馮建英 李立芹 魯黎明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）是植物中一類極其重要的調(diào)節(jié)因子，在應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵性的作用［1-2］。它們可參與DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化活動，從而在植物不同發(fā)育階段對不同組織中的基因表達進行調(diào)控［3］。bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)存在的第二大類調(diào)節(jié)蛋白，因具有特定的bHLH結(jié)構(gòu)域而得名［4］。bHLH轉(zhuǎn)錄因子既可作為轉(zhuǎn)錄激活子又可作為轉(zhuǎn)錄抑制子，參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成及應(yīng)答環(huán)境脅迫等過程，如調(diào)節(jié)類黃酮與花青素的合成等［5］。研究植物bHLH基因的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能，對理解其在植物生長發(fā)育及響應(yīng)脅迫中的作用有重大幫助。

目前，已鑒定的植物bHLH家族成員數(shù)量較多，如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有162個［6］，小 麥（Triticum aestivumL.）中有225個［7］，白 菜（Brassica rapassp.pekinensis）中有230個［8］，蘋果（Malus pumilaMill.）中有188個［9］，桑樹（Morus notabilis）中有173個［10］，苦蕎（Fagopyrum tataricum）中有164個［11］，茄子（Solanum melongenaL.）中有121個［12］，銀杏（Ginkgo biloba）91個［13］，玉米（Zea maysL.）161個［14］。研究表明，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子bHLH104和bHLH115在其鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，bHLH104和bHLH115突變使擬南芥在鐵缺乏時耐受性明顯降低，而其過表達會強烈促進鐵的積累［15-16］。在缺鐵條件下存在的NtbHLH1作為轉(zhuǎn)錄激活子定位于煙草細胞核，其過表達會導(dǎo)致根系變長，鐵螯合物還原酶的活性增強［17］。OsbHLH107可通過影響穗殼縱向細胞數(shù)量，進而調(diào)節(jié)水稻籽粒大 ?。?8］。FtbHLH2、FtbHLH55及FtbHLH155等 基因在苦蕎花中高表達，而FtbHLH67、FtbHLH70及FtbHLH157等基因卻在果實中高表達，證實了苦蕎bHLH基因的組織表達特異性［11］。121個茄子bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員中，SmbHLH1與SmbHLH117參與到茄子花青素的生物合成過程中［12］。SlbHLH95表達上調(diào)會促進番茄果實的成熟，并且對乙烯的敏感度會升高［19］。與此同時，植物的bHLH成員還參與了脅迫響應(yīng)。如，西瓜的ClabHLH32、ClabHLH41、ClabHLH71、ClabHLH58以及擬南芥bHLH68、水稻bHLH035均參與了脫落酸（ABA）脅迫應(yīng)答［20-22］；甜橙的bHLH18能夠調(diào)控抗氧化酶基因的表達，從而增強其抗寒能力［23］。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬于茄科茄屬的一年生草本植物，適應(yīng)力強且產(chǎn)量大，是世界四大糧食作物之一，具有較高的營養(yǎng)價值與藥用價值。目前，國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子方面的報道較少，劉玉匯［24］發(fā)現(xiàn)StbHLH1是調(diào)控花色素苷重要的協(xié)同調(diào)控因子，Tai等［25］研究發(fā)現(xiàn)bHLH家族在馬鈴薯中可能具有一定程度抗霜凍的能力。

本研究通過對馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行全基因組鑒定，分析其序列特征、理化性質(zhì)、組織表達與脅迫響應(yīng)表達情況，并構(gòu)建其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以期為其功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為馬鈴薯組培苗，品種為川芋10號，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯bHLH家族的鑒定 從Pfam獲得bHLIH保守結(jié)構(gòu)域PF00010，并以此為參考序列，利用HMMER3.0軟件對馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）進行檢索獲得候選序列。為保證候選序列的可靠性，運用SMART在線軟件和NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對其進行完整保守域檢測，去除冗余及不完整序列，保留僅有一個HLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

1.2.2 bHLH蛋白理化性質(zhì)分析 利用在線軟件ExPASy中 的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/），對馬鈴薯bHLH家族候選蛋白的氨基酸數(shù)、分子量等理化性質(zhì)進行分析［26］。

1.2.3 功能保守域和保守基序分析 利用WebLogo網(wǎng)站，對馬鈴薯bHLH氨基酸序列進行保守域分析。同時利用MEME在線程序（http://meme-suite.org/tools/meme）對馬鈴薯bHLH基因序列進行保守基序分析。

1.2.4 同源性分析 從PlantTFDB網(wǎng)站下載擬南芥bHLH家族蛋白在TAIR上的序列號，并獲取其氨基酸序列。使用軟件MEGA-X的NJ法和iTOL（https://itol.embl.de/itol.cgi）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值設(shè)為1 000［27］。

