葉洪亮， 張金三， 金立波

（1. 溫州大學(xué) a. 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；b. 生命科學(xué)研究院，溫州 325035；2. 浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，溫州 325035）

鈣黏蛋白（cadherin，CDH）是一種Ca2+依賴的介導(dǎo)同源細(xì)胞間相互黏附的黏連糖蛋白家族。目前發(fā)現(xiàn)的CDH 成員超過100多種，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)和功能的相似性，大致可分為4個(gè)亞家族：Ⅰ型典型的鈣黏蛋白、Ⅱ型典型的鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白［1］。這些鈣黏蛋白有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，大部分鈣黏蛋白成員在胚胎發(fā)育、組織完整性和細(xì)胞功能的維持中發(fā)揮著重要的作用［2-3］。例如，鈣黏蛋白-1（CDH-1，即E-cadherin）是Ⅰ型典型的鈣黏蛋白，在小鼠胎齡8.5天（E8.5）開始表達(dá)，其作用是將松散的分裂球細(xì)胞變成緊密黏合的細(xì)胞，Cdh-1基因突變會(huì)導(dǎo)致胚胎細(xì)胞的分離和死亡［4］。臨床研究表明，Cdh-1基因突變還會(huì)導(dǎo)致遺傳性彌漫性胃癌和乳腺小葉癌等癌癥［5］。鈣黏蛋白-2（CDH-2，即N-cadherin）影響眼、神經(jīng)、心臟、骨骼肌及成纖維細(xì)胞的發(fā)育，在懷孕的小鼠中敲除Cdh-2基因會(huì)造成胚胎小鼠心臟缺陷并出現(xiàn)胚胎發(fā)育遲緩［6］。

鈣黏蛋白-16（CDH-16）是一種非典型鈣黏蛋白［7］。已有研究表明，CDH-16參與維持細(xì)胞形態(tài)與功能［8］，是癌癥發(fā)生的潛在檢驗(yàn)節(jié)點(diǎn)［9-10］，還與胚胎發(fā)育過程緊密相關(guān)［9，11-12］，功能上具有顯著的組織選擇性。本文從CDH-16的組織特異性分布角度對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能及基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控展開綜述。這為將來更深入理解CDH-16蛋白在不同生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮的作用提供了理論基礎(chǔ)。

1 CDH-16的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)

1995年，Thomson 等［13］學(xué)者首次通過免疫熒光揭示了CDH-16蛋白表達(dá)在兔腎臟上皮細(xì)胞的外側(cè)基底膜。當(dāng)時(shí)被分析的9只兔子的組織只有腎臟中檢測到了CDH-16，因此，最初他們認(rèn)為CDH-16特異性表達(dá)在腎臟中，并將其命名為腎特異性鈣黏蛋白（kidney specific cadherin，Ksp-cadherin）［13］。后來在小鼠和人類腎臟中進(jìn)一步證實(shí)了CDH-16的表達(dá)［10，14］。

CDH-16蛋白分子量為130 kD，蛋白結(jié)構(gòu)與典型CDH蛋白類似［13，15-18］，均為單次跨膜蛋白，包含胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)域。不同的是，典型CDH蛋白一般擁有5個(gè)胞外重復(fù)結(jié)構(gòu)域（extracellular cadherin repeat，EC）和1段由大約160個(gè)氨基酸殘基組成的C末端高度保守的肽段［19］，而CDH-16蛋白擁有7個(gè)胞外重復(fù)結(jié)構(gòu)域和1段僅由22個(gè)氨基酸殘基組成的短鏈胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（圖1）。二者均依賴EC區(qū)域的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮黏附作用［3，20］。Ca2+結(jié)合賦予了鈣黏蛋白胞外部分剛性，使得一個(gè)細(xì)胞鈣黏蛋白的把手樣結(jié)構(gòu)和另外一個(gè)細(xì)胞鈣黏蛋白的口袋狀結(jié)構(gòu)彼此嵌合在一起，從而實(shí)現(xiàn)Ca2+依賴性的細(xì)胞黏著［21］。典型CDH蛋白的配體主要是鈣連環(huán)蛋白（catenin），包括α-catenin、β-catenin和δ-catenin［22-24］，二者形成的CDH-catenin復(fù)合物與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白相互結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的黏附作用［25］。p120蛋白則通過結(jié)合CDH蛋白的近膜域發(fā)揮作用［26］。但CDH-16蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被截?cái)?，因此缺少catenin的結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)而與另一種小分子熱休克蛋白——αB晶狀體蛋白（αB-crystallin，CRYAB）相互作用。αB-crystallin作為一種連接蛋白，充當(dāng)CDH-16與絲狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）相互作用的中間橋梁，三者在維持腎臟集合管上皮基膜處的結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮重要作用［8］。

