殷倩霞，歐陽雯雯，常好才*

（1. 華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室，廣州 510631；2. 華南師范大學生物光子學研究院，廣東省激光生命科學重點實驗室，廣州 510631）

關鍵字：低劑量弱激光療法；動脈粥樣硬化；斑塊；脂質(zhì)代謝；小鼠模型

隨著社會的發(fā)展及人們生活水平的提高，動脈粥樣硬化（atherosclerosis）引起的心腦血管疾病導致的死亡人數(shù)不斷增多，目前心腦血管疾病已經(jīng)超過腫瘤成為導致世界人口死亡的第一大因素。動脈粥樣硬化是一種以動脈血管壁增厚、變硬及彈性功能減退為特征的慢性炎癥疾病，是冠狀動脈疾病、腦血管疾病和外周動脈疾病的主要致病因素，也是這些疾病防治的關鍵所在。

炎癥、胰島素抵抗、血脂異常和高血壓等多種因素已被發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化的病理發(fā)展過程中起到重要作用［1-4］。目前，預防和治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要策略是降低血漿中低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平。在一項涵蓋200多項研究和200萬患者的大數(shù)據(jù)分析中顯示，LDL-C水平的降低及其在血漿中滯留時間的減少與心血管疾病風險的降低直接相關［5］。這一相關性是許多用于治療心血管疾病的藥物的研究基礎，也是大多數(shù)降低心血管疾病風險的藥物靶向脂質(zhì)代謝的原因。目前，北美和歐洲推薦了他汀類、依折麥布、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9（poprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）抑制劑、二十碳五烯酸和苯培多酸五組降血脂藥物用于臨床防治血脂異常。但不幸的是，雖然LDL-C水平降低了，但病人心血管疾病的風險并沒有降低。因此，人類與心血管疾病的斗爭依舊任重而道遠，新型的心血管疾病治療方式亟待開發(fā)。

低劑量弱激光療法（low-dose laser therapy，LDLT）是一種使用低能量密度近紅外激光照射,并且無損和非侵入式的物理療法。LDLT設備操作簡便安全，臨床上已開始將其應用于脫發(fā)、傷口愈合、神經(jīng)退行性疾病、慢性炎癥等疾病的預防和/或治療［6-9］。治療方式主要包括局部照射、腔內(nèi)照射和穴位照射等。同時，LDLT在心血管疾病領域的研究結果給我們帶來了驚喜。研究者發(fā)現(xiàn)，LDLT在體外可以促進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產(chǎn)生及轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的分泌，從而促進內(nèi)皮細胞的增殖［10-11］，這些都有利于血管的生成。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，足底長波長紅外光照射不僅可用于減輕2型糖尿病患者的胰島素抵抗和提高顱內(nèi)血流量，還能降低高血脂患者血漿中甘油三酯和LDL-C的水平［12-13］。更有一些富有創(chuàng)造力的研究者開發(fā)了激光針刺的方法，用其代替?zhèn)鹘y(tǒng)針灸來改善循環(huán)不足患者的動脈壓和下肢末梢循環(huán)［14］。LDLT療法聯(lián)合有氧加阻力訓練可以減少肥胖女性心臟代謝的危險［15］。這些研究結果為LDLT應用于治療動脈粥樣硬化提供了可能。

本研究著眼于這種創(chuàng)新的治療方式用于動脈粥樣硬化疾病的治療效應的探究。試驗結果顯示，LDLT對動脈粥樣硬化具有緩解作用。這一研究結果為LDLT應用于治療動脈粥樣硬化提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗中使用的主要儀器：635 nm半導體激光器（NL-FBA-2.0-635，nLight Photonics Corporation，Vancouver，WA），Nanodrop 1000分光光度計（Thermo Scientific，Paisley，英國），Leica顯微鏡，Leica冷凍切片機，實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（BioRad）。

試驗中使用的試劑：高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，XT108C-1），Hematoxylin-Eosin（H&E）染色試劑盒（生工生物，E607317，E607321），油紅O（oil red O，ORO）染色試劑盒（sigma aldrich，O1391），Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR 預混液（2×）（Thermo Scientific?，K0241），RNAiso Plus（TaKaRa，D9108A），ReverTra qPCR RT Master Mix（TOYOBO，F(xiàn)SQ-301）。

