張湘豫，張艷群，盧夢云，胡溢洪，韓語誠，鄒先瓊*

（1. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，桂林 541004；2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，長沙 410008；3. 桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541199）

人類糖脂轉(zhuǎn)運蛋白（glycolipid thansfer protein，GLTP）是一種能在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)間特異性轉(zhuǎn)運鞘糖脂及維持細(xì)胞內(nèi)鞘糖脂穩(wěn)態(tài)的可溶性蛋白（24 kD），其基因位于染色體12（12q24.11）［1-2］。與其他脂類轉(zhuǎn)運蛋白相比，人類GLTP蛋白及其相關(guān)同源物主要含有由α螺旋構(gòu)成的雙層“三明治”狀的獨特空間結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被稱為GLTP折疊，GLTP折疊目前被認(rèn)為是真核生物糖脂轉(zhuǎn)運蛋白超家族的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及原型蛋白［3-4］。GLTP蛋白家族成員包括4-磷酸磷脂酰肌醇銜接蛋白2（phosphatidylinositol 4-phosphate adaptor protein-2，F(xiàn)APP2）、人1-磷酸神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運蛋白（ceramide-1-phosphate transfer protein，CPTP）、人類糖脂轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域2蛋白（glycolipid transfer protein domain containing 2，GLTPD2）、促細(xì)胞死亡蛋白11（accelerated cell death 11，ACD11）等［1，5-6］。其中，ACD11是植物神經(jīng)酰胺水平的中間調(diào)節(jié)蛋白［8］。

人類GLTPD2的GLTP結(jié)構(gòu)域位于第102～252位氨基酸殘基，第1～36位氨基酸殘基為N端信號肽，第13～32位氨基酸殘基為跨膜區(qū)，分子量大小為31.6 kD，等電點為10.19［8］。GLTPD2是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與該基因有關(guān)的基因本體論（gene ontology，GO）注釋包括糖脂結(jié)合和糖脂轉(zhuǎn)運蛋白活性，該基因的重要旁系同源物是CPTP［1，9］。有研究發(fā)現(xiàn)，GLTPD2mRNA在正常肝臟組織中有特別高的表達(dá)［1，8］。同時，研究顯示，GLTPD2也與腸、腎等組織的功能及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。

肝細(xì)胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是一種重要的腫瘤，目前是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，全球每年有超過85萬例新發(fā)LIHC患者，且這一數(shù)字正在上升［10］。LIHC發(fā)展的各種危險因素包括肝硬化（由纖維化引起的慢性肝損傷）、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、酒精濫用和代謝綜合征等［10-12］。盡管近幾十年來在腫瘤的治療和臨床診斷方面取得了一些進(jìn)展，但是LIHC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制尚不清楚［13］，因此，探究肝臟組織的癌變機(jī)制，探索癌癥早期診斷、準(zhǔn)確預(yù)后和治療靶點的潛在生物標(biāo)志物具有重要意義。迄今，GLTP蛋白家族成員在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚不清楚，因而從多數(shù)據(jù)庫分析GLTPD2在LIHC中的作用對理解GLTP家族成員的生物學(xué)功能具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 GLTPD2在LIHC中的表達(dá)情況與臨床病理特征之間的關(guān)系分析

采用LinkedOmics網(wǎng)站分析GLTPD2表達(dá)水平與LIHC臨床病理因素的相關(guān)性。LinkedOmics網(wǎng)站（http://www.linkedomics.org/login.php）包含來自TCGA項目的32種癌癥類型共計11 158名患者的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)［14］。檢索步驟：1）選擇腫瘤類型為“LIHC”； 2）選擇TCGA-LIHC RNAseq數(shù)據(jù)；3）輸入目的基因“GLTPD2”； 4）選擇數(shù)據(jù)中聯(lián)合分析臨床數(shù)據(jù)“TCGA-LIHC Clinical”； 5）選擇“Non-Parametric Test”。用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）在線工具分析比較肝癌組織與癌旁正常組織的mRNA表達(dá)量［15］。

1.2 GLTPD2表達(dá)水平對LIHC患者預(yù)后的影響分析

用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的LIHC數(shù)據(jù)集分析GLTPD2表達(dá)量與LIHC患者預(yù)后關(guān)系［16］。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（https://kmplot.com/analysis/）可以對來自多個數(shù)據(jù)庫的54 000個基因影響21種癌癥類型的生存率進(jìn)行深度分析［17］。設(shè)定條件：1）Cancer。liver hepatocellular carcinoma（n=364）。2）Gene symbol。GLTPD2。3）Survival。Overall survival。4）Split patients by。median，選擇Auto select best cutoff。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）及Oncolnc數(shù)據(jù)庫（http://www.oncolnc.org）做進(jìn)一步的驗證［18］。

