高偉健，徐 瑤，張藝晴，袁梓珊，楊靜怡，鐘芳瑜，藍佳琳，陳可兒，黃 晶，藍銀濤，王俐梅，傅洪波*，張 建*

（1. 廣州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系，廣州 511436；2. 廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點實驗室，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評價分中心，廣州 510990）

隨著社會的進步和醫(yī)學技術(shù)的快速發(fā)展，人類的壽命普遍延長，退行性疾病醫(yī)治問題在人口老齡化的進程中將面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。許多醫(yī)學難題正在努力被攻克，但還有很多沒有被攻克的難題威脅著人類，特別是一些慢性疾?。?］。雖然人們對自己的健康狀態(tài)特別關注，但在面對一些早期癥狀并不影響人們的正常生產(chǎn)和生活等慢性疾病時，由于工作和時間的問題，人們對于此類問題忽略的程度較高，骨質(zhì)疏松癥就是這類疾病的代表。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，患者全身疼痛，腰背活動受到限制［2］。骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加［3］。人類40歲后骨質(zhì)流失就已經(jīng)開始發(fā)生，在骨質(zhì)流失早期，人們根本感覺不到身體發(fā)生的變化，只有在骨質(zhì)流失的晚期，已經(jīng)患上骨質(zhì)疏松癥時，骨質(zhì)疏松性骨折才會嚴重威脅人們的健康和生活水平。骨質(zhì)疏松這種漫長的發(fā)展過程得不到普通人群的關注，關注骨質(zhì)疏松癥的人普遍為醫(yī)院醫(yī)生、相關學者、患有骨質(zhì)疏松癥的病人和少數(shù)年輕人。骨質(zhì)疏松癥已位于中國乃至全球慢性病的第三位［4］，且女性骨質(zhì)疏松癥患病率遠高于男性［5］。目前臨床應用檢測骨密度（bone mineral density，BMD）的方法主要有單光子吸收法、雙光子吸收法、雙能X線吸收法、定量CT和超聲診斷技術(shù)［6］。臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要包括骨礦化促進劑［7］、骨吸收抑制藥［8］、骨形成促進劑［9］、其他機制類藥物和中藥等［10-12］。同時，此類疾病的新式藥物的研發(fā)離不開高通量的藥物篩選，而斑馬魚作為高通量藥物篩選的模式生物，其優(yōu)勢明顯。因此，開發(fā)一種新式的、適用性強、操作簡易的用于斑馬魚等動物試驗上的定量的BMD檢測方法十分重要。

斑馬魚作為人類疾病的動物模型，是脊椎動物（小型模式生物）和哺乳動物（大型模式生物）之間的“橋梁”，在用于生物學、基因組學和遺傳學研究方面具有獨特的優(yōu)勢［13］。斑馬魚的基因與人類高度同源，且很多基因通路高度保守。這些優(yōu)點使其成為人類疾病研究過程中一種高度兼容的模型［14］。斑馬魚作為一種優(yōu)秀的動物模型，因其特殊的生理結(jié)構(gòu)、體型小、生長發(fā)育快、繁殖能力強［15］，已廣泛用于人類相關疾病機制的研究和藥物篩選［16-17］，因此，需要一種實時監(jiān)測活體斑馬魚顱骨的成像技術(shù)。

