王 梅，張永勤，黃 靖，彭亮躍，劉文彬，肖亞梅，劉錦輝

（省部共建淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410081）

體色是動(dòng)物的基本特征之一，而身體顏色和圖案是體色的重要特征，在其生存和繁殖中發(fā)揮著重要作用。魚(yú)類(lèi)體色是由皮膚以及皮膚衍生物鱗片上的色素細(xì)胞的種類(lèi)和分布決定的［1-3］。色素細(xì)胞主要包含六類(lèi)，分別是紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞和鱖類(lèi)中的藍(lán)色素細(xì)胞［4-6］。不同的色素細(xì)胞包含不同的色素顆粒，色素顆粒的遷移和分布均會(huì)導(dǎo)致體色的改變。不同魚(yú)色素細(xì)胞的種類(lèi)也存在差異，斑馬魚(yú)和黑棘鯛具有三類(lèi)色素細(xì)胞，分別是黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞［7-8］；青鳉除了具備黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞三類(lèi)色素細(xì)胞外，還包括相對(duì)少見(jiàn)的白色素細(xì)胞［9］；鯉［10］、鯽［11］、血鵬鵝［12］等觀賞魚(yú)類(lèi)的色素細(xì)胞有四類(lèi)，分別是黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、鳥(niǎo)糞素細(xì)胞。紅斑馬魚(yú)原產(chǎn)于印度，個(gè)體小、易于飼養(yǎng)和繁殖，是一類(lèi)比較受歡迎的觀賞性魚(yú)類(lèi)。其胚胎透明，成活率較高，且成熟期周期短，成熟期雌雄斑馬魚(yú)可3～5 d進(jìn)行一次催產(chǎn)，是比較常用的模式生物之一，被廣泛應(yīng)用于物種遺傳、發(fā)育等研究中［13-14］，但目前關(guān)于紅斑馬魚(yú)的體色研究還沒(méi)有詳細(xì)的報(bào)道。

魚(yú)類(lèi)體色的形成本質(zhì)上是受遺傳基因控制的，主要包括膜受體基因、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因、配體基因和合成途徑中相關(guān)酶類(lèi)基因等［15］，而這些基因則主要通過(guò)對(duì)不同類(lèi)別的色素細(xì)胞調(diào)控起作用。在對(duì)色素細(xì)胞的認(rèn)知中，黑色素細(xì)胞是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛而深入的色素細(xì)胞。黑素細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（melanocyte inducing transcription factor，MITF）作為體色遺傳調(diào)控信號(hào)通路上的核心調(diào)控因子，對(duì)黑色素合成和存儲(chǔ)起到主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［16-17］。MITF有MITFA和MITFB兩個(gè)亞型，MITFA對(duì)于神經(jīng)脊黑色素細(xì)胞的分化和發(fā)育是必須的，包括調(diào)控黑色素標(biāo)記物多巴色素互變異構(gòu)酶 (dopachrome tautomerase，DCT) 的表達(dá)和黑色素細(xì)胞的分化，以及分化后黑色素細(xì)胞樹(shù)突形式的維持［18-19］。已報(bào)道的研究認(rèn)為，在干細(xì)胞中mitfa基因是非必需的，但mitfa在胚體中表達(dá)，且對(duì)于維持黑色素發(fā)育前體是必不可少的，mitfb則主要在視網(wǎng)膜色素上表達(dá)。這表明mitfa基因?qū)ε咛バ秃统审w型魚(yú)類(lèi)黑色素細(xì)胞均具有功能［20］。黑色素的合成通路是對(duì)黑色素色素沉著機(jī)制研究的重要進(jìn)展，包括黑色素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝［21-22］。α-黑色素細(xì)胞刺激素（alphamelanocyte stimulating hormone，α-MSH）參與黑色素的合成［23］。黑皮質(zhì)激素-1受體與α-MSH結(jié)合，在G蛋白的作用下，可誘導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的增加，通過(guò)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase，PKA）發(fā)揮信號(hào)分子作用［22-25］，引發(fā)MITF、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶1（tyrosinase related protein 1，TRP1 ）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶2（tyrosinase related protein 2，TRP2）的表達(dá)上調(diào)，刺激黑色素的合成［26］。

