王 賽，張 嵐，陳永艷，邢方瀟

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

微塑料是指粒徑小于5 mm的塑料顆粒、碎片、纖維等，可分為原生微塑料和次生微塑料。原生微塑料是指最初被制造為具有微觀尺寸的微塑料，次生微塑料是指大型塑料物品經(jīng)碎裂和風(fēng)化而形成的微塑料[1]。微塑料在環(huán)境中來(lái)源廣泛，包括陸地上人為活動(dòng)(如日常使用的清潔產(chǎn)品中的洗滌靈、洗衣纖維、洗面奶)、基礎(chǔ)設(shè)施(如道路上路標(biāo)油漆脫落)、土地使用(如園藝生產(chǎn)過(guò)程中用以控制溫度和濕度的塑料薄膜)和廢水排放等[2]。不同水體中微塑料的豐度存在較大差異，污水、湖泊、河流、水渠、地下水、處理前后的自來(lái)水以及瓶裝水中微塑料的存在豐度可跨越10個(gè)數(shù)量級(jí)，為1×10-2～1×108個(gè)/m3[3]。由于人類每天大量的需水量，飲用水被認(rèn)為是微塑料進(jìn)入人體的重要途徑之一[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未建立飲用水中微塑料的標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)方法，相關(guān)文獻(xiàn)中采用的前處理及檢測(cè)方法也不盡相同。前處理是水中微塑料檢測(cè)中的重要步驟，其主要目的是在消解和去除水樣中天然有機(jī)物等干擾性物質(zhì)的基礎(chǔ)上完成富集和濃縮。文獻(xiàn)中主要有化學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)：化學(xué)反應(yīng)主要分為4種，包括酸(HCl、HNO3、HClO4)法、堿(NaOH、KOH)法、氧化劑(H2O2)法[5]和芬頓試劑法[6-7]；酶催化反應(yīng)包括纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶[8]。H2O2消解處理對(duì)微塑料表面形態(tài)和其對(duì)應(yīng)的元素組成影響較小，因此，被認(rèn)為是較佳的處理方式[5]。雖然近年在飲用水的研究中使用H2O2消解水樣中的天然有機(jī)物的應(yīng)用較多，但使用條件和濃度各不相同[9-13]。微塑料的檢測(cè)方法也眾多，包括光學(xué)顯微鏡法、電子掃描顯微鏡法、紅外光譜法、拉曼光譜法以及熱分析技術(shù)如括差示掃描量熱法(DSC)、熱重量分析結(jié)合差示掃描量熱法(TGA-DSC)及熱分解氣相色譜質(zhì)譜(Pyr-GC-MS)等[14]。飲用水中含有大量尺寸小于10 μm的微塑料[10,15-18]，因此，顯微紅外光譜法和顯微拉曼光譜法被認(rèn)為是適用于飲用水中微塑料檢測(cè)的首選方法。本團(tuán)隊(duì)在前期的研究中已建立了飲用水中微塑料顯微紅外光譜的檢測(cè)方法[19]，本研究的主要目標(biāo)是基于顯微拉曼光譜技術(shù)探索建立飲用水中微塑料檢測(cè)的定性定量分析方法，對(duì)樣品的前處理過(guò)程，如抽濾方式、消解條件、適用濾膜類型以及顯微拉曼光譜儀的儀器參數(shù)等進(jìn)行了條件試驗(yàn)，力求對(duì)較小粒徑的微塑料完成有效檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，消耗時(shí)間適宜，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確有效。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器與材料

共聚焦顯微拉曼成像系統(tǒng)(Nicolet DXR3，美國(guó)Thermo Fisher公司)、純水機(jī)(Milli-Q Integral 5，美國(guó)Millipore公司)、ME104電子天平(感量為0. 000 1 g，瑞士Mettler公司)、隔膜真空泵(GM-0.5 A，天津津騰設(shè)備有限公司)、超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、生物顯微鏡(奧林巴斯工業(yè)有限公司)、玻璃抽濾裝置。H2O2溶液(分析純，30%)、無(wú)水乙醇(分析純)；硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Millipore，美國(guó))、玻璃纖維素濾膜(0.7 μm，Whatman，美國(guó))、不銹鋼濾膜(2 μm，北京芥微科技有限公司)、氧化鋁膜(0.2 μm，Whatman，美國(guó))；聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺/尼龍(Polyamide/Nylon 6)、纖維素(Cellulose)、聚苯乙烯(PS)微塑料標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 方法

