時雅倩 申亞茹 陳漫影 何淑敏 劉予涵 何天楠 陳清西 文志豐

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州350002）

草 莓（Fragaria ananassaDuch.）為 薔 薇 科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria），多年生草本植物，其果實(shí)為漿果，含有豐富的鞣花酸、花青素、槲皮素，抗壞血酸和葉酸等，有很高的營養(yǎng)價值和保健價值［1］。栽培草莓具備良好的經(jīng)濟(jì)價值和經(jīng)濟(jì)效益，近年來，我國草莓栽培面積逐年增加，2018年草莓栽培面積達(dá)到173 333 hm2，總產(chǎn)量為500萬t，均居世界第一位［2］。然而，草莓病害是制約草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。草莓生產(chǎn)中常見的病害有根腐病、灰霉病、炭疽病、白粉病等，其中，草莓炭疽病的危害較為嚴(yán)重，可在短時間內(nèi)對草莓產(chǎn)業(yè)造成毀滅性的危害。我國是野生草莓資源最為豐富的國家，世界草莓屬約24個種，我國自然分布14個種［2-3］，野生草莓因具有特殊風(fēng)味、香氣、抗病蟲害和較寬的遺傳背景等特點(diǎn)而被利用到草莓遺傳育種中，挖掘野生草莓的優(yōu)良性狀基因?qū)氲皆耘嗥贩N中日益受到育種者的重視［4］。

黃毛草莓（F. nilgerrensis）是野生二倍體草莓，原產(chǎn)于我國，廣泛分布于云南、貴州、四川等西南地區(qū)，其果實(shí)具有獨(dú)特的蜜桃香味，植株健壯，具有抗旱、抗寒和抗炭疽病等特點(diǎn)，其獨(dú)特果香和較強(qiáng)的抗逆性，使之成為拓寬栽培草莓遺傳背景的重要遺傳資源［5］。因此，挖掘黃毛草莓抗炭疽病基因，研究其抗炭疽病機(jī)理，通過基因工程及育種手段提高栽培草莓對炭疽病的抗性具有重要意義。

F-box蛋白在真核生物中廣泛存在，是SCF（Skp/Cullin/F-box）復(fù)合體中泛素連接酶E3的關(guān)鍵組分，通過泛素化途徑介導(dǎo)參與了許多重要的生命進(jìn)程，因最初被發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞周期蛋白Cyclin F而得名［6-7］。F-box蛋白在植物體多種代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、花器官發(fā)育、植物自交不親和以及對植物抗逆中的響應(yīng)等［8-10］。植物F-box蛋白可以通過介導(dǎo)泛素化降解逆境相關(guān)蛋白來調(diào)控植物逆境反應(yīng)［9］，其在抵御生物和非生物逆境脅迫中的作用日益得到廣泛關(guān)注［10］。Kim等［11］研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）son1缺失突變體增強(qiáng)了對霜霉菌（Peronospora parasitica）和丁香假單胞菌（Pseudomonas syringaepv. Tabaci）的抗性。Cao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在煙草中過表達(dá)水稻OsDRF1，可以增強(qiáng)煙草對番茄花葉病毒（ToMV-S1）和丁香假單胞菌（PstDC3000）的抗性。番茄ACIF1可以增強(qiáng)其對黃萎?。╒erticillium dahliae）的抗性［13］。Maldonado-Calderón等［14］以菜豆懸浮細(xì)胞為材料，分離獲得PvFBS1，并發(fā)現(xiàn)在菜豆受滲透脅迫、多種激素誘導(dǎo)及接種丁香假單胞菌（PstDC3000）后PvFBS1表達(dá)上調(diào)。Li等［15］在棉花中分離到一個F-box蛋白基因GhACF1，在擬南芥中過表達(dá)此基因可提高其植株的抗病性；相反，沉默此基因可使棉花更易感大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）。以上研究表明，F(xiàn)-box蛋白在植物響應(yīng)生物脅迫中起著十分重要的作用。