光學相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）技術(shù)是一種基于低相干干涉原理，通過測量從樣品反射回來的后向散射光的強度對樣品進行斷層成像的技術(shù)［18］。 OCT技術(shù)具有大量的優(yōu)點，如無損傷、非介入、非接觸、圖像分辨率高且操作簡單、便攜、易與內(nèi)窺鏡結(jié)合等［19］。OCT技術(shù)目前主要分為3種，分別為時域OCT、頻域OCT和功能OCT［20］。頻域OCT技術(shù)按分光原件的不同，分為譜域OCT和激光掃頻OCT，本文中采用的是譜域OCT。頻域OCT是由時域OCT發(fā)展而來的，它由寬帶光源照明的邁克爾遜干涉儀和光譜儀組成，參考臂固定不動從而無需對樣品進行軸向掃描，直接測量干涉信號的光譜，對所測的光譜進行快速傅里葉逆變換得到樣品不同縱向深度的信息。相對于時域OCT這種發(fā)展最早的形式，其消除了參考臂的機械掃描，在光接收端將光電探測器用光譜儀代替，利用傅里葉逆變換對光譜儀接收到的干涉光譜數(shù)據(jù)進行分析構(gòu)成圖像，并獲得被測物質(zhì)的縱向信息，大大提高了成像的速度［21］。頻域OCT在成像速度、信噪比和靈敏度等方面具有明顯優(yōu)勢, 在眼科成像、功能成像等領域發(fā)揮了重要作用，是一種非侵入、非接觸的微米級分辨率的成像技術(shù)。

本文基于Matlab語言，對采集到的使用125 μmol/L潑尼松龍溶液誘導的斑馬魚骨質(zhì)疏松的0、7、14、21 d的OCT圖像依次進行灰度化、二值化、圖像分割、閾值分割、密度投影，最后進行BMD統(tǒng)計。該方法實現(xiàn)了一種簡便的斑馬魚BMD測量的工程方法，可以有效地統(tǒng)計BMD，計算和比較骨缺損程度。此方法有助于骨質(zhì)疏松方向、骨發(fā)育方向、骨再生和修復方向、藥物篩選等方向上的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

本工作采用頻域OCT系統(tǒng)，該頻域OCT系統(tǒng)采用一個中心波長為830 nm、光譜帶寬超過40 nm的超輻射發(fā)光二極管作為光源。本研究所用的頻域OCT系統(tǒng)根據(jù)光源特性進一步優(yōu)化了光譜儀參數(shù)，可在空氣中實現(xiàn)8 μm軸向分辨率和12 μm橫向分辨率。該系統(tǒng)對瓊脂模型的成像深度可達4 mm左右，對斑馬魚等組織的成像深度可達2 mm左右。該掃描系統(tǒng)采用了兩個高速振鏡，能夠以高達18 kHz掃描的高成像速度快速獲取大量數(shù)據(jù)。因此，頻域OCT可以實現(xiàn)實時、深度分辨、橫斷面和3D成像。頻域OCT系統(tǒng)的最大視場可達10 mm×10 mm×2 mm，可使用高性能個人計算機同時進行數(shù)據(jù)采集和信號處理。CCD攝像機可以實時監(jiān)控應用區(qū)域并對樣品進行拍照。OCT將沿著樣品照片上選擇的路徑進行。在CCD相機的幫助下，我們能夠獲得每個時間點在斑馬魚頭部沿同一剖面的OCT圖像，我們可以進行三維OCT拍照，即以一定的頻率移動掃描的位置得到一組二維圖，以此更為精準地捕捉同一尾斑馬魚顱骨相同位置的不同時間的OCT圖像，便于后面方法的研究。

1.2 試驗動物

本研究隨機選取月齡（80 d）、體型相近的正常斑馬魚20尾作為試驗對象，其中將15尾斑馬魚分為a、b、c組，每組5尾，組內(nèi)5尾魚分開容器飼養(yǎng)并編號，分別使用125 μmol/L潑尼松龍溶液培養(yǎng)7、14、21 d，用于構(gòu)建斑馬魚顱骨骨質(zhì)疏松模型。然后選取5尾斑馬魚并編號用于空白對照組和d組。所有試驗動物培養(yǎng)室溫為（28±0.5）℃，每日光照周期為14 h光照和10 h黑暗環(huán)境。對構(gòu)建好的不同天數(shù)的斑馬魚模型和空白對照組進行頻域OCT檢測，動物試驗按照廣州醫(yī)科大學動物保護與使用委員會制定的動物研究指南進行。為了成像，首先使用0.05% MS-222麻醉魚，直到它們對觸摸失去反應。這些魚被移到一個裝有瓊脂凝膠的培養(yǎng)皿中，瓊脂用于保持斑馬魚的正常體態(tài)，此外，魚被放置在掃描物鏡下的視野，將焦平面調(diào)整到魚的頭部合適位置后，用頻域OCT系統(tǒng)對魚進行成像。最后，使用本文提出的BMD檢測方法，對得到的OCT圖像進行處理、統(tǒng)計和分析。