試驗(yàn)方法包括水樣的前處理以及使用顯微拉曼儀進(jìn)行定性定量檢測(cè)和分析。前處理和檢測(cè)流程如圖1所示。(1)水樣；(2)一級(jí)過(guò)濾：截留水樣中≥2 μm的所有顆粒物；(3)消解：對(duì)一級(jí)過(guò)濾后濾膜上的截留物質(zhì)進(jìn)行消解，選擇適宜的消解液和消解條件，去除截留物中天然有機(jī)物及其他會(huì)對(duì)后續(xù)微塑料檢測(cè)產(chǎn)生干擾的物質(zhì)；(4)洗脫：將濾膜上的待測(cè)物質(zhì)經(jīng)超聲波振蕩至消解液中，形成洗脫液；(5)二級(jí)過(guò)濾：將洗脫液用定制的抽濾裝置進(jìn)行二級(jí)過(guò)濾；(6)上機(jī)檢測(cè)。

圖1 前處理和檢測(cè)過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Pre-Processing and Detection Process

1.2.1 二級(jí)過(guò)濾濾膜選擇

結(jié)合拉曼光譜的使用要求和檢測(cè)成本要求，本研究確定了二級(jí)過(guò)濾濾膜的3個(gè)選擇條件：(1)濾膜表面平整光滑，濾膜材質(zhì)在使用顯微拉曼儀檢測(cè)微塑料時(shí)不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生干擾；(2)濾膜材質(zhì)的拉曼光譜平穩(wěn)，沒(méi)有明顯的可見(jiàn)基底峰，以保證樣品中微塑料的特征峰不會(huì)被濾膜基底峰遮蓋；(3)價(jià)格合適，便于獲得。現(xiàn)有文獻(xiàn)基于拉曼光譜對(duì)飲用水中微塑料檢測(cè)的研究所使用的濾膜類型包括氧化鋁膜[16]、硝酸纖維素膜[20]、玻璃纖維素膜[12]、聚碳酸酯膜[21]、聚四氟乙烯濾膜[22]、鍍鋁聚碳酸酯膜[23]、鍍金聚碳酸酯膜[24]等。根據(jù)3個(gè)選擇條件，本研究選擇氧化鋁膜、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、不銹鋼濾膜進(jìn)行后續(xù)的研究測(cè)試。

試驗(yàn)操作步驟如下。(1)分別稱取0.001～0.005 g聚氯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、纖維素、聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品，粒徑為10～50 μm。(2)將稱取的標(biāo)準(zhǔn)品加至5 L超純水中，充分混勻得到微塑料標(biāo)準(zhǔn)品溶液。(3)盛取100 mL微塑料標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用一級(jí)抽濾裝置按照水樣處理過(guò)程進(jìn)行抽濾，得到一級(jí)濾膜后將其放入干凈的燒杯中，加入消解液，消解處理后向燒杯中加入200 mL濾后超純水。(4)將燒杯放置于超聲波清洗器中振蕩20 min[19]，形成洗脫液，將洗脫液均分4份，每份50 mL，分別使用氧化鋁膜、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和不銹鋼濾膜進(jìn)行二級(jí)過(guò)濾。(5)使用共聚焦顯微拉曼儀對(duì)4種濾膜上的截留物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。

1.2.2 消解條件測(cè)試

使用H2O2消解水樣中存在的天然有機(jī)物和其他會(huì)對(duì)微塑料檢測(cè)造成干擾的物質(zhì)，是目前飲用水中微塑料檢測(cè)時(shí)常用的處理方式，但時(shí)間、溫度、濃度方面多不統(tǒng)一。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中已經(jīng)對(duì)濃度為30%的H2O2在不同加熱時(shí)長(zhǎng)下進(jìn)行了消解測(cè)試[19]，結(jié)果顯示在40 ℃加熱消解24 h時(shí)效果最佳，但未對(duì)H2O2的濃度進(jìn)行測(cè)試。本研究以節(jié)約時(shí)間成本、簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟為目標(biāo)，采集龍頭水6份，每份200 mL，經(jīng)一級(jí)過(guò)濾后在室溫下以不同濃度的H2O2進(jìn)行24 h消解，探索最適的H2O2的消解濃度。消解液中H2O2濃度分別設(shè)定為0、10%、15%、20%、25%、30%。消解完成后繼續(xù)20 min超聲得到6份洗脫液，洗脫液經(jīng)過(guò)二級(jí)過(guò)濾后，將二級(jí)濾膜上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 拉曼檢測(cè)模式和參數(shù)