CRISPR/Cas9作為一種比較新型的敲除技術(shù)，Cas9蛋白和目的基因gRNA形成混合物，通過(guò)與PAM序列結(jié)合并且入侵DNA，形成DNA-RNA復(fù)合物，進(jìn)而對(duì)DNA進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，從而形成缺失或突變［27，30-31］。目前該技術(shù)在斑馬魚(yú)中應(yīng)用廣泛［30］。本試驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建紅斑馬魚(yú)mitfa基因敲除體系，探究mitfa基因在紅斑馬魚(yú)體色形成中的作用，驗(yàn)證其對(duì)早期黑色素細(xì)胞的發(fā)育和分化產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio）來(lái)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。

1.2 紅斑馬魚(yú)魚(yú)鰭色素細(xì)胞觀察

將紅斑馬魚(yú)通過(guò)MS-222麻醉后，準(zhǔn)備好鑷子、剪刀，使用75%酒精進(jìn)行消毒，在顯微鏡下分別剪取背鰭、臀鰭、腹鰭、胸鰭，用鑷子夾取鱗片，使用生理鹽水清洗干凈后制成臨時(shí)裝片，使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3 紅斑馬魚(yú)早期體色發(fā)育過(guò)程的觀察

取已足三月齡、性成熟的雌雄紅斑馬魚(yú)進(jìn)行體外人工受精。收集胚胎，體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育過(guò)程以及早期體色的形成。選擇胚胎時(shí)，需要取同一批次同一時(shí)期的胚胎，一批次胚胎通常200～300枚，篩選10～20枚質(zhì)量相對(duì)比較好的胚胎進(jìn)行觀察，拍照并記錄總結(jié)色素發(fā)育的一般特征。

1.4 紅色斑馬魚(yú)mitfa基因的敲除

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取斑馬魚(yú)mitfa基因序列，序列號(hào)為NM_130923.2，第二號(hào)外顯子上NGG前面20 bp為靶序列，在ZiFiT軟件 (http://zifit.partners.org/ZiFiT/)中輸入斑馬魚(yú)mitfa基因第二號(hào)外顯子序列，得到了20 bp的堿基序列作為靶向序列。通過(guò)PCR方法合成DNA靶向序列，其中合成gRNA模板的正向引物為：TGTAATACGACTCACTATAGGAGCGCTGGCTCCGGGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；合成gRNA模版的反向引物為：AAGCACCGACTCGGTGCCACT。

以P42250質(zhì)粒［32］為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇PCR產(chǎn)物中的目的片段進(jìn)行膠回收，進(jìn)行g(shù)RNA體外轉(zhuǎn)錄，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的產(chǎn)物是否是目的條帶，并測(cè)濃度后置于-80℃分裝保存。將pT3TS-nzCas9n質(zhì)粒［質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心，貨號(hào)為pT3TS-nCas9n Bacterial Expression，CRISPRT3Cas9（Synthetic）］ 進(jìn)行酶切得到的線性化質(zhì)粒［33］作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的產(chǎn)物是否是目的條帶，并測(cè)濃度后置于-80℃分裝保存。將所得的gRNA和Cas9 mRNA混合后進(jìn)行顯微注射，體式顯微鏡觀察注射后的胚胎發(fā)育過(guò)程。選取3個(gè)月性成熟的雌/雄試驗(yàn)斑馬魚(yú)，與三月齡野生型（wild type，WT）雌/雄斑馬魚(yú)進(jìn)行雜交得到F1代雜合子，F(xiàn)1代自交獲得mitfa-/-純合子紅斑馬魚(yú)。其中F0代胚胎注射情況見(jiàn)表1，F(xiàn)1代獲得的雜合子和F2代得到的純合子情況見(jiàn)表2。

表1 胚胎顯微注射情況統(tǒng)計(jì)Tab. 1 Embryo injection statistics

表2 雜合子和和純合子獲得情況統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Statistics of acquisition of heterozygotes and homozygotes

2 結(jié)果與分析

2.1 紅斑馬魚(yú)體色色素細(xì)胞的觀察

紅色斑馬魚(yú)整體背腹部以及兩側(cè)呈紅色，背鰭、臀鰭、尾鰭呈黃白條紋相間分布（圖1）。在顯微鏡下觀察其背鰭、臀鰭、腹鰭和胸鰭，發(fā)現(xiàn)背鰭有橙黃色色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞呈點(diǎn)狀均勻分布（圖2a），臀鰭有點(diǎn)狀和片狀的橙紅色色素細(xì)胞，但沒(méi)有黑色素細(xì)胞分布（圖2b），腹鰭為大量片狀的橙黃色色素細(xì)胞，無(wú)黑色素細(xì)胞（圖2c），同時(shí)在胸鰭中沒(méi)有黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞分布，也無(wú)虹彩細(xì)胞（圖2d）。體式顯微鏡下觀察紅斑馬魚(yú)各鰭基部鱗片，發(fā)現(xiàn)只有背鰭基部鱗片頂端有片狀的黃色素細(xì)胞。