1.3 潑尼松龍誘導下的斑馬魚飼養(yǎng)

對a、b、c組的15尾斑馬魚按編號順序放置回對應的容器里面，同時保證飼養(yǎng)水環(huán)境相對潔凈。飼養(yǎng)水（125 μmol/L潑尼松龍溶液）的更換周期為2 d，每次換液時應注意要保留1/3的原有溶液，再添加2/3的新溶液，減少溶液變化大造成斑馬魚死亡。同時，在試驗期間，給予斑馬魚適量的活蝦卵，保證所有斑馬魚能成功進食，并且盡量保證每一尾斑馬魚的進食量相同。

1.4 試劑配制

配制質(zhì)量分數(shù)為0.01%的Tricaine溶液（MS-222麻醉劑）：Tricaine（西格瑪，A5 040，美國）粉末溶于Holtbuffer緩沖液中，配置成質(zhì)量分數(shù)為0.40%的儲備液，試驗前需將儲備液加過濾水稀釋到0.01%，即得到麻醉所用的工作液。

潑尼松龍溶液的配制：稱取 0.18 g 潑尼松龍（上海源葉生物）粉末，加入 20 mL 的二甲基亞砜溶液中，并使用玻璃棒攪拌使其完全溶解后加蒸餾水定容至1 L，獲得母液濃度為500 μmol/L潑尼松龍溶液，從500 μmol/L潑尼松龍溶液中量取250 mL的液體，再用蒸餾水稀釋4倍后定容至1 L，配制成125 μmol/L的潑尼松龍溶液。

1.5 OCT圖像定量化方法

此方法通過對采集到的骨質(zhì)疏松的斑馬魚0、7、14、21 d的OCT圖像依次進行圖像灰度化、區(qū)域分割、閾值分割、投影、統(tǒng)計分析，最后進行BMD統(tǒng)計，其處理流程圖如圖1所示。

圖1 圖像處理流程圖Fig. 1 Flow chart of image processing

國際照明委員會選擇的色彩三基色是紅色（R）、綠色（G）和藍色（B），三基色按照一定比例混合就可以得到自然界中幾乎所有色彩?？紤]到OCT圖像顏色單調(diào)，轉(zhuǎn)化成灰度圖像仍能保留完整的信息，而且從空間和速度方面考慮，將彩色圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖像，不僅可以減少運算量，提高數(shù)據(jù)處理速度，還可以減少圖像存儲空間。圖片的灰度化就是將彩色圖片中的色度和飽和度刪除，僅保留其亮度信息。彩色圖像進行灰度化有 4 種常用方法：三色均值法、最大分量法、加權(quán)平均法、轉(zhuǎn)化到其他顏色空間方法［22］。

本文采用加權(quán)平均法進行灰度化，應該根據(jù)圖像包含的信息或?qū)D像信息提取的要求，賦予R、G、B 不同的權(quán)值。權(quán)重可以根據(jù)R、G、B 三色分布直方圖獲得3個分量的取值范圍。本文的灰度化處理公式如下：