本研究使用的共聚焦顯微拉曼儀(Nicolet DXR3)檢測(cè)模式包括點(diǎn)掃描、面掃描和自動(dòng)化面掃描(particle analysis模式)這3種模式。點(diǎn)掃描適用于數(shù)量較少的顆粒，掃描單個(gè)點(diǎn)。面掃描是掃描一個(gè)面，設(shè)置一個(gè)區(qū)域和步長(zhǎng)，在這個(gè)區(qū)域內(nèi)機(jī)械生成等距的樣品點(diǎn)，對(duì)每個(gè)樣品點(diǎn)進(jìn)行逐一掃描。該模式下如果設(shè)置較小步長(zhǎng)，則檢測(cè)時(shí)間十分漫長(zhǎng)可達(dá)數(shù)百小時(shí)；若設(shè)置較大步長(zhǎng)，兩點(diǎn)之間間隔較大，會(huì)造成樣品點(diǎn)的遺漏。自動(dòng)化面掃描(particle analysis模式)是首先生成白光圖，根據(jù)窗口顯示的白光圖像，可以設(shè)定軟件自動(dòng)確定背景強(qiáng)度或手動(dòng)調(diào)節(jié)背景強(qiáng)度，調(diào)節(jié)合適的背景強(qiáng)度可以更好地突出空白背景與樣品的差異。另外，還可以設(shè)置粒徑范圍，程序會(huì)自動(dòng)根據(jù)參數(shù)設(shè)定對(duì)樣品區(qū)域進(jìn)行布點(diǎn)和采集。相比而言，自動(dòng)化面掃描更精確，可同時(shí)生成定性和定量分析的報(bào)告，時(shí)間上也具有較大優(yōu)勢(shì)，因此，本研究在上機(jī)檢測(cè)時(shí)采用自動(dòng)化面掃描的方式。

共聚焦顯微拉曼儀主要參數(shù)設(shè)置：532 nm激光器，拉曼位移為50～3 550 cm-1，50×短距物鏡，1 mW能量，激光光斑尺寸為0.7 μm，光柵為900 lines/mm，曝光時(shí)間為2 s，累計(jì)次數(shù)為5次。

1.2.4 定性定量方法

Pivokonsky等的研究中均采用了以局部估計(jì)總體的方式對(duì)微塑料的豐度進(jìn)行定量分析以降低檢測(cè)時(shí)間成本，采集的局部區(qū)域有扇形區(qū)域、五點(diǎn)區(qū)域(圓心及濾膜中部各方位四點(diǎn))、三點(diǎn)區(qū)域(濾膜圓心、邊緣、圓心與邊緣之間)等[10,15,25]。本研究在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，微塑料存在于過(guò)濾區(qū)域邊緣聚集的現(xiàn)象，為避免因邊緣聚集現(xiàn)象造成對(duì)微塑料數(shù)量估計(jì)的偏差，選擇對(duì)三點(diǎn)取樣法進(jìn)行定量估計(jì)。三點(diǎn)分布如圖2所示，每個(gè)矩形區(qū)域?yàn)橐稽c(diǎn)，共3個(gè)點(diǎn)，面積之和約占整個(gè)待測(cè)面積的9.8%。根據(jù)式(1)估算水樣中微塑料的數(shù)量。

圖2 三點(diǎn)取樣法示意圖Fig.2 Schematic Diagram of Three-Points Sampling Method

(1)

其中：N總——整個(gè)待測(cè)面積上的微塑料總數(shù)，個(gè)；

Ni——每個(gè)點(diǎn)面積上的微塑料數(shù)量，個(gè)；

S總——總的待測(cè)面積，S總=15.9 mm2；

S點(diǎn)——每個(gè)點(diǎn)的面積，mm2。

對(duì)區(qū)域內(nèi)每一顆粒進(jìn)行定量分析的同時(shí)，也逐一進(jìn)行定性分析。定性方法是將顆粒的拉曼譜圖與OMNIC軟件中HR FT-Raman polymer library譜庫(kù)進(jìn)行匹配，根據(jù)樣品的特征峰對(duì)聚合物的類型進(jìn)行鑒別并生成相應(yīng)的匹配度，本試驗(yàn)在當(dāng)前儀器參數(shù)的設(shè)置下，當(dāng)特征峰明顯且匹配度>60%時(shí)即認(rèn)為是該聚合物類型。

