馮 波，黎嘯峰，彭海寧，楊滿君，丁 浩，徐 葉，劉如石*

（1. 湖南南華愛斯普林生物技術(shù)有限公司，長沙 410000；2. 湖南師范大學醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，長沙 410013）

近年來，干細胞治療逐漸成為一個前景十分廣闊的先進科學課題，干細胞臨床治療方法的發(fā)展引起了人們的極大期待［1］。干細胞可以分為兩大類：胚胎干細胞和非胚胎干細胞。迄今為止，由于畸胎瘤的形成和使用干細胞的倫理爭議，研究人員和臨床醫(yī)生對胚胎干細胞的應(yīng)用研究有限。因此，使用非胚胎干細胞（主要是成體干細胞）的試驗結(jié)果在科學界極具吸引力［2］。由于多種機制（旁分泌、營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和分化）的共同作用，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植被認為是最有效的細胞治療工具之一，影響受損組織再生的各個階段［3］。臍帶間充質(zhì)干細胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，因其來源豐富而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［4］。MSCs治療機理包括：1）能分化成各種細胞譜系；2）能分泌促進細胞存活和增殖的可溶性因子；3）發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；4）定向遷移到損傷部位［5］。

但MSCs的應(yīng)用研究還需要解決很多問題，如供體異質(zhì)性、體外擴增、免疫原性和冷凍保存等［6］。其中，干細胞的生物安全性是細胞治療能否進入臨床應(yīng)用，保障患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵問題［7］。干細胞的生物安全性涵蓋從供體選擇到干細胞分離，從培養(yǎng)擴增到臨床前及臨床療效，從安全性評估到細胞移植等過程的方方面面。有研究報道，MSCs移植不良事件的發(fā)生率、類型和嚴重程度與移植細胞的特征（劑量、類型等）和所患疾病的差異而顯著不同［8］。其中，干細胞的多能性在這些過程中貫穿始終。干細胞的多能性是一把雙刃劍，既賦予了干細胞分化成數(shù)以千計種細胞和治療多種疾病的潛能，同時也賦予了干細胞回輸體內(nèi)后的許多不確定性［9］。鑒于此，對干細胞的安全性研究可以從干細胞的遺傳穩(wěn)定性、致瘤性、致栓性、免疫原性等幾個方面展開。

干細胞在擴增培養(yǎng)過程中常伴隨著遺傳物質(zhì)變異的發(fā)生，這在一定程度上會影響干細胞的應(yīng)用安全［10］。相對于分化細胞，干細胞有其獨特的方式維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。在保證干細胞的遺傳穩(wěn)定性的過程中，端粒和端粒酶發(fā)揮著重要作用。位于真核染色體末端的端粒由端粒相關(guān)蛋白和端粒 DNA 組成，在維持染色體基因組完整性以及功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［11］。染色體復(fù)制過程中存在著其自身缺陷，因此細胞每分裂一次，一定量的堿基對會從端粒中丟失，當 DNA 短于一定長度時，端粒對于染色體末端的保護功能就會喪失，此時由于編碼區(qū)基因結(jié)構(gòu)被破壞，會發(fā)生染色體融合或者染色體降解，最終導(dǎo)致細胞老化死亡［12］。端粒酶是一種具有逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白，可以自身 RNA 為模板合成端粒重復(fù)序列，其活性可以通過調(diào)控端粒酶的 RNA 成分乃至蛋白質(zhì)成分等途徑實現(xiàn)。正常體細胞中，端粒酶活性受到限制；在生殖細胞、胚胎細胞中，端粒酶表達水平稍高；在癌細胞與永生化細胞系中，端粒長度較短且端粒酶活性較強［13］。測試干細胞的端粒酶活性，并結(jié)合細胞的端粒結(jié)構(gòu)特征分析，可以在一定程度上了解細胞的遺傳變異規(guī)律，為干細胞的安全性數(shù)據(jù)提供參考。

端粒酶等基因的突變是細胞永生化的必要途徑，此過程又被認為是腫瘤惡化的必要步驟。正常情況下，突變會被細胞的 DNA 修復(fù)機制修復(fù)或通過一系列通路誘導(dǎo)細胞凋亡，如果突變的 DNA 未被正常處理，將有可能轉(zhuǎn)變成腫瘤細胞［14］。胚胎干細胞在體外培養(yǎng)時具有自我更新、無限增殖和多向分化的特性，然而胚胎干細胞回輸體內(nèi)后，易形成一種被稱為畸胎瘤的良性腫瘤。當胚胎干細胞被分化細胞污染并被移植入患者體內(nèi)時，具有一定的致瘤風險［15］。胚胎干細胞致畸胎瘤的發(fā)現(xiàn)敲響了干細胞生物安全性的警鐘。雖然，目前很少有臍帶間充質(zhì)干細胞致瘤的報道，但檢測臍帶間充質(zhì)干細胞的致瘤性對于MSCs的安全性評估依然十分必要。癌細胞能在數(shù)周內(nèi)于軟瓊脂平板上形成克隆，在移植入動物體內(nèi)后，能迅速致瘤［16］。通過克隆形成試驗和動物成瘤試驗，可以評估臍帶間充質(zhì)干細胞的致瘤風險，為臍帶間充質(zhì)干細胞的安全性評估提供試驗數(shù)據(jù)。