1.3 GLTPD2在LIHC組織中細(xì)胞免疫浸潤情況分析

采用Timer 2.0數(shù)據(jù)庫分析GLTPD2在LIHC組織中細(xì)胞免疫浸潤情況。Timer 2.0數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/）是一個綜合性的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，可用于系統(tǒng)分析不同類型癌癥的免疫浸潤，該版本的webserver提供了多種方法估計免疫浸潤豐度，允許用戶動態(tài)生成高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，全面探索腫瘤的免疫學(xué)、臨床和基因組特征［19-21］。

1.4 GLTPD2及其共表達(dá)基因的GO注釋分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析

在篩選了常見的GLTPD2相關(guān)基因后，使用Metascape工具進(jìn)行了進(jìn)一步的GO分析和KEGG分析。GO分析包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）［22］。為了驗證GLTPD2共表達(dá)基因的注釋，進(jìn)一步使用了David（注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫）在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫［23］。David是一種生物數(shù)據(jù)的分析工具，用于整合和提供生物功能的信息［23-24］。

1.5 預(yù)后模型的生成和預(yù)測

為了更好地預(yù)測LIHC患者的預(yù)后，使用“rms”程序包（6.2-0版本）和survival包（3.2-10版本），基于Cox回歸分析結(jié)果構(gòu)建了一個列線圖。列線圖可以將統(tǒng)計預(yù)測模型簡化為一個針對單個患者定制的總生存期（overall survival，OS）概率的單一數(shù)值評估，因此被廣泛應(yīng)用于癌癥患者的預(yù)后［25-27］。模型納入臨床分期的T stage，N stage，M stage，GLTPD2表達(dá)和病理分期4個獨立的預(yù)后因素變量的預(yù)測模型中。采用多變量Cox回歸分析，選擇所有獨立預(yù)后因素的聯(lián)合模型構(gòu)建Nomogram圖，預(yù)測肝細(xì)胞癌患者1、3、5年OS的概率。隨后，采用了1 000個重樣的一致性指數(shù)（C指數(shù)）對列線圖進(jìn)行了鑒別和校準(zhǔn)，并通過繪制列線圖預(yù)測概率與觀測率的關(guān)系，對列線圖的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行圖形化評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLTPD2表達(dá)水平與LIHC各臨床病理特征的關(guān)系

LIHC與臨床病理分期（pathologic stages，stageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、年齡以及TNM（tumor node metastasis staging system）分期中的T分期、N分期等顯著相關(guān)。LIHC的臨床病理分期與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。GLTPD2表達(dá)在LIHC的不同臨床病理分期（stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）里差異顯著，stage Ⅰ期顯著高于stage Ⅱ期、stage Ⅲ期（圖1a）；隨著患者年齡增大，GLTPD2表達(dá)增高（圖1b）；T1分期與T4分期的GLTPD2表達(dá)顯著高于其他分期組（圖1c）；N1分期的GLTPD2表達(dá)顯著低于N0分期組（圖1d）；M1分期的GLTPD2表達(dá)與M0分期的GLTPD2表達(dá)差異不顯著（圖1e）；UALCAN在線工具分析顯示，LIHC與癌旁組織相比，GLTPD2mRNA在LIHC中低表達(dá)，差異有顯著相關(guān)性（圖1f）。

圖1 GLTPD2表達(dá)與LIHC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Fig. 1 Relationship between GLTPD2 expression and clinical pathological parameters of LIHC

2.2 GLTPD2的表達(dá)與LIHC患者預(yù)后的關(guān)系

通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對364個樣本進(jìn)行生存預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)GLTPD2低表達(dá)組總生存期更短，預(yù)后更差（圖2a）。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析表明，GLTPP2低表達(dá)組無病生存期（圖2b）及總生存期（圖2c）更短，預(yù)后更差。Oncolnc數(shù)據(jù)庫［14，17］分析可進(jìn)一步證實以上生存分析結(jié)論，GLTPD2低表達(dá)組生存期更短且預(yù)后更差（圖2d）。

圖2 GLTPD2表達(dá)水平與LICH患者預(yù)后的生存曲線Fig. 2 Relationship between GLTPD2 expression and prognosis of LIHC patients

2.3 GLTPD2與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系

Timer 2.0數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，GLTPD2在LIHC免疫微環(huán)境中與腫瘤細(xì)胞純度、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，差異有顯著相關(guān)性（圖3）。

圖3 GLTPD2表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性Fig. 3 Correlation between expression level of GLTPD2 and infiltration level of immune cells

2.4 GLTPD2及其共表達(dá)基因的GO注釋分析和KEGG通路富集分析

為了預(yù)測與GLTPD2共表達(dá)基因的功能，在Metascape平臺上進(jìn)行了GO分析和KEGG通路分析。GLTPD2共表達(dá)基因顯著參與限速酶催化作用、蛋白結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合、蛋白磷酸化氨基酸結(jié)合、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、甲基轉(zhuǎn)移酶的活性和泛素樣蛋白的連接（圖4a）。這些基因在胰島素信號通路和呼吸電子傳遞鏈、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和蛋白激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中顯著富集（圖4b、4c）。