1.3 質(zhì)量控制措施

微塑料存在廣泛，為減少背景干擾，本研究采用了如下質(zhì)控措施：試驗(yàn)人員穿棉質(zhì)實(shí)驗(yàn)服，佩戴丁腈手套，整個(gè)試驗(yàn)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，操作過(guò)程中避免使用塑料制品；試驗(yàn)器具在使用前用濾后超純水(將超純水用2 μm孔徑不銹鋼濾膜進(jìn)行過(guò)濾)沖洗3次，接觸過(guò)微塑料標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)器具先使用50%乙醇溶液清洗，再使用濾后超純水沖洗3次；樣品抽濾過(guò)程中在抽濾間隙使用不銹鋼蓋對(duì)漏斗進(jìn)行遮蓋，避免空氣中微塑料進(jìn)入，抽濾完成后的待測(cè)樣品存放于玻璃培養(yǎng)皿中；實(shí)際樣品操作過(guò)程中，對(duì)每批次樣品使用濾后超純水設(shè)置全程序空白，在實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果中進(jìn)行扣除。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 抽濾方式和水樣體積選擇

本研究根據(jù)前期顯微紅外光譜法測(cè)定飲用水中微塑料的研究成果[26]，依然采用兩級(jí)過(guò)濾的方式。一級(jí)過(guò)濾使用孔徑為2 μm、直徑為47 mm的不銹鋼濾膜，目的是將水樣中所有待測(cè)物質(zhì)收集至濾膜上，以備后續(xù)對(duì)水樣中天然有機(jī)物和雜質(zhì)進(jìn)行消解去除。一級(jí)過(guò)濾的濾膜經(jīng)過(guò)消解處理和20 min超聲洗脫后得到洗脫液，將洗脫液進(jìn)行二級(jí)過(guò)濾，二級(jí)過(guò)濾目的是將經(jīng)消解得到的洗脫液中有效待測(cè)物質(zhì)收集至濾膜上，以備上機(jī)檢測(cè)。二級(jí)過(guò)濾過(guò)程中使用直徑為4.5 mm的不銹鋼漏斗，較小直徑的漏斗使得水樣中的待測(cè)物質(zhì)截留于較小的面積上，可節(jié)約后續(xù)上機(jī)檢測(cè)的時(shí)間成本，提高檢測(cè)效率。抽濾過(guò)程中水樣體積的選擇十分重要，應(yīng)確保待測(cè)物質(zhì)盡量不發(fā)生重疊覆蓋的現(xiàn)象。本研究以實(shí)驗(yàn)室龍頭水為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)比不同水樣體積(100～5 000 mL)的檢測(cè)效果，推薦的一級(jí)過(guò)濾水樣體積是200 mL。

2.2 二級(jí)過(guò)濾濾膜測(cè)試結(jié)果

4種濾膜顯微鏡下白光圖成像如圖3所示(物鏡50×，目鏡10×)。氧化鋁濾膜和硝酸纖維素濾膜表面平整光滑，與微塑料區(qū)分清晰，便于鏡下觀察和鑒別微塑料；玻璃纖維素濾膜表面有纖維狀突起，使用50×物鏡進(jìn)行觀察時(shí)，無(wú)法對(duì)全部視野內(nèi)所有物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)一聚焦，且較小粒徑的微塑料易與纖維混合而難以辨認(rèn)；不銹鋼濾膜為編織制成，存在空隙，且白光圖下視野較暗，難以完成對(duì)微塑料的準(zhǔn)確辨認(rèn)和識(shí)別。

圖3 4種濾膜白光圖Fig.3 White Light Diagram of Four Kinds of Filters

本研究分別對(duì)4種濾膜基底成分進(jìn)行拉曼光譜掃描，譜圖如圖4所示。氧化鋁濾膜拉曼光譜平穩(wěn)，無(wú)明顯基底峰，不會(huì)對(duì)微塑料鑒別帶來(lái)干擾，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)測(cè)試，所有標(biāo)準(zhǔn)品均可檢出且特征峰清晰可認(rèn)。玻璃纖維素濾膜和不銹鋼濾膜拉曼光譜較平穩(wěn)，有較小干擾峰，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)影響較小，基本可準(zhǔn)確鑒別微塑料標(biāo)準(zhǔn)品的類型。硝酸纖維素濾膜的拉曼光譜存在較大基底峰，微塑料標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)過(guò)程中，這些基底峰對(duì)微塑料種類的鑒別產(chǎn)生干擾，影響微塑料類型的辨認(rèn)，當(dāng)微塑料粒徑較小時(shí)這種干擾尤為明顯，甚至導(dǎo)致種類辨認(rèn)錯(cuò)誤或無(wú)法鑒別。

綜上，選擇氧化鋁濾膜作為二級(jí)濾膜，圖5為氧化鋁濾膜上各微塑料標(biāo)準(zhǔn)品拉曼譜圖。氧化鋁濾膜上的微塑料可以清晰辨認(rèn)，且其基底的拉曼光譜十分平穩(wěn)，不會(huì)對(duì)微塑料的特征峰造成任何干擾。