迄今為止，F(xiàn)-box蛋白基因響應(yīng)病原菌侵染及其抗病功能研究主要集中在模式植物擬南芥上，在園藝作物上的研究較少，關(guān)于F-box基因參與草莓抗病的相關(guān)報道更少。研究顯示，草莓F-box基因是兩類新miRNA的潛在靶標(biāo)基因［16］。通過轉(zhuǎn)錄組測序從黃毛草莓中篩選到一個受膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的F-box蛋白基因，推測其在黃毛草莓響應(yīng)病原菌脅迫中發(fā)揮了重要功能。

本研究采用同源克隆法克隆F-box蛋白基因的cDNA（命名為FnFBOX1）和啟動子序列（命名為pFnFBOX1），分析其序列結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建FnFBOX1啟動子融合GUS載體，并在煙草中驗(yàn)證啟動子活性。通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析抗病黃毛草莓和感病‘妙香 3’草莓在受膠孢炭疽菌脅迫和外施SA下FBOX1的表達(dá)水平，為黃毛草莓FnFBOX1抗炭疽病功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料：黃毛草莓（F. nilgerrensis）和‘妙香 3’草莓，栽植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院果樹抗病與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室人工氣候室，培養(yǎng)條件為：（20±1）℃，濕度80%，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為120 μmol/（m2·s）。草莓膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）菌株（FZ-1）由福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院果樹抗病與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存［17］。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子消毒后，播種于MS固體培養(yǎng)基（Murashige and Skoog Media）中，待種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，獲得無菌煙草植株。

主要試劑：植物總RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。PCRTaqmix購自弗森斯（北京）科技有限公司。DNA marker購自北京全式金生物科技有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α細(xì)胞、pMDTM20-T、各種限制性內(nèi)切酶、LATaq、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa寶生物（大連）有限公司。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司（福州）合成。pC0380∷GUS、pCaMV35S∷GUS和SA母液均為福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院果樹抗病與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 黃毛草莓接種膠孢炭疽菌和外源SA處理 膠孢炭疽菌處理：選取生長健壯，長勢一致的黃毛草莓盆栽植株在人工氣候箱進(jìn)行試驗(yàn)處理。將膠孢炭疽菌的菌餅在PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，收集菌液，制成1×106個/mL的孢子懸浮液體，4℃保存?zhèn)溆?，噴施前加?.2% Tween-20。采用噴霧法接種草莓葉片，對照組噴施無菌水。接種后，將植株置于25℃、14 h光照/10 h黑暗、80%濕度條件下培養(yǎng)，每組處理6株盆栽草莓，設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)。采集接種0、6、12、24、48和72 h后的草莓葉片，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

外源SA處理：將SA（濃度100 μmol /L）均勻地噴施在生長健壯、長勢一致的黃毛草莓盆栽植株上（噴施葉片正反面，以葉片濕潤不滴水為宜），以噴施無菌水為對照，每組SA處理6株盆栽草莓，設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)。采集處理0、3、6、12、24和48 h后的草莓葉片，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃毛草莓FnFBOX1的克隆 參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取黃毛草莓總RNA，使用NanoDropTM2000分光光度計（Thermo Fisher公司，美國）檢測RNA的質(zhì)量和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 5.0設(shè)計PCR擴(kuò)增引物（表1）。PCR擴(kuò)增體系為LAtaq0.25μL、10× LA PCR Buffer II（Mg2+plus）2.5 μL、dNTP Mixture 4 μL、模板cDNA 2 μL、引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 2 min，32個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用膠回收試劑盒（天根）純化目的條帶，并連接至pMDTM20-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個陽性克隆菌株送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司（福州）進(jìn)行測序。

表1 PCR引物信息Table 1 Information for PCR primers

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預(yù)測FnFBOX1編碼的氨基酸序列。將預(yù)測的FnFBOX1氨基酸序列使用NCBI protein BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行氨基酸相似性比較。使用DNAMAN 7.0進(jìn)行相似性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用在線 網(wǎng) 站ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）計算FnFBOX1編碼蛋白的分子量及等電點(diǎn)。利用SOPMA（http://pbil.ibcp.fr/）在線工具對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用PlantCARE在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子的順式作用元件。

