脂菌屬（Sphingobium）等的相對(duì)豐度與西洋參根腐病害呈正相關(guān)［17-18］。然而，針對(duì)白及根腐病植株根際土壤微生物群落組成特征相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了白及根腐病與健康植株根際土壤微生物群落組成與變化特征，并對(duì)土壤理化性質(zhì)與酶活性進(jìn)行了定量分析，旨在為了解白及根腐病發(fā)病機(jī)理，科學(xué)應(yīng)對(duì)白及根腐病害，提高白及產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白及根際土壤樣品采自位于昆明市呈貢新區(qū)的昆明英武農(nóng)業(yè)科技有限公司科研基地，土壤類(lèi)型為旱地紅壤，白及連作8年。白及品種為廣泛栽種的三叉白及，產(chǎn)量高、具有較強(qiáng)的耐寒性，其田間種植密度為50株/m2。按照隨機(jī)均衡原則，在科研基地內(nèi)選擇已移栽2年的根腐發(fā)病和健康白及各5株，利用無(wú)菌試管采集粘附在根莖上的土壤，隨即保存于-80℃超低溫冰箱，用于微生物群落分析，并采集距離根莖3 cm內(nèi)的土樣，去除石礫、殘根等雜物，自然風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)與酶活性分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA的提取與高通量測(cè)序 稱(chēng)取1 g白及根際土壤，用DNA提取試劑盒（NucleoSpin Kit，Macherey-Nagel GmbH，Germany）提取樣品總DNA。使 用 引 物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） 對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì) 真 菌ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用AMPure XP試 劑 盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)（Promega，USA）進(jìn)行純化和定量，利用Illumina HiSeq 2500 PE250進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)與酶活性的測(cè)定 土壤自然風(fēng)干后研磨過(guò)20目和100目篩，分別用于理化性質(zhì)和酶活性的測(cè)定。土壤理化性質(zhì)的測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)化分析》［19］：土壤pH使用pH計(jì)（雷磁PHS-25）測(cè)定；電導(dǎo)率使用EC計(jì)（COMBI 5000）測(cè)定；氨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）含量使用連續(xù)流動(dòng)分析儀（Seal Analytical AA3）測(cè)定；有效磷（AP）含量使用鉬銻抗比色法，結(jié)合紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（元析UV-8000）測(cè)定；有效鉀（AK）含量使用連續(xù)流動(dòng)火焰分光光度計(jì)（AA3，Model 410）測(cè)定；有機(jī)質(zhì)含量使用濃硫酸-重鉻酸鉀溶液消解法，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。土壤脲酶和蔗糖酶活性，分別用3，5-二硝基水楊酸比色法與靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定［20］；磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測(cè)定［21］；蛋白酶活性用茚三酮比色法進(jìn)行測(cè)定［22］。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用FLASH V1.2.7［23］和Trimmomatic［24］軟件對(duì)Illumina HiSeq雙端測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接與過(guò)濾，使用UCHIME v4.2［25］去除嵌合體，并用UPARSE［26］軟件按97%的序列相似性獲得OTU（operational taxonomic units）。使用RDP軟件以細(xì)菌16S rRNA Silva數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.arb-silva.de）和真菌ITS UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（https://unite.ut.ee/）為參照對(duì)不同OTU的代表性序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。使用MOTHUR［27］軟件計(jì)算各土樣微生物OTU豐富度、Chao1與Shannon多樣性指數(shù)。

基于Bray-Curtis距離指數(shù)在OTU分類(lèi)水平進(jìn)行不同微生物群落的UPGMA聚類(lèi)分析，并利用冗余分析（RDA）探索健康與根腐白及根際土壤微生物群落的分化。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同土壤因子的差異顯著性。以上分析利用R軟件包“vegan”［28-29］與SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 根腐病對(duì)白及根際微生物群落組成的影響