1.2.5 馬鈴薯bHLH家族成員在染色體上的位置從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫中查找每個StbHLH基因的染色體位置信息，利用在線軟件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）進行染色體定位作圖。

1.2.6 表達模式分析及qRT-PCR驗證

1.2.6.1 生物信息學(xué)分析 從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫獲得StbHLHs基因在根、葉、塊莖組織及鹽、熱、甘露醇與脫落酸脅迫下的FPKM值［28-29］，利用軟件TBtools繪制出其表達模式圖。

1.2.6.2 組織表達模式分析 分別采集馬鈴薯組培苗的根、莖、葉，液氮速凍后，進行總RNA的提取，并 采 用qRT-PCR方 法，對StbHLH2、StbHLH14、StbHLH15、StbHLH34、StbHLH39、StbHLH53、StbHLH57、StbHLH59、StbHLH66、StbHLH80、StbHLH90、StbHLH108等12個基因在馬鈴薯根、莖、葉中的表達量進行分析。引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

總RNA的提取方法以及qPCR的反應(yīng)程序如下：采用Trizol法提取總RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用熒光定量PCR技術(shù)進行基因相對表達量的測定。PCR擴增程序為94℃ 2 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。選用馬鈴薯EF1αL為內(nèi)參基因（EF1αL-F：5′-CTTGTACACCACGCTAAGGAG-3′；EF1αL-R：5′-GTCAATGCAAACCATTCCTTG-3′）。

1.2.6.3 響應(yīng)非生物脅迫的表達模式分析 對生長30 d的馬鈴薯組培苗進行低鉀（10 μmol/L）、ABA（1 μmol/L）、干旱（5% PEG-6000）、高鹽（200 mmol/L Nacl）以及H2O2（10 mmol/L）處理，在處理后0、3、6和12 h取樣。采用qRT-PCR的方法，分析上述12個基因響應(yīng)非生物脅迫的表達模式?？俁NA的提取方法以及qPCR的反應(yīng)程序見1.2.6.2。

1.2.6.4 總RNA的提取及qPCR反應(yīng)程序 總RNA的提取方法以及qPCR的反應(yīng)程序見1.2.6.2。所有樣品設(shè)置為3次生物學(xué)重復(fù)，用2-ΔΔCt方法計算相對表達量，運用Excel 2010進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯bHLH家族成員的鑒定

利用軟件HMMER 3.0對馬鈴薯蛋白數(shù)據(jù)庫進行檢索，并通過NCBI和SMART等網(wǎng)站對保守結(jié)構(gòu)域進一步驗證，剔除冗余，最后篩選出108個具有典型bHLH結(jié)構(gòu)域的馬鈴薯bHLH家族成員。根據(jù)各家族成員所在染色體的位置，將其編號為StBHLH1-StbHLH108。

通過分析馬鈴薯bHLH家族蛋白的基本理化性質(zhì)（表2）。馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列所含的氨基酸數(shù)目為62（StbHLH62）-694（StbHLH84）。分子量為7 527.78（StbHLH62）-75 939.94 Da（StbHLH84）。理論等電點為4.55（StbHLH46）-10.40（StbHLH62）。

表2 基本理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of basic physical and chemical properties

續(xù)表Continued

2.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析

利用WebLogo在線程序，對馬鈴薯bHLH家族保守域進行分析（圖1）。并通過在線工具MEME對馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行Motif的預(yù)測，得到5個不同Motif保守元件（圖2）。其中，Motif1和Motif2為馬鈴薯bHLH家族成員所共有，并且位置相鄰。而Motif5卻僅在StbHLH1、StbHLH11、StbHLH12、StbHLH14這4個成員中存在。以上結(jié)果表明，HLH結(jié)構(gòu)域不是由一個或幾個特定的保守元件構(gòu)成的。

圖1 bHLH保守結(jié)構(gòu)域的logoFig. 1 Logo of bHLH conservative domain

圖2 馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析Fig. 2 Conserved motif analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

2.3 馬鈴薯bHLH家族蛋白的同源性分析

根據(jù)鑒定出的馬鈴薯bHLH家族蛋白序列與隨機選取的擬南芥bHLH家族的30條氨基酸序列間的相似度，使用軟件MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。結(jié)果（圖3）表明，138個bHLH轉(zhuǎn)錄因子被劃分為16個亞家族，其中，第10亞族的bHLH成員最少，為2個，第16亞族最多，為27個。同一亞族成員具有相似保守基序。表明同一亞家族成員可能具有相類似的功能，在馬鈴薯生長發(fā)育中發(fā)揮類似的作用。

圖3 馬鈴薯bHLH家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of bHLH family proteins in S. tuberosum