1.2.4 黃毛草莓FnFBOX1的亞細(xì)胞定位 使用含有Hind III和X-bal的特異性引物FnFBOX1-YFP-F和FnFBOX1-YFP-R（表1）擴(kuò)增FnFBOX1的ORF區(qū)域，并將產(chǎn)物克隆到pYFPc載體中。對所構(gòu)建的融合載體通過測序進(jìn)行確認(rèn)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS IX83-FV3000）觀察洋蔥表皮中YFP熒光反應(yīng)。

1.2.5 黃毛草莓FnFBOX1啟動子的克隆 根據(jù)森林草莓基因組FvBOX1設(shè)計啟動子擴(kuò)增引物（P-FnFBOX1-F和P-FnFBOX1-R），以黃毛草莓葉片基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件、體系及后續(xù)克隆步驟參照1.2.2。利用PlantCARE對啟動子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)啟動子測序結(jié)果，設(shè)計帶有BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)引物（P-FnFBOX1-GUS-F和P-FnFBOX1-GUS-R）。以測序正確并含有啟動子片段的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的啟動子片段克隆到pMDTM20-T克隆載體，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒。使用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切后，回收片段，并與已用BamH I和Hind III雙酶切的GUS融合載體pC0380∷GUS進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用菌液PCR檢測陽性克隆，并用BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證陽性克隆后，隨機(jī)挑選5個陽性克隆菌株送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司（福州）合成進(jìn)行測序。將測序正確的菌株采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.6 GUS活性組織化學(xué)染色分析與GUS活性測定 配制含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌重懸液，通過抽真空法使農(nóng)桿菌侵染到煙草葉片中。取上述葉片放入新鮮配制的X-Gluc染色液中，37℃保溫過夜。待充分染色后，用75%（體積比）乙醇脫色2-3次，直到葉片綠色全部褪去，記錄拍照［18］。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次使用10片煙草葉片。

將pFnFBOX1∷GUS和pCaMV35S∷GUS農(nóng)桿菌重懸液通過葉片背面注射轉(zhuǎn)入煙草葉片中，25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d，均取0.1 g瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片于1.5 mL離心管中。用濃度為1×106個/mL的炭疽菌孢子懸浮液采用噴霧法接種已轉(zhuǎn)入pFnFBOX1∷GUS質(zhì)粒的煙草葉片，在接種12 h時取0.1 g瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片于1.5 mL離心管中；用濃度為100 μmol /L的SA溶液通過葉片噴施的方法處理已轉(zhuǎn)入pFnFBOX1∷GUS質(zhì)粒的煙草葉片，在處理24 h時取0.1 g瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片于1.5 mL離心管中，均在液氮中磨碎，采用磷酸緩沖液法提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定樣品蛋白質(zhì)含量；用分光光度法檢測各樣品中GUS酶活力，并計算GUS酶活值［19］。

1.2.7 黃毛草莓FnFBOX1的實(shí)時熒光定量分析 根據(jù)克隆測序結(jié)果，設(shè)計特異性引物（FnFBOX1-F1和FnFBOX1-R1），以草莓Actin（GenBank登錄號：AB116565）為內(nèi)參，按照RR820A SYBRPremix-ExTaqTMII試劑盒（大連，TaKaRa公司）說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green I、上游引物0.5 μL、下游引物 0.5 μL、cDNA模板1 μL，dd H2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，42個循環(huán)。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，采用2-△△CT方法［20］計算FnFBOX1的相對表達(dá)量，并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 黃毛草莓FnFBOX1的克隆與生物信息學(xué)分析

以接種病原菌黃毛草莓總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，克隆到1條約1 200 bp的條帶（圖1），經(jīng)測序，該序列長度為1 227 bp（GenBank登錄號：MN709780），編碼408個氨基酸，其氨基酸序列的N端36-73個氨基酸處包含一段由38個氨基酸構(gòu)成的F-box結(jié)構(gòu)域（圖1），屬于F-box類型基因。利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預(yù)測FnFBOX1蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，F(xiàn)nFBOX1蛋白的分子式為C2079H3167N549O602S22，相對分子質(zhì)量為46 189.65 kD，理論等電點(diǎn)為6.11；氨基酸組分中含有較高的亮氨酸（10.80%）和絲氨酸（10.50%）。帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為41，正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為35，說明該蛋白帶正電荷。親水性平均值為-0.155，為親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為60.73，屬于不穩(wěn)定性蛋白。