圖像分割就是把圖像分成若干個特定的、具有獨特性質(zhì)的區(qū)域，并提出感興趣目標的技術(shù)和過程，它是由圖像處理到圖像分析的關鍵步驟。本文使用基于區(qū)域的圖像分割方法，圖像區(qū)域分割的目的是從圖像中劃分出某個物體的區(qū)域，即找出那些對應于物體或物體表面的像元集合［23］，將斑馬魚顱骨所在區(qū)域單獨分割出來進行處理，便于排除圖像底部噪聲干擾。本文使用imcrop函數(shù)對原OCT圖像進行區(qū)域分割。在Matlab軟件中，該函數(shù)用于裁剪圖像區(qū)域，可把圖像顯示在一個圖像窗口中，且允許用戶以交互方式使用鼠標選定要剪切的區(qū)域。

由于灰度圖片中還存在背景和噪聲，要想直接從圖片中獲取顱骨圖像，需要先將灰度圖像進行二值化，極大程度上減少圖片非顱骨分析部分中弱噪聲對整體BMD提取的影響。對OCT圖片進行二值化的處理需要設定一個灰度閾值t，將灰度大于閾值的設置為1，小于閾值的設置為0，如式（2）所示。

從式（2）可以看出，灰度閾值t對二值化處理結(jié)果影響很大，本文中所采用的t值為255×0.85，即216.75，為多次測試后所選取，此值對弱噪聲過濾效果較好，同時對圖像中顱骨信息保留程度較高。

1.6 測量和統(tǒng)計方法

斑馬魚顱骨的BMD均是使用專業(yè)軟件Matlab在圖像上測量獲取的，通過Matlab編寫的程序獲取得到的相關參數(shù)，包括代表骨質(zhì)缺失數(shù)e、骨質(zhì)數(shù)d、總數(shù)e+d、比值e/d和缺失比e/（e+d）。對收集到的a、b、c、d組數(shù)據(jù)［比值e/d和缺失比e/（e+d）］通過Origin軟件進行處理分析，基于定量數(shù)據(jù)說明潑尼松龍誘導的不同天數(shù)斑馬魚顱骨BMD的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間點骨質(zhì)疏松斑馬魚模型OCT結(jié)果

圖2a～2d分別是使用蒸餾水培育0 d的斑馬魚顱骨OCT圖和125 μmol/L潑尼松龍溶液浸泡7、14、21 d的斑馬魚顱骨OCT圖，其中顱骨為圖中高亮部分，藍色箭頭指向顱骨骨質(zhì)疏松區(qū)域。由OCT圖可以看到，隨著潑尼松龍溶液浸泡斑馬魚的時間增加，骨質(zhì)疏松區(qū)域明顯增多。

圖2 在0、7、14、21 d的斑馬魚顱骨OCT圖Fig. 2 OCT images of zebrafish skull at day 0, 7, 14 and 21

2.2 不同時間點骨質(zhì)疏松斑馬魚模型的OCT投影結(jié)果

由圖3可知，0 d顱骨BMD信息較為完整，隨著潑尼松龍溶液浸泡時間增加，7、14和21 d的斑馬魚顱骨BMD逐漸降低。如何將BMD信息提取出來作為定量評價指標成為關鍵。本文通過使用Matlab中的for函數(shù)將圖像中為1的值分別投影在顱骨圖像的上方。式（3）（其中b為一個過程變量，g為處理后圖像矩陣，k為圖像縱列數(shù)，從1至圖像g最后一列）尋找圖像中每一列值為1的位置，并通過for函數(shù)使其投影在圖中指定位置。如圖3中上方投影線所示，展示BMD以及缺損位置的投影線理論上與下方顱骨圖像保持一致。

2.3 斑馬魚BMD的定量

e為圖值為0的個數(shù)，d為圖值為1的個數(shù)，兩者比值統(tǒng)計圖如4所示，隨時間的增加，0、1比例逐漸增大，可以說明斑馬魚在125 μmol/L的潑尼松龍溶液中顱骨骨質(zhì)疏松程度隨時間天數(shù)的增多而增大，斑馬魚顱骨BMD隨時間增加而降低，并且在第21 天 0、1比例達0.945，接近值1.0，與圖3d顱骨骨質(zhì)疏松情況基本符合。而由圖5缺失比統(tǒng)計圖可知，e/（e+d）逐漸增大，其中e+d表示一幅圖中0和1的總個數(shù)，同樣可以表明顱骨的缺失情況，即斑馬魚在125 μmol/L潑尼松龍溶液中培養(yǎng)的時間越長，顱骨缺失比越大。