1.2 動物試驗方案

本研究是根據(jù)《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南（原版第8版）》［16］進行的，同時獲得了華南師范大學科學研究倫理委員會的批準。載脂蛋白E缺陷（apolipoprotein E-/-，ApoE-/-，T001458）小鼠購自南京大學南京生物醫(yī)學研究所。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持穩(wěn)定的溫度和濕度，并實行12 h暗/亮周期循環(huán)。每周更換墊料并對水和籠子進行清洗消毒。為了避免激素水平差異的影響，我們在所有試驗中都使用雄性小鼠作為研究對象。

ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型構建參考了我們之前的研究［17］：8周齡的ApoE-/-小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)18周；在高脂飼料喂養(yǎng)的第9周開始進行低劑量弱激光處理，處理結束后，對小鼠實施安樂死（布托啡諾，2.5 mg/kg，腹腔注射），立即取出小鼠的主動脈、心臟、肝臟等組織，然后進行PCR檢測或制作組織切片用于形態(tài)學分析。

1.3 低劑量弱激光處理方法

首先，測量小鼠腹腔皮膚組織的弱激光透射率，具體方法是剔除小鼠腹部的毛發(fā)，然后對小鼠實施安樂死，剪下小鼠的腹部皮膚（包含腹膜）覆蓋在功率計探頭上方；然后，記錄有無皮膚組織覆蓋情況下功率計示數(shù)，計算出小鼠腹腔皮膚組織的激光透射率，多次測量取得平均透射率為16.67%。

低劑量弱激光處理前去除小鼠的腹毛和胸毛，再采用635 nm LDLT每天照射小鼠的胸腹部10 min（功率密度為80 mW/cm2），連續(xù)照射10周，光照劑量為48 J/cm2，到達腹腔和胸腔內(nèi)劑量約為8 J/cm2。對照組的小鼠也被限制在專門設計的小鼠固定照光裝置中，但激光器光源不被打開，維持與試驗組小鼠相同的試驗時間。

1.4 動物組織和形態(tài)學分析

所有處理結束后，對小鼠執(zhí)行安樂死，用10 mL磷酸緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）灌注小鼠心臟，取出主動脈、心臟和肝臟等組織，然后放置于20 mL 4%多聚甲醛中4℃過夜。接下來，將組織放入15%～30%的蔗糖密度梯度溶液中脫水直至組織下沉。最后，將組織浸在OCT（optimal cutting temperature compound）包埋劑中，速凍，然后進行切片或于-80℃冰箱中保存。

為了評估主動脈病變區(qū)域面積，小心取出小鼠的整個主動脈并縱向剪開，然后用ORO染色并拍照。使用Image J軟件統(tǒng)計病變區(qū)域面積以進行數(shù)據(jù)分析。主動脈病變區(qū)域面積 = ORO染色陽性面積/主動脈總面積。

為了評估主動脈竇病變區(qū)域面積，用Leica冷凍切片機以8 μm的厚度從主動脈弓開始，經(jīng)過主動脈瓣區(qū)域到心臟，制作主動脈竇的連續(xù)切片，然后放置在載玻片上。在連續(xù)切片中每隔4張切片選取一張進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色，用于檢測小鼠動脈粥樣硬化病變區(qū)域的變化。4張切片的病變區(qū)域染色結果的平均值作為每只小鼠的主動脈竇病變面積的統(tǒng)計結果。