圖1 鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1 Cadherin structure

2 CDH-16的時(shí)空分布及功能

CDH-16的表達(dá)具有較高的時(shí)間和空間特異性（下文稱為時(shí)空特異性），不同生長發(fā)育時(shí)期分別表達(dá)于生殖管道、肺、腎臟和甲狀腺。CDH-16作為腎臟上皮細(xì)胞的生物指標(biāo)，一直被視作細(xì)胞分化的標(biāo)志，但其在肺和生殖管道中短暫表達(dá)的意義卻仍不明確，目前關(guān)于此方面的研究還有待深入。下面將從CDH-16在不同組織的分布與功能進(jìn)行闡述。

2.1 CDH-16的暫時(shí)性表達(dá)

Cdh-16的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在發(fā)育的生殖管道和肺中被檢測到。其中，Cdh-16在生殖管道的表達(dá)開始于E10.5，Wertz等［11］在此時(shí)期的沃爾夫管（Wolffian duct）和米勒管（Müllerian duct）中檢測到了Cdh-16的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但隨著沃爾夫管和米勒管分別發(fā)育形成輸精管和輸卵管、子宮、子宮頸以及上三分之一陰道后，Cdh-16轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物消失。

Cdh-16轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也在小鼠發(fā)育的肺中被檢測到（E10.5～E14.5）（圖2a），并隨著肺的成熟而消失。小鼠肺的發(fā)育大致分為5個(gè)階段：胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期和肺泡期。E10.5～E14.5為胚胎期末期和假腺期早期，此時(shí)一群遠(yuǎn)端尖部上皮祖細(xì)胞開始分化形成神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞、纖毛細(xì)胞以及Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞［27］。由此可猜測，Cdh-16可能在這一階段參與了肺上皮的組建，在氣管分支時(shí)期的細(xì)胞分化過程中扮演了重要的角色。

圖2 CDH-16在胚胎發(fā)育期的分布Fig. 2 Distribution of CDH-16 during embryogenesis

2.2 CDH-16與腎臟

CDH-16是目前已知的CDH家族中唯一具有腎臟特異性分布的成員［13，28-29］。在發(fā)育的腎臟中，CDH-16表達(dá)在腎單位和分支的輸尿管芽中，但在濃縮的間充質(zhì)、逗號(hào)小體和腎小囊中檢測不到CDH-16的表達(dá)［29］。這與Shao等［30］在Ksp1.3/Cre、lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的CDH-16重組蛋白的分布一致。隨著輸尿管芽在后腎間充質(zhì)的誘導(dǎo)下分支形成集合管，CDH-16的分布集中于成熟的集合管（圖2b），并因此被視為集合管分化成熟的標(biāo)志［31］。在成年小鼠腎臟中，CDH-16分布于腎單位的所有節(jié)段，尤其是髓袢、遠(yuǎn)端小管以及腎集合管，但在腎小球、血管或間質(zhì)細(xì)胞中仍然檢測不到CDH-16的表達(dá)。因此，當(dāng)含有熒光素酶報(bào)告基因和2.6 kbCdh-16啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎上皮細(xì)胞時(shí)，熒光素酶活性被刺激增加48～60倍，而轉(zhuǎn)染到間充質(zhì)細(xì)胞時(shí)，熒光素酶活性小于2倍［20］。