本文主要從臍帶間充質(zhì)干細胞的端粒酶活性、克隆形成率乃至動物試驗致瘤性等方面對臍帶間充質(zhì)干細胞用于臨床治療前的安全性進行評估，為后續(xù)干細胞用于臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

細胞株 試驗組細胞為人臍帶間充質(zhì)干細胞第6代（MSC-P6），細胞編號：UCM2008010101001，提供單位：湖南南華愛世普林生物技術(shù)有限公司。陽性對照細胞為人宮頸癌細胞（henrietta lacks cells，Hela），細胞編號：CL-0101，提供單位：武漢普諾賽生命科技有限公司。陰性對照細胞為人胚肺細胞（medical research council cell strain-5，MRC-5），細胞編號：CL-0161，提供單位：武漢普諾賽生命科技有限公司。

試劑 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，500 mL/瓶），Hy-Clone 公司，批號：AE29461773；胎牛血清（fetal bovine serium ，F(xiàn)BS，100 mL/瓶），Sciencell 公司，批號：M009-6；端粒酶活性檢測試劑盒（50 tests），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20200102；甲基纖維素（500 g/瓶），Sigma 公司，批號：SLCD2238。

儀器 CJ-1F 型醫(yī)用凈化工作臺，蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司；3111型 CO2培養(yǎng)箱，Thermo Fisher 公司生產(chǎn)；DMi8型倒置熒光顯微鏡，德國Leica 公司產(chǎn)品；7500型實時熒光定量 PCR 儀，英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

陽性對照細胞培養(yǎng) 將 Hela 細胞用含10%FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增，常規(guī)消化收集細胞，用無血清高糖 DMEM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞密度至5×106個/mL，體積為3 mL。

陰性對照細胞培養(yǎng) 將 MRC-5細胞用含10%FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增，常規(guī)消化收集細胞，用無血清高糖 DMEM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107個/mL，體積為3 mL。

1.2.2 裸鼠成瘤性試驗

選取檢疫合格的雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級BALB/c-nu 裸鼠36 只，分為3組，每組12 只，分別為陰性對照組、陽性對照組、試驗組。陰性對照組裸鼠每只腋下接種0.2 mL無血清細胞培養(yǎng)液（含1×107個 MRC-5細胞），陽性對照組裸鼠每只腋下接種0.2 mL無血清細胞培養(yǎng)液（含1×106個 Hela 細胞），試驗組裸鼠每只腋下接種0.2 mL無血清細胞培養(yǎng)液（含1×107個人臍帶間充質(zhì)干細胞）。

1.2.3 觀察指標

行為活動、腺體分泌、糞便形狀、體表黏膜的觀察；病理觀察：肉眼觀察，如試驗組有結(jié)節(jié)或瘤塊形成，則行病理切片及 HE 染色檢查。陽性對照組連續(xù)觀察3周后處死，陰性對照組和試驗組連續(xù)觀察16 周，并觸摸所有動物在注射部位是否具有結(jié)節(jié)形成，在前6 周每周觀察2 次，在7～16 周每周觀察1次，并記錄結(jié)果。

1.2.4 端粒酶活性測定

采用實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT） 的 mRNA表達水平來間接反應(yīng)端粒酶的活性。

1.2.5 細胞裂解液的制備

取人臍帶間充質(zhì)干細胞制劑、培養(yǎng)好的 Hela、MRC-5細胞，棄去基質(zhì)，收集細胞至1.5 mL離心管中，將20 μL/106個細胞加入預(yù)冷裂解液［含1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）和0.3 μL β-巰基乙醇］，在冰浴上裂解30 min 后，4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液。以上清液為模板進行 PCR 擴增，合成 cDNA。

1.2.6 端粒酶反應(yīng)

各組按照試劑盒說明書配制端粒酶活性測定反應(yīng)體系，即：Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2×）12.5 μL，TERT Forward Primer（10 μmol/L）0.8～1.0 μL，TERT Reverse Primer（10 μmol/L）0.8～1.0 μL，Template DNA＜500 ng，加 Nucleasefree H2O到25.0 μL。按照說明書設(shè)置端粒酶活性測定儀器運行程序：預(yù)變性50℃ 2 min；變性95℃10 min；變性 95℃ 15 s，復(fù)性/延伸60℃ 60 s，40個循環(huán)；數(shù)據(jù)收集與分析。同時設(shè)置 Hela 提取物為陽性對照，MRC-5提取物為陰性對照。