圖1 紅斑馬魚(yú)背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭觀察位置Fig. 1 Observation positions of dorsal, pectoral, pelvic and anal fins of red zebrafish

圖2 紅斑馬魚(yú)背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭光學(xué)顯微鏡色素細(xì)胞觀察Fig. 2 Optical microscope observation of pigmented cells in the dorsal, pectoral, pelvic and anal fins of red zebrafish

2.2 紅斑馬魚(yú)早期體色色素發(fā)育的觀察

通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紅斑馬魚(yú)最先形成色素的區(qū)域?yàn)檠鄄亢缒ば纬傻暮谏丶?xì)胞，并逐漸增多（圖3a、3b），眼色素加深，黑色素沿著背部不斷向尾部遷移（圖3c），之后黃色素開(kāi)始形成，由頭部向背部以及腹部遷移（圖3d）。頭部黑色素細(xì)胞形成樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)，黃色素細(xì)胞呈片狀，在頭部分布密集，在腹部分布相對(duì)稀疏。紅斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程，分變色前、變色中、變色后三部分。紅色斑馬魚(yú)變色前（圖3e、3f）可以看到頭部、背部以及腹部均有大量的點(diǎn)狀黑色素細(xì)胞，出膜第10天（圖3g），斑馬魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)變色，首先是魚(yú)體肌肉變?yōu)闇\紅，第15天（圖3h）淺紅色加深，背部可見(jiàn)黑色素細(xì)胞顆粒，并在發(fā)育后期，色素逐漸向各鰭上遷移，最終形成紅、銀白相間的成魚(yú)（圖3i）。

圖3 紅斑馬魚(yú)早期體色發(fā)育觀察Fig. 3 Observation on early body color development of red zebrafish

2.3 紅斑魚(yú)mitfa基因的敲除

首先，通過(guò)gRNA和Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄得到了所需的敲除體系，具體如圖4a所示。圖4b為Cas9和gRNA的體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果，其中g(shù)RNA目的帶約為100 bp。通過(guò)構(gòu)建CRISPR/Cas9mitfa基因敲除體系，成功得到了紅斑馬魚(yú)敲除的突變體，隨機(jī)敲除了mitfa第二號(hào)外顯子的6 bp和9 bp堿基序列。圖4c為敲除24個(gè)堿基的雜合序列的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)F0代雜交獲得F1代雜合子，F(xiàn)1代自交最終得到了紅斑馬魚(yú)F2代mitfa-/-突變體（圖4d）。敲除mitfa基因后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組皮膚黑色素細(xì)胞相對(duì)野生型紅斑馬魚(yú)明顯減少，且只有背部殘留少量的黑色素細(xì)胞，這表明mitfa基因在紅斑馬魚(yú)中同樣決定著黑色素細(xì)胞的命運(yùn)。