圖4 4種濾膜基底拉曼光譜Fig.4 Raman Spectra of Four Filters Membrane Substrates

圖5 微塑料標(biāo)準(zhǔn)品拉曼譜圖Fig.5 Raman Spectra of Microplastics Standards

2.3 消解結(jié)果

每張濾膜采集尺寸為400 μm×400 μm，位于濾膜中心。按匹配度為60%，計(jì)算消解液中不同H2O2濃度(0、10%、15%、20%、25%、30%)下微塑料檢出數(shù)量占所有檢測(cè)顆粒數(shù)量的比例。比例越高說(shuō)明有效檢測(cè)越多，消解效果越好，水樣中存在的微塑料被準(zhǔn)確檢出的可能性越大。不同消解條件下微塑料檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。H2O2濃度為20%時(shí)，檢出微塑料占全部檢測(cè)物質(zhì)的0.31%，比例最高，說(shuō)明在該濃度下消解充分且適宜。H2O2濃度為0時(shí)，占比<0.01%，由于存在大量的天然有機(jī)質(zhì)，其會(huì)遮蓋在待測(cè)微塑料上，造成微塑料難以檢出。10%、15%濃度下，微塑料檢出比較低，說(shuō)明消解不徹底，微塑料表面仍可殘留雜質(zhì)覆蓋而影響鑒別。25%、30%濃度下，占比<0.01%，由于水樣中存在的微塑料經(jīng)消解后其譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)相比匹配度較低，當(dāng)設(shè)定匹配度最低限為60%時(shí)難以將其辨認(rèn)為微塑料，說(shuō)明過(guò)量的H2O2會(huì)使微塑料消解過(guò)度而增加鑒別難度。

圖6 不同消解條件下微塑料檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Microplastics Detection Results under Different Digestion Conditions

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精確度

為使得水樣中微塑料濃度可準(zhǔn)確區(qū)分為低、中、高濃度組，且保證組內(nèi)加標(biāo)量均一，粒徑為10 μm的微塑料顆粒是具有代表性且可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和添加的最佳選擇。因此，本研究以直徑為10 μm的球形聚苯乙烯(PS)為試驗(yàn)對(duì)象，將其加至200 mL飲用水中，模擬實(shí)際水樣按照研究中確定的試驗(yàn)條件進(jìn)行分析檢測(cè)。試驗(yàn)條件：采用一級(jí)過(guò)濾、消解、洗脫、二級(jí)過(guò)濾的前處理方式；使用20% H2O2進(jìn)行消解；二級(jí)過(guò)濾使用氧化鋁濾膜；最后經(jīng)三點(diǎn)取樣法進(jìn)行定性定量分析。檢測(cè)結(jié)果只計(jì)入10 μm的聚苯乙烯微球，不計(jì)入飲用水本底中存在的聚苯乙烯，以避免影響結(jié)果準(zhǔn)確性。按照低、中、高濃度分為3組，每一組中6個(gè)樣品的加標(biāo)量為顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后添加，計(jì)數(shù)6次，誤差范圍為10個(gè)以內(nèi)，最終以6個(gè)樣品均數(shù)計(jì)為該組的加標(biāo)量，結(jié)果如表1所示。本方法回收率為75.64%～121.53%，低濃度組相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為22.65%，中濃度組RSD為14.74%，高濃度組RSD為11.21%。

表1 準(zhǔn)確度和精密度分析結(jié)果Tab.1 Accuracy and Precision Analysis Results

3 小結(jié)與展望

本研究探索建立了基于拉曼光譜檢測(cè)飲用水中微塑料的方法，采用一級(jí)過(guò)濾、消解、洗脫、二級(jí)過(guò)濾的前處理方式，濃度為20%的H2O2消解效果最佳，氧化鋁濾膜作為二級(jí)過(guò)濾濾膜上機(jī)最適宜。經(jīng)三點(diǎn)取樣法定量分析，方法的回收率為75.64%～121.53%，低濃度組RSD為22.65%，中濃度組RSD為14.74%，高濃度組RSD為11.21%。本方法操作便捷、回收率較高、時(shí)間成本適宜，可適用于檢測(cè)生活飲用水中的微塑料。

顯微拉曼儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在保證檢測(cè)到較小粒徑微塑料的情況下，需要較大的時(shí)間成本，因此，采用三點(diǎn)取樣法進(jìn)行定量分析。這在一定程度上會(huì)對(duì)微塑料的數(shù)量造成高估或低估，更精確更優(yōu)化的方法還亟待研究。