圖3 0、7、14和21 d斑馬魚顱骨BMD檢測Fig. 3 BMD of zebrafish skull at 0, 7, 14 and 21 days

Fig. 4 不同天數(shù)的125 μmol/L潑尼松龍溶液斑馬魚顱骨BMD定量分析Fig. 4 Quantitative analysis of bone BMD of 125 μmol/L prednisolone solution zebrafish on different days

Fig. 5 不同天數(shù)的125 μmol/L潑尼松龍溶液斑馬魚顱骨BMD定量分析Fig. 5 Quantitative analysis of bone BMD of 125 μmol/L prednisolone solution zebrafish on different days

3 討論

動物模型是揭示人類發(fā)育機制、疾病機理和系統(tǒng)功能的重要工具［24］。由于斑馬魚具有胚胎透明、骨骼發(fā)育迅速、與人類相關基因和信號通路有高度同源性等特點, 已經(jīng)被成功用于建立骨骼研究模型［25］，基于此類模型的研究對于人類疾病的探討和研究具有重大價值與意義。目前，許多學科已成功構(gòu)建了各自需要的斑馬魚骨骼疾病模型，特別是在骨骼再生能力方面的研究上。再生醫(yī)學是當今科學研究的前沿和熱點，在世界范圍內(nèi)的發(fā)展日新月異，已成為最具轉(zhuǎn)化前景的研究領域之一，并極大地促進了其他相關領域的進展。本課題組的前期研究證實了OCT技術(shù)能夠有效地穿透成年斑馬魚的顱骨［26］，并且通過斑馬魚顱骨損傷的病理和高分辨率OCT圖像的對比，已經(jīng)證明了OCT技術(shù)在骨骼方面的監(jiān)測完全具有可靠性［27］。

本研究應用OCT和Matlab技術(shù)研究了一種新的骨質(zhì)疏松斑馬魚BMD定量分析的方法。通過對使用潑尼松龍溶液誘導的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的不同時間點的OCT圖像進行處理和信息的提取，根據(jù)Matlab程序提取出的數(shù)據(jù)可以推測出骨質(zhì)疏松程度與斑馬魚在潑尼松龍溶液中培養(yǎng)的時間是呈正相關的，并且Matlab程序?qū)?shù)據(jù)的投影直觀地描述了BMD在骨質(zhì)疏松斑馬魚不同時間點的差異。我們的工作進一步揭示了它在與數(shù)字圖像技術(shù)相結(jié)合的條件下的潛力。在這種情況下，一方面可以實現(xiàn)現(xiàn)有領域的定量研究和圖像分析，另一方面，如果應用于特殊生物醫(yī)用領域，可發(fā)展成為BMD專業(yè)測量儀器。本文旨在提出一種簡單、有效地定量分析BMD的方法，但沒有進行BMD檢測作為對照。因此定量分析的置信度仍待檢驗。另外，OCT圖像定量化方法中t值的確定仍需要人工進行對照，確定t值時，需要防止t值過小，OCT圖像保留噪點過多和t值過大，OCT圖像保留信息過少。

綜上所述，本文提出了一種簡易、有效地定量分析斑馬魚骨質(zhì)疏松程度的新方法，在試驗動物的骨發(fā)育、再生機理驗證和評估以及骨促藥物等研究上將具有廣泛的應用前景，特別是在潑尼松龍誘導的不同天數(shù)對斑馬魚BMD的影響、大通量斑馬魚骨質(zhì)疏松藥物篩選、藥物評價等方面具有明顯的研究優(yōu)勢，是一種將斑馬魚骨密度定量化分析的新方法。