門(mén)水平上，Ascomycota和Mortierellomycota為白及根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群，在發(fā)病組中的占比為73.43%和11.78%（表1），Ascomycota相對(duì)豐度顯著高于健康組（40.92%），而Mortierellomycota相對(duì)豐度顯著低于健康組（42.50%）。Proteobacteria和Bacteroidetes為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群，在發(fā)病組中的占比分別為24.71%和28.24%，在健康組中的占比分別為28.36%和22.57%，無(wú)顯著差異。屬水平上，發(fā)病組Fusarium、Erysiphe等真菌的相對(duì)豐度顯著高于健康組，而Microscypha、Hannaella等真菌的相對(duì)豐度顯著降低（圖1）。發(fā)病組中，Akkermansia、IMCC26134與Larkinella等細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著低。

圖1 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物屬分類(lèi)水平的相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundance of rhizospheric microorganisms at the genus level in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

表1 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物門(mén)水平的相對(duì)豐度Table 1 Relative abundance of microorganisms at the phylum level in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

2.2 根腐病對(duì)白及根際微生物群落alpha多樣性的影響

原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過(guò)濾與嵌合體檢測(cè)，并按97%的序列相似性進(jìn)行劃分，共得到真菌OTU 924個(gè)，隸屬于9門(mén)、24綱、60目、120科、207屬與214種，得到細(xì)菌OTU 1 690個(gè)，隸屬于25門(mén)、65綱、139目、227科、451屬與476種。根腐白及根際土壤中特有真菌和細(xì)菌的OTU數(shù)為 82和1個(gè)，而健康植株根際土壤特有真菌和細(xì)菌的OTU數(shù)為18和2個(gè)（圖2），表明與健康植株相比較，根腐白及根際土壤真菌群落差異較大，而細(xì)菌群落組成差異相對(duì)較小。根腐白及根際土壤真菌OTU豐富度顯著高于健康植株，而細(xì)菌OTU豐富度無(wú)顯著差異，表明白及患根腐病后，真菌alpha多樣性呈升高趨勢(shì)（表2）。

表2 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物群落alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity of microbial community in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

圖2 白及根腐病和健康植株根際土壤共有和特有的OTU數(shù)量Fig. 2 Numbers of shared and unique OTUs in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

2.3 根腐病對(duì)白及根際微生物群落beta多樣性的影響

UPGMA聚類(lèi)分析表明，發(fā)病組與健康組土壤真菌和細(xì)菌群落具有明顯聚類(lèi)特征（圖3-a，c），冗余分析表明，發(fā)病組與健康組真菌群落在第二排序軸具有明顯的分化特征（圖3-b），而細(xì)菌群落在第一排序軸具有明顯的分化特征（圖3-d）；與細(xì)菌群落相比較，真菌群落分化更明顯。

圖3 基于聚類(lèi)與冗余分析的白及根腐病和健康植株根際土壤微生物群落差異特征Fig. 3 Differences in the rhizospheric soil microbial community of root-rot and healthy B.striata based on clustering and redundancy analyses

2.4 白及根腐病和健康植株根際土壤理化性質(zhì)與酶活性

與健康植株相比較，白及根腐病植株根際土壤有效鉀含量較低，pH、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量較高（P＜0.05），而有效磷含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；土壤脲酶、蛋白酶和蔗糖酶的活性較低。因此，土壤養(yǎng)分失衡、酶活性降低可能促進(jìn)了白及根腐病的發(fā)生（表3）。

表3 白及根腐病和健康植株根際土壤理化性質(zhì)與酶活性Table 3 Physicochemical properties and enzyme activities in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B.striata

3 討論

土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和肥力維持等方面發(fā)揮著重要作用，且對(duì)植物健康生長(zhǎng)具有直接或間接的影響［30-31］。土壤微生物群落組成特征在一定程度上反映了土壤健康狀況，當(dāng)土壤中病原微生物大量生長(zhǎng)，有益微生物數(shù)量減少時(shí)，常引起作物病害的發(fā)生［32-33］。在本研究中，白及根腐病植株根際土壤Fusarium、Erysiph等菌群相對(duì)豐度顯著增加，且與健康植株相比較，真菌和細(xì)菌群落具有明顯的分化特征，表明白及根腐病的發(fā)生與土壤微生物群落組成變化密切相關(guān)。