2.4 馬鈴薯bHLH基因在染色體上的位置

根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫提供的StbHLHs的染色體位置信息，繪制其染色體定位模式圖（圖4）。結(jié)果表明，108個StbHLHs在馬鈴薯12條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布。第1染色體分布的StbHLHs數(shù)量最多，為15個；第11染色體分布的StbHLHs數(shù)量最少，為3個。其中第9和第10染色體上分布的StbHLH家族成員均為7個。以上結(jié)果表明，StbHLHs在馬鈴薯染色體上分布密度是不等的。第1和第2染色體上共有3對基因緊密連鎖，分 別 為StbHLH11/StbHLH13、StbHLH12/StbHLH14、StbHLH24/StbHLH26，屬于旁系同源基因。

圖4 馬鈴薯bHLH家族基因的染色體定位Fig. 4 Chromosome localization of bHLH family genes in S. tuberosum

2.5 馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達模式分析

利用數(shù)據(jù)庫信息，分析108個StbHLHs在根、葉、塊莖中的表達模式，以及響應(yīng)鹽（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生長素、脫落酸及赤霉素、熱（35℃）等非生物脅迫的表達行為，并利用軟件TBtools繪制了聚類表達模式圖（圖5）。

從圖5可以看出，StbHLHs在不同組織中的表達具有特異性。StbHLH2、StbHLH5、StbHLH18和StbHLH99等在3個組織中均具有較高的表達豐度，尤其是前兩者在葉片和塊莖中的表達值均為最高，表明它們可能主要參與馬鈴薯葉片及塊莖發(fā)育過程。然而，也有基因在這3個組織中均不表達，如StbHLH1、StbHLH4、StbHLH10等。StbHLH12和StbHLH13僅在馬鈴薯葉片中有較低的表達量，而StbHLH17和StbHLH76卻只在葉片中不表達。StbHLHs的組織表達特異性進一步揭示了馬鈴薯StbHLHs行使功能時的空間特征。

圖5 馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

馬鈴薯StbHLHs還響應(yīng)了非生物脅迫的誘導(dǎo)。在鹽（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生長素、赤霉素及脫落酸、熱（35℃）等脅迫處理下，這108個StbHLHs的表達模式明顯不同。其中，StbHLH84、StbHLH87及StbHLH89等基因，在所有脅迫處理下表達均上調(diào)；StbHLH47、StbHLH56及StbHLH80等 基 因 表 達 均 下 調(diào)；StbHLH12、StbHLH14及StbHLH55等基因表達無變化。在鹽和甘露醇脅迫下，StbHLH83表達程度明顯提高，StbHLH20表達量下降，而StbHLH11、StbHLH74和StbHLH82等基因均無明顯響應(yīng)。內(nèi)源激素誘導(dǎo)條件下，StbHLH46和StbHLH65相較其他成員有較高的表達豐度；StbHLH103唯獨在ABA脅迫下表達量明顯增加，暗示其可能正調(diào)控ABA信號傳導(dǎo)途徑，從而提高馬鈴薯抗旱性。熱處理時，StbHLH15、StbHLH50及StbHLH73等基因表達均顯著下調(diào)；StbHLH20、StbHLH48及StbHLH60等基因表達均顯著上調(diào)，表明這些基因在馬鈴薯熱激反應(yīng)中具有正向調(diào)節(jié)的作用。

2.6 馬鈴薯部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子的組織表達模式分析

采用qRT-PCR方法分析StbHLH14等12個基因在馬鈴薯根、莖、葉中的表達情況（圖6）?？傻肧tbHLH14、StbHLH34、StbHLH66及StbHLH90均在莖中相對較高的表達量；StbHLH39在葉中的表達量是最高的；而StbHLH59在根中有較高表達量。StbHLH2和StbHLH15在馬鈴薯根、莖及葉中的表達量均無明顯差異。

圖6 馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子組織表達模式分析Fig. 6 Tissue expression pattern analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

2.7 馬鈴薯部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下的表達模式分析

為了對生物信息學(xué)分析結(jié)果進行驗證，分析了StbHLH2等12個基因在低鉀、脫落酸（ABA）、干旱、高鹽及H2O2處理不同時間的表達量（圖7）。StbHLH15和StbHLH53在低鉀及ABA處理下，表達量有明顯的上調(diào)；StbHLH15和StbHLH59在模擬干旱脅迫環(huán)境下，表達豐度顯著增加，說明其可能參與調(diào)控ABA信號通路；StbHLH90在高鹽處理3 h后表達量達到了最高；StbHLH108在5個脅迫處理下的表達均明顯增加，暗示其可能在馬鈴薯響應(yīng)逆境中起著至關(guān)重要的作用。StbHLH2在低鉀和高鹽處理下，表達量均有顯著的上調(diào)；StbHLH15在高鹽處理后發(fā)生了下調(diào)；StbHLH39在低鉀、高鹽、H2O2處理后均有顯著下調(diào)。