1.5 mRNA提取和RT-qPCR

使用RNAiso Plus從小鼠肝臟組織中分離總RNA。使用超微量紫外分光光度計測量RNA的濃度和純度，OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1范圍內(nèi)的樣品被試驗采納。取1 μg總RNA用于逆轉錄，然后使用逆轉錄得到的cDNA作為模板進行RTqPCR。PCR過程中所使用的引物在賽默飛訂購，引物序列如下。Ldlr：正向引物CTCCTGCATTCACGGTAGCC，反向引物 CCCACTGTGACACTTGAACTTG；Hmgcr：正向引物CTTGTGGAATGCCTTGTGATTG，反向引物 AGCCGAAGCAGCACATGAT；Srebp2：正向引物 GCGTTCTGGAGACCATGGA，反向引物 ACAAAGTTGCTCTGAAAACAAATCA；Gapdh：正向引物 AACGACCCCTTCATTGAC，反向引物TCCACGACATACTCAGCAC。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗至少重復三次，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)的體現(xiàn)形式都是平均數(shù)±標準誤。統(tǒng)計分析是采用未配對的student’st-test完成，用*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表示組間在統(tǒng)計學上的顯著差異水平。

2 結果與分析

2.1 LDLT抑制動脈粥樣硬化的病理進程

首先，我們?nèi)〕鯨DLT處理結束后的小鼠主動脈，然后進行ORO染色，觀察主動脈血管內(nèi)動脈粥樣硬化病變的情況。試驗結果顯示，經(jīng)LDLT處理后的小鼠主動脈上ORO陽性面積（代表動脈粥樣硬化損傷面積）顯著小于對照組（圖1a、1b），說明LDLT處理可以減緩模型小鼠中動脈粥樣硬化的病變進程。

圖1 LDLT可以減弱小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展Fig. 1 LDLT reduces the development of atherosclerosis in mice

接下來，為了進一步驗證LDLT對小鼠動脈粥樣硬化的緩解作用，取LDLT處理的ApoE-/-小鼠的心臟制作冰凍切片，然后進行H&E染色，觀察主動脈竇處的斑塊面積大小的變化。

主動脈竇H&E染色結果顯示，經(jīng)LDLT處理后的小鼠斑塊面積顯著小于對照組（圖2a、2b）。斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心的大小直接影響斑塊的穩(wěn)定性［18］，因此，我們也觀察了小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心的面積變化。數(shù)據(jù)顯示，LDLT處理的小鼠主動脈竇斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心（黑色虛線框內(nèi)表示的區(qū)域）的面積顯著小于對照組（圖2a、2c）。這些數(shù)據(jù)共同說明LDLT處理可以減小主動脈竇斑塊面積以及降低斑塊的易損性，起到抑制動脈粥樣硬化進程的作用。

圖2 LDLT穩(wěn)定動脈粥樣硬化小鼠主動脈竇斑塊Fig. 2 LDLT stabilizes aortic sinus plaque in atherosclerotic mice

2.2 LDLT顯著下調(diào)肝臟膽固醇合成相關基因的表達

肝臟是膽固醇合成的主要場所，對維持機體血液中總膽固醇含量的穩(wěn)定至關重要。我們之前的研究結果發(fā)現(xiàn)，LDLT處理可以減少小鼠血漿中總膽固醇和LDL-C的含量［17］。因此，我們檢測了LDLT處理小鼠肝臟中與膽固醇生成相關基因的表達水平。RT-qPCR試驗結果表明，LDLT處理顯著下調(diào)肝臟參與膽固醇合成的甾醇調(diào)節(jié)元件結合轉錄因子2（sterol regulatory element-binding protein 2，Srebp2）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，Hmgcr）的基因的表達（圖3a、3b），而對負責低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）代謝的LDL受體（Ldlr）基因的表達沒有顯著影響（圖3c）。因此，我們推測LDLT可以抑制HFD喂養(yǎng)小鼠肝臟中膽固醇的合成，從而降低血漿中總膽固醇和LDL-C的含量，緩解動脈粥樣硬化疾病的發(fā)展。

圖3 LDLT顯著下調(diào)肝臟膽固醇合成相關基因的表達Fig. 3 LDLT significantly downregulates the expression of liver cholesterol synthesis-related genes