這時候，他們的頭頂上已經(jīng)傳來鯤鼓翼的聲音。他們抬頭去看，宇晴師父坐在鵬背上，向他們俯沖過來，李離、上官星雨、袁安三人雙足往山路上一點(diǎn)，衣袂飄飄，身形如箭，向鯤鵬的翅背間跳丸飛彈般射來。正是宇晴指點(diǎn)他們練成的“點(diǎn)墨山河”擊水兮萬里，縱翼兮排云，輕功之俊賞，與當(dāng)日宇晴在黃梁驛見到時，已經(jīng)是天差地別，宇晴不由得心里一暖。

圖1 黃毛草莓FnFBOX1的PCR擴(kuò)增圖Fig. 1 Electropherogram of PCR product for FnFBOX1 gene in F. nilgerrensis

利用SOPAM在線軟件預(yù)測FnFBOX1蛋白二級結(jié)構(gòu)，主要由無規(guī)卷曲（random coil，46.93%）、延 伸 鏈（extended strand，32.9%）、α螺 旋（alpha helix，15.48%）和少量的β轉(zhuǎn)角（beta turn，4.67%）組成（圖2-A），并預(yù)測該蛋白存在信號肽序列（圖2-B）。

圖2 黃毛草莓FnFBOX1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（A）與信號肽預(yù)測（B）Fig. 2 Prediction of secondary structure of FnFBOX1 protein in F. nilgerrensis（A）and signal peptide prediction（B）

2.2 黃毛草莓FnFBOX1氨基酸序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找并下載FnFBOX1氨基酸同源序列，在DNAMAN 7.0軟件上進(jìn)行氨基酸同源性比對，結(jié)果顯示，黃毛草莓FnFBOX1與 森 林 草 莓FvFBOX1（Fragaria vesca，XP_024192373）同源性最高，為95.59%（圖3），與月季（Rosa chinensis，XP_021825170）、櫻桃（Prunusavium，XP_008223808）、蘋果（Malus domestica，XP_008351366）、核桃（Juglans regia，XP_018807-608）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010050919）、甜橙（Camellia sinensis，XP_028054565）、可可（Theobroma cacao，EOY22796）、木 薯（Manihot esculenta，XP_021634763）的氨基酸序列同源性分別為87.70%、67.16%、66.84%、55.44%、53.44%、50.87%、50.00%和42.00%，這些序列在F-box結(jié)構(gòu)域中有較高的相似性。進(jìn)一步利用DNAMAN 7.0軟件的鄰位相連技術(shù)法對黃毛草莓和其他9種植物的FBOX1蛋白進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖4）顯示，黃毛草莓FnFBOX1氨基酸序列與森林草莓（XP_024192373）聚為一類，表明它們的親緣關(guān)系最近；與月季花（XP_021825170）、蘋果（XP_008351366）和櫻桃（XP_008223808）親緣關(guān)系次之，它們同屬于薔薇科；與木薯、巨桉等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此可見，黃毛草莓FnFBOX1與其他植物一樣，在進(jìn)化上較保守。

圖3 黃毛草莓FnFBOX1與其他植物氨基酸序列的比對和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 Alignment of FnFBOX1 in F. nilgerrensis with other plant amino acid sequences and analysis of conserved domains

圖4 黃毛草莓FnFBOX1和其他植物FBOX1序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of FnFBOX1 in F. nilgerrensis with FBOX1 of other plant species

2.3 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得陽性菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后將其制成懸浮液，以空載作為對照，在洋蔥進(jìn)行瞬時表達(dá)。48 h后，將洋蔥表皮制成玻片，并在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。如圖5所示，陽性對照35∷YFP在整個細(xì)胞中均能觀察到綠色熒光；目的基因融合表達(dá)載體只在細(xì)胞核中觀察到綠色熒光，故推測其定位于細(xì)胞核中。

圖5 FnFBOX1在洋蔥表皮中亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of FnFBOX1 in onion epidermis