圖7 馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子脅迫處理表達模式分析Fig. 7 Expression pattern of bHLH transcription factor in S. tuberosum under stress

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物體內(nèi)，它主要調(diào)控植物生長發(fā)育，如花的形態(tài)建成、表皮毛的發(fā)育及種子萌發(fā)等，同時在植物養(yǎng)分吸收、生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用［30-31］。本研究鑒定出108個馬鈴薯bHLH家族成員，保守元件分析后，共獲得5個Motifs。其中，Motif1和Motif2相鄰，并存在于所有bHLH家族成員中，推測兩者共同組成了bHLH保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果與陳紅霖等［6］對綠豆全基因組的研究結(jié)果相似。聚類分析表明，138個bHLH被分為16個亞家族，而同一亞族的成員大多具有相似的保守元件。進化及染色體定位表明，108個馬鈴薯bHLH家族成員不均勻地分布在12條染色體上。在1號和2號染色體上共存在3對旁系同源基因，并且緊密連鎖，該結(jié)果與王尋等［32］研究結(jié)果相吻合。

植物的bHLH基因往往具有組織表達特異性。黃芩bHLH3在根中表達值最高，而葉片中基本不表達，bHLH6的表達情況與其恰恰相反［33］。NtbHLH93在煙草盛花期子房組織，及不同生育期側(cè)根中的表達量很高［34］。與上述研究結(jié)果相似，馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，StbHLH18和StbHLH99等在根、葉及塊莖組織中均具有較高的表達豐度，StbHLH13僅在葉片中有低表達。此結(jié)果表明，馬鈴薯bHLH家族成員在其特定發(fā)育階段及特定組織中有獨特的表達特點。

植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，也參與了生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)過程。番茄bHLH22過表達會促進乙烯生成及激活SlSFT或SlLFY，從而促進果實成熟［35］。在ABA脅迫誘導(dǎo)下，西瓜的ClabHLH32和ClabHLH71隨著時間的推移表達量呈先降低后升高的趨勢，而ClabHLH41和ClabHLH58先上調(diào)后下降［20］。擬南芥bHLH68參與了ABA信號傳導(dǎo)及代謝過程，并在干旱脅迫響應(yīng)時有重要功能［21］。鹽脅迫下，水稻bHLH035突變體出現(xiàn)種子萌發(fā)延遲的現(xiàn)象，且鹽誘導(dǎo)的ABA分解基因在種子萌發(fā)過程中表達下調(diào)，導(dǎo)致了ABA過度積累［22］。甜橙bHLH18可直接或間接地調(diào)控抗氧化酶基因的表達，從而能夠增強其抗寒能力［23］。

本研究熱圖分析中，在鹽（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生長素、脫落酸及赤霉素、熱（35℃）等非生物脅迫下，馬鈴薯StbHLHs呈現(xiàn)出不同的表達模式，暗示了其參與植物發(fā)育進程及環(huán)境脅迫的普遍性。其中，StbHLH84、StbHLH87和StbHLH89均上調(diào)表達，則說明了其可能以正向調(diào)控的方式，參與馬鈴薯生長以及響應(yīng)多種逆境脅迫的調(diào)節(jié)。StbHLH103在ABA的誘導(dǎo)下，表達量顯著上升，說明該基因可能參與了ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并可能在馬鈴薯的ABA依賴的非生物脅迫（如干旱）響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

qRT-PCR分析結(jié)果表明，StbHLH14、StbHLH34在莖中表達量較高，而StbHLH59和StbHLH39分別在根和葉中有高表達，說明了馬鈴薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有不同的組織表達特異性。StbHLH15和StbHLH53在不同的脅迫處理后會有明顯的上調(diào)，然而有少數(shù)基因在脅迫處理后表達會減少，如StbHLH39等，說明這些基因分別作為不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途中的正調(diào)控及負調(diào)控因子。StbHLH108在低鉀、脫落酸、高鹽、干旱及H202這5個脅迫處理下均發(fā)生了上調(diào)。綜上，馬鈴薯bHLH家族成員在響應(yīng)逆境脅迫時均發(fā)揮著一定的作用。

4 結(jié)論

在馬鈴薯全基因組中，共鑒定出同屬于bHLH基因家族的108個StbHLHs。它們不均勻地分布在馬鈴薯12條染色體上，均具有典型的HLH結(jié)構(gòu)域，且同一亞族成員的保守基序相似。馬鈴薯bHLH基因具有組織表達特異性，并且響應(yīng)鹽、熱、旱、ABA等非生物脅迫。