2.5 預(yù)后模型的生成和預(yù)測

預(yù)后模型中每個指標(biāo)的取值范圍對應(yīng)一個分?jǐn)?shù)范圍，各個指標(biāo)的取值通過向上作一垂線可以得出一個具體的分?jǐn)?shù)，所有指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加獲得患者的總分，通過總分向下作一垂線可以得出LIHC患者在1、3和5年時生存的概率［27］。如1例LIHC患者為T2分期、N1分期、M1分期、stage II，則GLTPD2表達(dá)為8，則該患者的總分為110，對應(yīng)的患者在1年時的生存率為55%，3年時生存率為30%，5年時生存率為18%，提示GLTPD2表達(dá)的異常會影響LIHC患者在1、3和5年時生存的概率（圖5a）。對列線圖的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行圖形化評價，提示模型預(yù)測效果比較好（圖5b）。

圖5 GLTPD2在LIHC中預(yù)后預(yù)測模型Fig. 5 Predicted prognostic model of GLTPD2 in LIHC

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，2020年約有905 677例肝癌新發(fā)病例，830 180例肝癌死亡［28］。雖然以根治性手術(shù)為基礎(chǔ)的外科治療大大改善了患者預(yù)后，但肝癌的5年生存率僅為12%［29］。因此，探討LIHC的發(fā)病、病理機(jī)制，為患者提供早期干預(yù)，從而降低肝癌患者的發(fā)病率和死亡率具有重大的防治意義［30］。本研究使用了多個在線數(shù)據(jù)庫和工具，對GLTPD2在LIHC中的表達(dá)及其潛在機(jī)制進(jìn)行了分析。通過分析相關(guān)基因在臨床上的表達(dá)及意義，為尋找相關(guān)治療靶點提供了新途徑。

人類GLTPD2是GLTP家族的一個新成員，GLTPD2是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與該基因有關(guān)的GO注釋包括糖脂結(jié)合和糖脂轉(zhuǎn)運蛋白活性［8］。有研究闡明，人類GLTPD2與肝、腸、腎等組織的功能及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。GLTPD2是新生小鼠壞死性小腸結(jié)腸炎中上調(diào)程度最高的15個基因之一，也是單聚體而非五聚體c反應(yīng)蛋白處理內(nèi)皮祖細(xì)胞時上調(diào)程度最高的12個基因之一。五聚體c反應(yīng)蛋白與單體c反應(yīng)蛋白的分離被認(rèn)為參與了動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生部位的局部促炎癥反應(yīng)［31］。在最近的一項全基因關(guān)聯(lián)研究中，GLTPD2被確定為35個脂類相關(guān)基因位點中與心血管疾病風(fēng)險相關(guān)的10個基因突變體之一［31-32］。然而，關(guān)于GLTPD2在LIHC中的作用罕有報道。

本研究中GLTPD2在LIHC組織中高表達(dá)并與臨床分期呈負(fù)相關(guān)，有利于LIHC患者的生存。GLTPD2表達(dá)與LIHC患者的臨床病理分期、TNM分期顯著相關(guān)，提示了GLTPD2低表達(dá)與LIHC患者的不良預(yù)后呈顯著相關(guān)。數(shù)據(jù)分析提示了GLTPD2的表達(dá)與患者年齡呈顯著相關(guān)，隨著患者年齡增大，GLTPD2的表達(dá)增高。GLTPD2在LIHC免疫微環(huán)境中與腫瘤細(xì)胞純度、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，提示GLTPD2可能通過調(diào)節(jié)LIHC組織中腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤發(fā)揮作用。因此，可以推測，GLTPD2在LIHC的發(fā)生過程中激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生某種特定抗腫瘤免疫應(yīng)答。GLTPD2共表達(dá)基因顯著參與限速酶的催化作用、蛋白結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合、蛋白磷酸化氨基酸結(jié)合、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、甲基轉(zhuǎn)移酶的活性和泛素樣蛋白的連接。這些共表達(dá)基因在胰島素信號通路、呼吸鏈電子傳遞、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和蛋白激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中顯著富集，提示GLTPD2調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，在維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)、能量代謝等生物學(xué)功能中具有重要的作用。

綜上所述，本研究揭示了GLTPD2的低表達(dá)與LIHC的不良預(yù)后有關(guān)，是一個潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。而通過藥物處理特異性誘導(dǎo)GLTPD2的表達(dá)，可能成為LIHC的潛在治療方案。本研究使用了多個在線數(shù)據(jù)庫，對GLTPD2在肝癌中的表達(dá)及其潛在機(jī)制進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。該方法的優(yōu)點是能夠獲得大量的樣本群體、成本低、能開展大規(guī)模的基因組研究和功能分析［24］。然而，生物信息學(xué)分析研究不可避免地存在一些局限性。首先，由于收集的樣本量不同，不同數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析結(jié)果也可能不同。其次，本研究僅研究了基于幾個不同在線數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析結(jié)果。因此，需要進(jìn)一步的試驗來驗證GLTPD2在LIHC中的作用機(jī)制。