CDH-16在腎臟中的作用主要包括：1）介導(dǎo)Ca2+依賴的細(xì)胞識(shí)別與黏附［17］。一項(xiàng)體外試驗(yàn)表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）通過CDH-16誘導(dǎo)腎成體干細(xì)胞的分化［32］，CDH-16在此發(fā)揮了細(xì)胞間相互識(shí)別的作用。2）Cdh-16在腎臟中被視為腫瘤抑制基因，腎細(xì)胞癌中CDH-16的表達(dá)顯著下降，甚至完全消失［10］。3）最新的研究發(fā)現(xiàn)，CDH-16與腎臟正常代謝尿液的功能直接相關(guān)。在小鼠腎臟中敲除Cdh-16基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這雖然不影響腎臟的正常發(fā)育及結(jié)構(gòu)完整性，但會(huì)引起髓內(nèi)水通道蛋白-2（aquaporin，AQP-2）的錯(cuò)誤表達(dá)，從而導(dǎo)致腎臟濃縮尿液功能障礙［7］。這也首次證明了CDH-16不僅僅是一種細(xì)胞黏連的結(jié)構(gòu)蛋白，還是一種與代謝相關(guān)的功能蛋白。

2.3 CDH-16與甲狀腺

在發(fā)育的小鼠甲狀腺中，CDH-16最早于E9.5被檢測到，此時(shí)CDH-16和CDH-1共表達(dá)于甲狀腺基板處的Pax8+/ Nkx2.1+祖細(xì)胞亞群［9］（圖2c）。CDH-1的黏連作用保證了發(fā)育早期甲狀腺的結(jié)構(gòu)完整性，若在小鼠甲狀腺中敲除Cdh-1基因，CDH-16將作為替補(bǔ)鈣黏蛋白表達(dá)，并維持甲狀腺細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)［12］。此外，此前一直將Cdh-1突變視作甲狀腺癌的標(biāo)志，但在甲狀腺癌中檢測到CDH-16表達(dá)缺失，且早于CDH-1表達(dá)缺失，說明CDH-16可能是未來檢測甲狀腺癌的新節(jié)點(diǎn)［9］。

CDH-16在甲狀腺中的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子Pax8的調(diào)控。生物信息學(xué)初步分析表明，Cdh-16啟動(dòng)子中存在潛在的Pax8結(jié)合位點(diǎn)。在大鼠甲狀腺細(xì)胞中沉默Pax8的表達(dá)，則CDH-16蛋白的表達(dá)受抑制［33］。值得注意的是，CDH-16基因的表達(dá)與其他甲狀腺特異性基因一樣，受到促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的調(diào)控，通過觀察dbcAMP（TSH類似物）處理TSH饑餓細(xì)胞可證實(shí)這一點(diǎn)。Pax8本身的表達(dá)在出生后受到TSH的控制［9］，因此，TSH可能通過Pax8轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CDH16的表達(dá)水平。這樣看來，腎臟也表達(dá)Pax8轉(zhuǎn)錄因子，也許兩種組織共有的Pax8轉(zhuǎn)錄因子可能是CDH-16組織選擇性的原因之一。

3 Cdh-16基因序列特征及表達(dá)調(diào)控

CDH-16蛋白的組織特異性表達(dá)受到Cdh-16基因水平上的精密調(diào)控。與其他典型鈣黏蛋白家族成員相同，Cdh-16基因也定位于小鼠8號(hào)染色體和人類16號(hào)染色體［34］，其啟動(dòng)子近端120 bp序列在小鼠和人類之間高度保守［35］。早在1999年，為了更好地探究Cdh-16的組織特異性表達(dá)和發(fā)育調(diào)控，Whyte的實(shí)驗(yàn)室克隆并表征了3.7 kbCdh-16基因5′端側(cè)翼序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cdh-16基因上游250 bp區(qū)域內(nèi)的基因序列與其表達(dá)相關(guān)，包括激活蛋白-2（AP-2）、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（HNF-3）、堿性螺旋環(huán)螺旋蛋白（bHLH）、C/EBP（CCAAT增強(qiáng)子蛋白）和GATA等［20］。而后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Cdh-16基因上游存在腎臟上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，這就解釋了CDH-16在腎臟中的選擇性表達(dá)。近年來，一些學(xué)者相繼構(gòu)建了不同大小的啟動(dòng)子探究CDH-16重組蛋白在腎臟中的特異性表達(dá)（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.3 kb啟動(dòng)子即可調(diào)控Cdh-16基因的正常表達(dá)。