2.4 黃毛草莓FnFBOX1啟動子的克隆和生物信息學(xué)分析

以黃毛草莓基因組DNA為模板，利用引物P-FnFBOX1-F和P-FnFBOX1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長約為800 bp片段（圖6）。經(jīng)測序，片段長度為821 bp，命名為pFnFBOX1（GenBank登錄號：MN709783）。利用PlantCARE預(yù)測啟動子的順式作用元件，結(jié)果顯示，pFnFBOX1啟動子序列含有多個TATA-box（核心啟動子元件），CAAT-box（啟動子和增強(qiáng)子區(qū)的作用元件）；含有多個光響應(yīng)元件，如GATA-motif、G-Box、I-box和TCT-motif等順式作用元件；脫落酸響應(yīng)元件ABRE、含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif元件、赤霉素響應(yīng)元件TATC-box、傷害誘導(dǎo)和防御元件WUNmotif和MYC、TC-rich repeats逆境脅迫響應(yīng)元件等（圖7）。說明黃毛草莓啟動子pFnFBOX1能響應(yīng)多種信號誘導(dǎo)（如光、激素、逆境脅迫等），可能在響應(yīng)逆境脅迫中起重要作用。

圖6 黃毛草莓FnFBOX1啟動子的PCR擴(kuò)增Fig. 6 PCR product of pFnFBOX1 in F. nilgerrensis

圖7 黃毛草莓FnFBOX1上游啟動子pFnFBOX1序列及預(yù)測的順式作用元件Fig. 7 Sequence and cis-elements in the promoter of FnFBOX1 gene in F. nilgerrensis

2.5 黃毛草莓pFnFBOX1啟動子GUS融合載體的構(gòu)建

以含有pFnFBOX1啟動子序列的質(zhì)粒為模板，利用啟動子融合GUS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，連接pMDTM20-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR檢測陽性克隆，并用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切后，與已用BamH I和Hind III雙酶切的pC0380∷GUS線性載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR檢測陽性克隆，并用BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證陽性克隆（圖8-C）。并對陽性克隆菌株進(jìn)行測序，結(jié)果顯示與預(yù)期構(gòu)建序列一致，成功構(gòu)建啟動子融合GUS表達(dá)載體pFnFBOX1∷GUS。

2.6 GUS蛋白染色及活性檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲透法將pFnFBOX1∷GUS融合載體轉(zhuǎn)入到煙草葉片中，同時轉(zhuǎn)化pCaMV35S∷GUS和pC0380∷GUS載體分別作為陽性對照和陰性對照，暗培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pCaMV35S∷GUS陽性對照煙草葉片具有很深的藍(lán)色（圖9-A），轉(zhuǎn)pC0380∷GUS陰性對照煙草葉片沒有藍(lán)色（圖9-B），轉(zhuǎn)pFnFBOX1∷GUS煙草葉片有藍(lán)色，但沒有陽性對照葉片顏色深（圖9-C），試驗(yàn)證明pFnFBOX1具有驅(qū)動下游基因轉(zhuǎn)錄的活性。采用葉片背面注射法將pFnFBOX1∷GUS融合載體轉(zhuǎn)入到煙草葉片中，同時轉(zhuǎn)化pCaMV35S∷GUS載體作為陽性對照，暗培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行GUS活性測定。結(jié)果顯示，接種膠孢炭疽菌和噴施SA處理后，pFnFBOX1∷GUS煙草葉片的GUS活性與未處理前相比明顯增強(qiáng)，但沒有陽性對照的GUS活性強(qiáng)（圖9-D）。結(jié)果表明，膠孢炭疽菌和SA可促進(jìn)FnFBOX1啟動子啟動的GUS活性的提高。

圖9 黃毛草莓啟動子pFnFBOX1∷GUS載體轉(zhuǎn)化煙草后染色圖及GUS酶活測定Fig. 9 Staining and GUS activity after pFnFBOX1∷GUS vector transformed into tobacco

2.7 黃毛草莓中FnFBOX1組織表達(dá)模式及病原菌、SA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)