1.2.7 克隆形成試驗

將試驗組（人臍帶間充質(zhì)干細胞）、培養(yǎng)好的陽性對照組（Hela）、陰性對照組（MRC-5）棄去基質(zhì)，收集細胞，使用2×培養(yǎng)基制成細胞懸液，并調(diào)整細胞密度，使最終接種細胞的密度不超過35個/cm2。將2%的甲基纖維素培養(yǎng)基分別與細胞懸液以1∶1體積比混合，注入平皿中，待形成半固體后，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～21 d，可按需補加500 μL 完全培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基表面過于干燥。計算細胞克隆形成率，以大于40個細胞的細胞團為一個克隆。

細胞集落克隆率=平均細胞集落數(shù)/每孔加入的細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸鼠成瘤性

各組接種不同細胞后至處死前，陰性對照組和陽性對照組未出現(xiàn)死亡，試驗組有2只動物第13周出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象并死亡。經(jīng)大體觀察，其腋下無結(jié)節(jié)形成，推測是由于飼養(yǎng)時間太長，動物衰弱導(dǎo)致死亡。陰性對照組在注射部位無明顯反應(yīng)，觸摸未形成結(jié)節(jié)；陽性對照組在注射部位形成進行性結(jié)節(jié)，在處死后剝離形成了肉眼可見瘤塊；試驗組注射部位從第3天開始有紅腫現(xiàn)象，觸摸有軟性結(jié)節(jié)，第4～6天可見形成了紅腫，而軟性結(jié)節(jié)無明顯變化，第7天紅腫現(xiàn)象及軟性結(jié)節(jié)開始消退，第14天恢復(fù)正常，在觀察期結(jié)束后，無肉眼可見結(jié)節(jié)或瘤塊形成。具體數(shù)據(jù)詳見表1和圖1。

圖1 成瘤性試驗結(jié)果Fig. 1 Tumorigenicity test results

表1 成瘤性試驗結(jié)果Tab. 1 Tumorigenicity test results

2.2 端粒酶活性

根據(jù)端粒酶活性方法學驗證分析，陽性對照細胞 Hela 細胞端粒酶活性相對表達量為4.33，陰性對照細胞MRC-5細胞端粒酶活性相對表達量為0.01，人臍帶間充質(zhì)干細胞P6細胞端粒酶活性相對表達量為1.70（圖2）。各組細胞端粒酶活性檢測的具體表達數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 端粒酶活性檢測的表達數(shù)據(jù)（n=2）Tab. 2 Expression data of telomerase activity detection （n=2）

圖2 端粒酶活性檢測Fig. 2 Test of telomerase activity

2.3 克隆形成試驗

將各組細胞以 32 個/cm2接種至 10 cm 平皿后，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，以大于40個細胞的細胞團為一個克隆計算細胞克隆形成率。由圖3a可見，陰性對照組無克隆形成；由圖3b可見，陽性對照組有克隆形成；圖3c～3f為試驗組同一平皿中不同視野的細胞克隆照片，均為無克隆形成。

圖3 克隆形成試驗（200×）Fig. 3 Colony formation assay (200×)

3 討論

臍帶間充質(zhì)干細胞作為一種更新能力強和分化能力高的細胞，在臨床許多疾病的治療中展現(xiàn)了廣闊的前景。了解和評價臍帶間充質(zhì)干細胞的安全性能，可以為干細胞臨床治療心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等重大疾病提供重要的參考數(shù)據(jù)。

胚胎干細胞的裸鼠成瘤性是最先發(fā)現(xiàn)的干細胞安全問題之一。移植未分化的胚胎干細胞后，裸鼠組織內(nèi)會迅速形成較大的腫瘤，被稱為畸胎瘤?；チ鲆话闶且恍┎灰?guī)則分化的良性腫瘤，當它們包含一個惡性未分化細胞核心時，這些腫瘤被定義為畸胎癌［17］。干細胞的致瘤性和干細胞的增殖分化能力與細胞純度有關(guān)系。胚胎干細胞因其極強的增殖分化能力，在移植后體內(nèi)微環(huán)境的誘導(dǎo)下，快速多向分化成不同細胞，多向分化和不規(guī)則分化造成細胞微環(huán)境的紊亂，進而導(dǎo)致凋亡障礙，形成畸胎瘤甚至畸胎癌，這可能是胚胎干細胞的致瘤機制之一［18］。臍帶間充質(zhì)干細胞相比胚胎干細胞，其干性相對較弱，沒有胚胎干細胞那樣強的增殖分化能力，移植后未見有導(dǎo)致成瘤的多向分化和不規(guī)則分化現(xiàn)象出現(xiàn)的報道［19］。不僅如此，臍帶間充質(zhì)干細胞還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，在抑制自身免疫性疾病等方面具有潛力［20］。本研究對比了 MRC-5細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞和 Hela 細胞的致瘤性。動物試驗結(jié)果顯示，臍帶間充質(zhì)干細胞在移植到裸鼠體內(nèi)的13 周內(nèi)沒有展現(xiàn)出致瘤性；克隆形成試驗顯示，臍帶間充質(zhì)干細胞和 MRC-5細胞一樣，在14 d內(nèi)不會形成細胞克隆。以上結(jié)果說明，臍帶間充質(zhì)干細胞沒有胚胎干細胞那樣的高致瘤性，同時也在一定程度上說明本試驗采用的臍帶間充質(zhì)干細胞純度較高，其他分化細胞污染的風險控制較佳。后續(xù)可采用檢驗不同種類混合細胞移植后的致瘤性的方法，進一步探索干細胞致瘤與否的機制，進一步排除臍帶間充質(zhì)干細胞持續(xù)性致瘤的潛在風險。