土壤中存在著大量植物病原真菌，F(xiàn)usarium可引起白及、三七、西洋參等根莖類(lèi)藥用植物發(fā)生根腐?。?-9］，且這些藥用植物根腐病的發(fā)生伴隨著土壤Fusarium豐度的快速增加。如Dong等［34］研究發(fā)現(xiàn)，三七根腐病致病菌F. oxysporum豐度與三七死亡率呈顯著正相關(guān)，Zhao等［35］研究發(fā)現(xiàn)太子參連作后，根腐病發(fā)病土壤中F. oxysporum豐度顯著高于健康組。本研究發(fā)現(xiàn)，白及發(fā)病土壤中Fusarium豐度顯著升高，可能是引起其根腐病的重要原因。此外，Erysiph豐度也顯著升高，其已證實(shí)是引起多種植物白粉病的關(guān)鍵致病菌［36-37］。同樣，土壤中還存在著許多具有良好生防潛力的有益微生物，如Hannaella coprosmaensis、Subramaniula cristata等可作為生防菌，抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)［38-39］，Larkinella bovis具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能［40］。此外，生防菌在土壤中的相對(duì)豐度與植物發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)［41］，Liu等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在西洋參連作土壤中施加有益微生物叢枝菌根真菌可顯著降低F. oxysporum、F. solani等病原真菌的豐度，并有效促進(jìn)西洋參生長(zhǎng)。Zhang等［43］在三七根腐病株根部接種益生菌后，根際土壤中病原菌的相對(duì)豐度顯著降低，并降低了三七的死亡率。在本研究中，白及根腐病植株根際土壤Microscypha、Hannaella等真菌，以及Akkermansia，IMCC26134，Larkinella等細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著降低，但其與白及根腐病的關(guān)聯(lián)性尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)健康白及根際土壤脲酶、蛋白酶與蔗糖酶活性和有效鉀含量較高，pH、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量較低。已有研究表明，隨著白及種植年限的增加，土壤pH升高，有機(jī)質(zhì)含量增加，土壤脲酶和蔗糖酶活性降低［44］，這與本研究結(jié)果相似，表明白及連作可能會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡，酶活性降低。土壤養(yǎng)分失衡會(huì)影響微生物群落組成，營(yíng)養(yǎng)元素富集可促使病原微生物數(shù)量增加，從而導(dǎo)致植物病害率上升［33，45］。在本研究中，冗余分析表明根腐病組與健康組微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯分化特征，根腐病組具有更高的NH4+-N和NO3--N含量。研究表明，土壤中NH4+-N含量是影響植物根際微生物群落組成的重要因素，常與病原菌豐度呈正相關(guān)［46］。當(dāng)土壤中氮含量較低時(shí)，小麥根腐病發(fā)病率顯著降低，且與鐮刀菌數(shù)量的減少密切相關(guān)［47］。Zhao等［48］研究發(fā)現(xiàn)，施用煙稈炭改善了白及連作土壤理化性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了連作地白及的生長(zhǎng)。因此，土壤養(yǎng)分失衡與酶活性降低也可能促進(jìn)白及根腐病害的發(fā)生。本研究為理解白及根腐病發(fā)病機(jī)理并針對(duì)性地開(kāi)展防治措施提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

病原菌積累、微生物群落結(jié)構(gòu)變化、土壤養(yǎng)分失衡與酶活性降低可能是導(dǎo)致白及根腐病害的主要原因，可采取有效措施抑制鐮刀菌、白粉菌等致病菌群的生長(zhǎng)，改良土壤理化環(huán)境與微生物群落結(jié)構(gòu)，從而消減白及根腐病害。