通過對接種膠孢炭疽菌黃毛草莓葉片中FnFBOX1的qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，在接種0-72 h后呈先升高后降低，再升高后降低的變化趨勢，在0-12 h接種后，表達(dá)顯著上調(diào)，接種12 h表達(dá)量最高，達(dá)到了接種0 h的6.3倍，此后表達(dá)量有所下降，而對照（接種無菌水）表達(dá)變化差異不顯著（圖10-A）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)nFBOX1響應(yīng)膠孢炭疽菌脅迫，其表達(dá)先上調(diào)后下降是黃毛草莓對病原菌的一種防御反應(yīng)，對黃毛草莓協(xié)助防御病原菌侵染，提高抗性水平可能起一定的調(diào)控作用。外施SA后，通過qRT-PCR檢測黃毛草莓葉片F(xiàn)nFBOX1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在接種6、12、24和48 h后，F(xiàn)nFBOX1表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低，再升高再降低的表達(dá)模式，在SA處理24 h后達(dá)到最高，為0 h的7.9倍；處理24-48 h時，F(xiàn)nFBOX1表達(dá)有所降低，但仍顯著高于對照（圖10-B）。推測FnFBOX1可能通過SA信號分子途徑參與到黃毛草莓抗炭疽病反應(yīng)。FnFBOX1在黃毛草莓根、匍匐莖、葉片和葉柄中均有表達(dá)，在匍匐莖中表達(dá)量最高，其次是根、葉片，在葉柄中最低（圖10-C）

圖10 不同處理及黃毛草莓不同組織中FnFBOX1的表達(dá)Fig. 10 Expressions of FnFBOX1 after different treatments and in different tissues of F. nilgerrensis

2.8 草莓‘妙香3’接種病原菌和外源SA處理后FBOX1的表達(dá)分析

圖11 ‘妙香3’葉片接種膠孢炭疽菌和SA處理后黃毛草莓FBOX1的表達(dá)Fig. 11 Expressions of FBOX1 in F. nilgerrensis after inoculation with C. gloeosporioides and SA treatment in ‘Miaoxiang 3’leaves

3 討論

F-box蛋白在植物的生長和發(fā)育如葉片衰老［21］、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［22］、生物和非生物逆境脅迫［23-25］及免疫［26］等生命活動中扮演著至關(guān)重要的角色。有研究表明，在歐洲葡萄‘紅地球’中過表達(dá)野生華東葡萄‘白河-35-1’的F-box蛋白基因VpUIFP1增強(qiáng)了對白粉菌（Erysiphe necatorSchw.）的抗性［24］。番茄F-box蛋白基因SlACRE189在識別煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）過程中可調(diào)控細(xì)胞死亡和激活防御反應(yīng)［27］。水稻F-box蛋白基因OsDRF1在煙草中過表達(dá)增強(qiáng)了對番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus）和PstDC3000的抗性，在煙草OsDRF1過表達(dá)植株中，外源SA處理可誘導(dǎo)防御相關(guān)基因的表達(dá)［12］。棉花F-box蛋白基因GhACIF1在擬南芥中過表達(dá)增強(qiáng)了對大麗輪枝孢菌的抗性，而在棉花中沉默GhACIF1增加了對大麗輪枝孢菌易感性［15］。上述研究表明，植物F-box蛋白基因在植物應(yīng)對生物脅迫和免疫過程中發(fā)揮著重要作用。課題組前期從接種膠孢炭疽菌的黃毛草莓中篩選到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的FnFBOX1，推測其在黃毛草莓抗炭疽病中發(fā)揮著重要作用。本研究進(jìn)一步克隆了FnFBOX1的cDNA序列，序列分析顯示：黃毛草莓FnFBOX1編碼的氨基酸與森林草莓和月季的同源性都在87%以上，進(jìn)化樹分析顯示，其與森林草莓和月季聚在同一個小亞類，這3種植物均屬于薔薇科，說明FnFBOX1在進(jìn)化過程中具有一定的保守性，因此，推測其蛋白質(zhì)功能也相似。