癌癥的主要特征之一是它的復(fù)雜性。癌癥的發(fā)生涉及成千上萬的分子改變，這些改變使癌細胞有別于正常細胞。雖然癌癥包括一系列不同的疾病，但這些疾病都和細胞的不適當生長有關(guān)［21］。盡管癌癥具有其復(fù)雜性，但一些關(guān)鍵基因還是在其發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。一些證據(jù)表明，端粒和端粒酶的穩(wěn)態(tài)失調(diào)是癌癥發(fā)生發(fā)展所必須的條件［22］。端粒是終止真核染色體的核蛋白結(jié)構(gòu)，端粒的主要功能之一是標記線狀染色體的末端，使其有別于斷裂的 DNA 末端，并促進染色體復(fù)制。DNA 聚合酶不能完全復(fù)制染色體末端，因此，在每個細胞周期中大約有50 個核苷酸丟失，從而導(dǎo)致端粒長度逐漸縮短，最終導(dǎo)致因基因組不穩(wěn)定而引發(fā)細胞凋亡程序［23］。端粒長度的維持主要通過端粒酶來實現(xiàn)。正常體細胞中，端粒酶活性保持在很低的水平。在一些生殖細胞、胚胎細胞等快速分裂的細胞中，端粒酶表達水平明顯升高［24］。在癌細胞中，端粒酶水平異常升高，端粒及端粒酶結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化，端粒長度較正常水平明顯增長，對應(yīng)著癌細胞的永生化［25］。本研究中，臍帶間充質(zhì)干細胞的端粒酶活性根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT技術(shù)測得，端粒酶活性通過實時熒光定量PCR的Ct值直觀表現(xiàn)出來［26］。Ct值越高，說明端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達越少，端粒酶活性越低。端粒酶的相對活性通過樣品與內(nèi)參的Ct值比較推導(dǎo)出。本試驗測得MSC端粒酶相對活性（1.70）介于陰性（0）和陽性（4.33）之間，屬于正常水平（0～2.50）［27］。端粒酶表達水平高于MRC-5細胞，但沒有發(fā)生異常升高的現(xiàn)象，能發(fā)揮維持正常端粒長度的功能，不會引起端粒結(jié)構(gòu)異常，進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。端粒酶表達水平高于 MRC-5細胞這個現(xiàn)象可能和臍帶間充質(zhì)干細胞本身的增殖效率較高有關(guān)，后續(xù)可對比臍帶間充質(zhì)干細胞和其他種類干細胞或分化細胞的端粒酶表達量，更加詳實地揭示端粒酶表達量和增殖效率之間的關(guān)系。

臍帶間充質(zhì)干細胞對于治療心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等重大疾病展現(xiàn)了很好的潛能［20］。過往的研究已顯示其無異常毒性，無細菌內(nèi)毒素，過敏原低等［21］。本研究分析了臍帶間充質(zhì)干細胞的端粒酶活性、克隆形成率以及動物試驗致瘤性，結(jié)果顯示，臍帶間充質(zhì)干細胞端粒酶表達水平正常，未發(fā)現(xiàn)克隆形成和動物移植致瘤性。在后續(xù)臍帶間充質(zhì)干細胞用于臨床治療的實踐中，在考慮移植方式、移植部位和移植量并充分避免栓塞的前提下，臍帶間充質(zhì)干細胞可作為一種安全有效的細胞治療方式。

臍帶間充質(zhì)干細胞端粒酶表達水平正常，未發(fā)現(xiàn)類似癌細胞的細胞克隆形成，臍帶間充質(zhì)干細胞移植入裸鼠體內(nèi)后未發(fā)現(xiàn)致瘤性，可將臍帶間充質(zhì)干細胞作為一種安全有效的細胞治療方式。