2.3 LDLT減少動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂質(zhì)的沉積

肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要器官，對維持機體血脂水平的穩(wěn)定起到重要作用［19］。我們對小鼠進行LDLT處理的作用部位在小鼠的胸腹部，激光輻照也可以到達肝臟位置。因此，我們也關注了LDLT對肝臟脂質(zhì)代謝的影響。從HFD誘導的ApoE-/-小鼠肝臟切片的ORO染色可以看出，LDLT處理后肝臟中的脂質(zhì)沉積顯著減少（圖4a、4b）。這些數(shù)據(jù)表明，LDLT處理不僅緩解了動脈粥樣硬化疾病的發(fā)展，還能夠減輕肝臟中脂質(zhì)的過度荷載。

圖4 LDLT減輕動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂質(zhì)沉積Fig. 4 LDLT reduces liver lipid deposition in atherosclerotic mice

我們的試驗結果顯示，在HFD誘導ApoE-/-小鼠形成動脈粥樣硬化病變的過程中給與小鼠LDLT處理，可以緩解小鼠動脈粥樣硬化病情的發(fā)展，具體表現(xiàn)在LDLT處理后的小鼠主動脈損傷面積及主動脈竇斑塊面積顯著小于對照組。同時，我們也觀察到LDLT處理可以顯著下調(diào)肝臟膽固醇合成相關基因的表達，減少動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積。由此可以得出結論，LDLT對動脈粥樣硬化模型小鼠的病情發(fā)展具有緩解作用。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性代謝病，臨床表現(xiàn)為血管壁增厚、彈性減退，血管內(nèi)膜下層纖維脂肪物質(zhì)的積累增多。動脈粥樣硬化病變的形成是一個持續(xù)的過程，早期在動脈血管內(nèi)膜上形成脂質(zhì)條紋，然后進一步發(fā)展形成纖維斑塊和粥樣斑塊，晚期形成復合病變。一旦動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生破裂，釋放的內(nèi)容物會在血小板的作用下形成血栓堵塞血管，造成組織和相應器官缺血，導致腦卒中、心肌梗死，甚至猝死等急性不良事件發(fā)生［20］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，脂代謝異常、糖代謝異常、高血壓、肥胖和吸煙等是導致動脈粥樣硬化的危險因素［21-22］。其中脂質(zhì)代謝紊亂，尤其LDL水平的升高和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平的降低，是導致動脈粥樣硬化最嚴峻的危險因素，同時，也是防治動脈粥樣硬化理想的切入點。

LDLT或低水平激光療法（low level laser therapy，LLLT）于1967年被闡述，截至目前，低劑量弱激光在臨床上用于鎮(zhèn)痛、抗炎和傷口愈合等治療已有20多年的歷史，并展示出良好的生物安全性。已經(jīng)有研究者開展了將LDLT用于心血管疾病的防治研究，并取得了積極的成果，但對于LDLT發(fā)揮作用的潛在機制眾說紛紜。 Liu等［23］通過鼻內(nèi)低強度GaInP/AlGaInP二極管650 nm激光輻照，將LDLT應用于心血管疾病的臨床治療，他們的研究發(fā)現(xiàn)，受試者血清中總膽固醇水平和LDL-C水平顯著下降，與此同時高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平顯著上升。有研究表明，低水平激光通過膠原基質(zhì)的強化從而抑制ApoE-/-小鼠主動脈瘤的發(fā)展［24］。也有研究者發(fā)現(xiàn)，LDLT結合游泳訓練可以改善HFD誘導的大鼠血脂狀況等［25］。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)，LDLT可以調(diào)控巨噬細胞的功能［26］，促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇的轉運［17］。另外，課題組其他成員的研究表明，在2型糖尿病模型中實施LDLT能夠緩解脂肪肝的惡化［27］。因此，我們推測LDLT改善動脈粥樣硬化病理的作用機制可能存在兩條途徑：一是LDLT促進了動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細胞對膽固醇的轉運；二是LDLT抑制了肝臟細胞脂質(zhì)的合成，最終降低了血漿中總膽固醇和LDL-C的含量，緩解了動脈粥樣硬化的發(fā)展。雖然LDLT用于心血管疾病防治的作用機制還需進一步的探究，但其展現(xiàn)出的積極效應使我們對LDLT未來在臨床上用于防治心血管等疾病充滿了期待。