F-BOX蛋白基因在植物抗病和免疫過程中扮演著非常重要的角色，很多研究表明，F(xiàn)-BOX蛋白基因在病原菌誘導(dǎo)后，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。野生華東葡萄‘白河-35-1’的F-box蛋白基因VpUIFP1被白粉菌侵染后，VpUIFP1在接種病原菌12 h后表達(dá)達(dá)到最高峰，為對照的5.5倍［24］。小麥F-BOX蛋白基因TaFKOR23在受葉銹菌（Puccinia triticina）侵染后呈現(xiàn)先降低后升高的表達(dá)模式［28］。棉花F-box蛋白基因GhACIF1在接種大麗輪枝孢菌后誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，24 h表達(dá)量達(dá)到最高，為對照的18.0倍［15］。F-box蛋白常通過形成SCF復(fù)合體介導(dǎo)泛素化降解生物脅迫相關(guān)蛋白的機(jī)制調(diào)控植物逆境反應(yīng)，在病原菌脅迫下，F(xiàn)-box 蛋白上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)降解抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，解除抗病反應(yīng)的抑制，啟動抗病反應(yīng)［29］。本研究中通過實(shí)時熒光定量PCR檢測在黃毛草莓和八倍體‘妙香3’草莓中FBOX1在接種膠孢炭疽菌后的表達(dá)水平，F(xiàn)BOX1在2個物種中均在接種6 h后表達(dá)上調(diào)，接種12 h后表達(dá)量達(dá)到最高，分別為對照的6.3和5.7倍，推測接種病原菌12 h后，F(xiàn)BOX1上調(diào)表達(dá)，降解了抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，解除抗病反應(yīng)的抑制，啟動抗炭疽病反應(yīng)。植物抗病信號分析SA廣泛參與活體病原菌和半活體病原菌的抗病反應(yīng)［30-31］，能提高許多病原菌響應(yīng)基因的表達(dá)。外源SA處理谷子（Foxtail millet）幼苗24 h后，F(xiàn)-box蛋白基因SiF-box18的表達(dá)量到達(dá)了對照的10倍［32］，外源SA處理小麥后，F(xiàn)-box蛋白基因TaSKP2在處理24 h后，表達(dá)量達(dá)到了對照的1.8倍［33］。有研究表明，很多激素受體蛋白都是F-box蛋白，這些蛋白受激素的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步通過降解目標(biāo)底物去調(diào)控生物進(jìn)程［29］。本研究表明，在黃毛草莓和八倍體‘妙香3’草莓中，外源激素SA能誘導(dǎo)黃毛草莓FBOX1的表達(dá)，推測FBOX1受SA的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步通過降解FBOX1目標(biāo)底物參與調(diào)控黃毛草莓抗炭疽病反應(yīng)。

本研究通過亞細(xì)胞定位推測FnFBOX1蛋白定位在細(xì)胞核，這與谷子中SiF-box18蛋白和胡楊中F-box蛋白定位在細(xì)胞核上一致［32，34］。研究發(fā)現(xiàn)煙草NtVQ35能夠同時被SA和青枯病菌高度誘導(dǎo)表達(dá)，對該基因的啟動子區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域含有3個脅迫和防御響應(yīng)相關(guān)的富含TC的重復(fù)序列［35］。中國野生葡萄VpTNL1啟動子和缺失分析表明富含TC的重復(fù)序列可能在其對接種葡萄葉斑病菌的反應(yīng)中起重要作用［36］。本研究克隆了黃毛草莓FnFBOX1上游821 bp啟動子序列pFnFBOX1，序列分析顯示，其含有TC-rich repeats順式作用元件，推測該作用元件對FnFBOX1在響應(yīng)激素信號分子和逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，并通過組織化學(xué)染色分析和GUS活性測定證明了黃毛草莓pFnFBOX1具有驅(qū)動下游基因轉(zhuǎn)錄的活性，且接種膠孢炭疽菌和SA處理后可促進(jìn)FnFBOX1啟動子啟動的GUS活性的提高。為進(jìn)一步探究黃毛草莓FnFBOX1受不同環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá)和參與調(diào)控抗炭疽病提供了一定的參考。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)，黃毛草莓FnFBOX1可能在參與抗炭疽病過程中發(fā)揮一定的作用，但其參與抗病的具體生物學(xué)過程和抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還未明確，后期擬通過遺傳轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)手段進(jìn)一步探討FnFBOX1抗炭疽病生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

從黃毛草莓中克隆到FnFBOX1，全長1 227 bp，編碼408個氨基酸，與森林草莓FvFBOX1同源性最高。膠孢炭疽菌和SA可促進(jìn)黃毛草莓和草莓中FnFBOX1的表達(dá)，但FnFBOX1在‘妙香3’的表達(dá)量比在黃毛草莓的表達(dá)量低。