表1 重組蛋白CDH-16的表達(dá)模式及其分布Tab. 1 Expression and distribution of the recombinant protein CDH-16

此外，Cdh-16的表達(dá)還受肝細(xì)胞核因子-1β（HNF-1β）的調(diào)控［35-36］。Boutet等［37］發(fā)現(xiàn)，Snail的異常激活下調(diào)HNF-1β水平，CDH-16的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致腎纖維化。但由于在腎臟發(fā)育前敲除HNF-1β基因會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，故目前該基因的具體作用及其與CDH-16之間的關(guān)系仍不清楚［38-39］。

4 總結(jié)與展望

隨著研究的深入，CDH-16的生物學(xué)功能已經(jīng)由細(xì)胞黏附拓展到了胚胎發(fā)育、代謝功能、腫瘤發(fā)生等。尤其在腎臟和甲狀腺中，CDH-16的表達(dá)異常已經(jīng)在尿液代謝［7］、腎細(xì)胞癌［10］、腎纖維化［37］和甲狀腺癌［9］等有明顯的體現(xiàn)，具有重要的研究價(jià)值，但在肺和生殖管道中的功能卻尚無明確的結(jié)論。通過比較CDH-16在二者的表達(dá)差異可做出以下合理推測：生殖管道的成熟伴隨沃爾夫管和米勒管的退化，退化的組織中可能包含表達(dá)CDH-16的細(xì)胞，使得CDH-16在成熟的輸卵（精）管中消失；而在發(fā)育的肺中，CDH-16可能參與祖細(xì)胞分化過程。Nkx2.1+是肺和甲狀腺發(fā)育早期共同的祖細(xì)胞亞群，在甲狀腺Nkx2.1+/Pax8+細(xì)胞亞群檢測到CDH-16的分布似乎也暗示了其在肺Nkx2.1+細(xì)胞亞群中的表達(dá)。肺Nkx2.1+細(xì)胞亞群隨后分化為Sox2+近端和Id2+/Sox9+遠(yuǎn)端內(nèi)胚層祖細(xì)胞［41-42］，最終分化成熟形成氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞。為何CDH-16在成熟的肺中消失是值得深入思考的問題。未來可以利用Cre重組酶系統(tǒng)，在小鼠模型中對(duì)Cdh16+細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，追蹤這一細(xì)胞譜系的命運(yùn)，并且針對(duì)消失后的CDH-16能否通過某種損傷機(jī)制被重新激活這一問題進(jìn)行深入探討。此外，肺泡上皮細(xì)胞中分布著6種AQP水通道蛋白（AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9），在肺泡毛細(xì)血管間水的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用，可能參與了出生時(shí)肺泡液體的吸收、氣道的濕化、肺水容量的調(diào)節(jié)及肺水腫的形成［43］。CDH-16在腎臟上皮細(xì)胞中通過AQP2影響腎臟代謝功能［7］，這就提示：若在發(fā)育的肺中敲除Cdh-16基因，可能會(huì)影響成年小鼠肺氣體交換的效率或引起肺水腫等疾病。有研究證實(shí)，Cdh-1在肺癌中作為致癌基因誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞自我更新［44］，與其在胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞中發(fā)揮的作用一致，這為探究Cdh-16與肺癌的關(guān)系新增了一個(gè)角度。因此，以發(fā)展的眼光看，攻破CDH-16在生命體的作用及機(jī)制將有益于包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的臨床研究和治療。