圖4 紅斑馬魚(yú)mitfa基因敲除Fig. 4 mitfa gene knockout in red zebrafish

3 討論

魚(yú)類(lèi)體色和斑紋形成在細(xì)胞水平上是色素細(xì)胞種類(lèi)、分布及其相互作用的反映，是一種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。紅斑馬魚(yú)體表呈紅、銀白條紋相間，分布有紅黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和少量的虹彩細(xì)胞，其豐富的體表特征為研究體色色素細(xì)胞提供了優(yōu)良的材料。本文通過(guò)對(duì)紅斑馬魚(yú)體表的胸鰭、腹鰭、背鰭、臀鰭等部位進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了呈橙黃色點(diǎn)狀分布的紅色素細(xì)胞和片狀分布的黃色色素細(xì)胞。這一進(jìn)步說(shuō)明紅黃色素的形成與胡蘿卜素和蝶啶的含量比有關(guān)，若蝶啶多于類(lèi)胡蘿卜素則形成黃色素細(xì)胞，反之則形成紅色素細(xì)胞［28］。嚴(yán)峻麗等［34］研究了圓斑星鰈早期發(fā)育過(guò)程中色素細(xì)胞的形成情況，結(jié)果顯示，最先生成的是黑色素細(xì)胞，其次是黃色素細(xì)胞，最后形成虹彩細(xì)胞；劉偉等［35］對(duì)鱖早期體色發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，其色素細(xì)胞也是先形成黑色素細(xì)胞，其后是黃色素細(xì)胞，最后形成虹彩細(xì)胞。圓斑星鰈和鱖的體色發(fā)育均與紅斑馬魚(yú)早期體色發(fā)育相一致。觀賞魚(yú)類(lèi)體色和斑紋直接決定了其觀賞價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值，多數(shù)觀賞魚(yú)類(lèi)從仔魚(yú)到幼魚(yú)階段都存在一個(gè)重要的黑色素消退現(xiàn)象。一般出膜前后，魚(yú)體開(kāi)始形成黑色素細(xì)胞且數(shù)目逐漸增加，體表主要呈黑色，而后再慢慢不同程度地褪去黑色，呈現(xiàn)不同的色澤或斑紋。Zhang等［36］揭示了紅鯽體色“灰轉(zhuǎn)紅”的變化過(guò)程，范云鵬等［37］闡述了關(guān)于花鯽魚(yú)“青轉(zhuǎn)花”的現(xiàn)象。紅斑馬魚(yú)早期色素發(fā)育過(guò)程中，變色前，背部首先形成黑色素細(xì)胞，逐漸增多并沿著背部和腹部遷移，此時(shí)也開(kāi)始形成黃色素細(xì)胞并遷移；變色過(guò)程中，幼魚(yú)體表有少部分紅色素細(xì)胞形成，黑色素細(xì)胞減少，且部分消失，即出膜0～20 d黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，從20 d左右開(kāi)始呈現(xiàn)黑色素細(xì)胞減少的趨勢(shì)，直到黑色素細(xì)胞完全消退。大部分觀賞魚(yú)性周期長(zhǎng)，紅斑馬魚(yú)為存在“黑色素消退”現(xiàn)象的觀賞魚(yú)提供了一種新的模式動(dòng)物。

MITF參與多個(gè)信號(hào)通路，如MC1R/α-MSH信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等，在黑色素合成過(guò)程中起著核心的調(diào)控作用［29］。本研究選取紅斑馬魚(yú)第二號(hào)外顯子作為敲除靶向序列，通過(guò)CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建了mitfa基因敲除體系。顯微注射紅斑馬魚(yú)胚胎發(fā)現(xiàn)，相較于正常紅斑馬魚(yú)，皮膚背部黑色素細(xì)胞明顯減少，這表明在紅斑馬魚(yú)中，mitfa仍然是控制黑色素細(xì)胞發(fā)育的主要調(diào)控基因，mitfa的敲除會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的減少、消退，而mitfa的敲除對(duì)黃色素細(xì)胞以及虹彩細(xì)胞造成的影響并不明顯。Jessica等［38］對(duì)小鼠的MITF的亞型MITFA進(jìn)行了基因編輯，發(fā)現(xiàn)mitfa的缺失對(duì)于小鼠的毛色產(chǎn)生的影響不顯著，但還是會(huì)引起細(xì)微的變化，通過(guò)定量分析顯示mitfa缺失的小鼠突變體其毛色中黑色素細(xì)胞的積累減少了7%，這說(shuō)明mitfa對(duì)黑色素的調(diào)節(jié)作用在小鼠中也有一定的效果，但作用相對(duì)較弱。Wang等［39］做了關(guān)于斗魚(yú)的mitfa基因的敲除，通過(guò)野生型斗魚(yú)與突變型比較發(fā)現(xiàn)，mitfa的缺失也同樣導(dǎo)致斗魚(yú)黑色素細(xì)胞的明顯減少。Jao等［40］利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行了mitfa和tyr基因的雙敲除，獲得了位點(diǎn)雙突變的試驗(yàn)魚(yú)，與野生型斑馬魚(yú)相比，試驗(yàn)組斑馬魚(yú)整體黑色素細(xì)胞銳減。這些結(jié)果與紅斑馬魚(yú)mitfa基因敲除結(jié)果基本一致，且調(diào)節(jié)作用顯著，這表明mitfa基因是黑色素調(diào)控的關(guān)鍵基因，在兩種斑馬魚(yú)體色中具有同樣的調(diào)節(jié)功能。本研究再次驗(yàn)證了mitfa對(duì)黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育的正向調(diào)控作用，同時(shí)也為研究該基因在早期胚胎發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。另外，優(yōu)化后的CRISPR/Cas9敲除技術(shù)為進(jìn)行紅斑馬魚(yú)基因的定向編輯提供了穩(wěn)定的平臺(tái)。