王淑華，周正麗，湯華軍，王 云，李開榮，孫國剛，胡光強，陳 波

西南醫(yī)科大學(xué)：1.口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（瀘州 646000）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者一個主要特征是中腦的黑質(zhì)內(nèi)大量多巴胺能神經(jīng)元的缺失和紋狀體多巴胺的缺失。目前認(rèn)為多巴胺與神經(jīng)元的退化變性與氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、凋亡及衰老等因素有關(guān)[1-3]。多巴胺受體激動劑或外源性補充多巴胺目前仍是主要治療手段，但帕金森病屬于一種進展性疾病，藥物治療也只是控制癥狀，而不能阻止疾病的發(fā)展。近年來神經(jīng)干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞、間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞等干細胞替代治療在PD治療中顯示出巨大的潛力，可在不同程度上改善PD，但仍存在一些問題，比如遺傳和表觀遺傳異常、多巴胺能神經(jīng)元的低產(chǎn)量以及細胞治療的安全性等[4]。

神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）主要是多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子，而GDNF 是維持神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)化學(xué)表型，保護多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元免受毒性損傷所必需的生物因子[5]。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）在神經(jīng)退行性疾病動物模型中已被證明具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用，也可以促進血管生成[6]。GDNF 和EPO 聯(lián)合應(yīng)用可提高移植物療效，加速功能恢復(fù)。目前檢索文獻未見GDNF基因修飾的NSCs與EPO 聯(lián)合治療PD 的報道。在本研究中，我們推測GDNF基因修飾的NSCs 與EPO 的聯(lián)合將具有協(xié)同作用，增強其對PD模型小鼠的神經(jīng)保護作用。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

C57BL/6 小鼠神經(jīng)干細胞（MUBNF-01001）及其完全培養(yǎng)基（MUBNF-90011）均購自Cyagen Biosciences 公司；重組腺病毒pAdTrack CMV-GDNF plasmid 來自西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心神經(jīng)生物研究室；MPTP（M0896，Sigma）；EPO（CYT-201，Propsec）；組織線粒體分離試劑盒（C3606，Beyotime）；線粒體膜電位分析試劑盒JC-1（C2006，Beyotime）；Transcriptor First strand cDNA synthesis kit（04896866001，Roche）；qPCR SYBR Green Master Mix（Q111-03，Vazyme）。

1.2 實驗動物

健康雄性C57BL/6 小鼠120 只，體重22～25 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)房溫度24 ℃，自由飲食水。實驗動物操作和處理符合西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會對動物實驗的倫理要求（動物實驗倫理批準(zhǔn)號：SWMU201803147）。

2 實驗方法

2.1 重組腺病毒pAdTrack CMV-GDNF轉(zhuǎn)染NSCs

將NSCs接種至6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至融合度為90%時，用0.25%胰酶消化收獲細胞吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度1×105/mL，接種于24孔板，每孔接種250 μL。次日每孔加入5 μL pAdTrack CMV-GDNF重組腺病毒質(zhì)粒（1.2×108TU/mL），混勻后置孵箱，培養(yǎng)4 h 后，各孔再添加250 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，撤病毒液更換正常培養(yǎng)基并用嘌呤霉素篩選后擴增備用。

2.2 MPTP誘導(dǎo)PD模型、分組及各組處理

成年C57BL/6 雄性小鼠120只隨機分為8組，正常組（Normal）、假手術(shù)組（Sham）、模型組（MPTP）、Sham+EPO 組、Sham+GDNF-NSCs 組、MPTP+EPO 組、MPTP+GDNF-NSCs 組和MPTP+GDNF-NSCs+EPO組，每組15 只。MPTP 無菌生理鹽水稀釋后按照35 mg/kg 腹腔注射，1 次/d，連續(xù)7d；動物出現(xiàn)暫時性軀干震顫、豎毛、尾巴過伸等癥狀，按照震顫麻痹評分表（表1）評估建模是否成功，評分不低于2分者納入后續(xù)實驗。MPTP 建模結(jié)束后，小鼠麻醉后置于小鼠腦定位儀（51730U，Stoelting 公司）上。參考《小鼠腦立體定向圖譜》第二版（澳大利亞George Paxinos 教授和加拿大Keith B.J.Franklin教授合編）確定紋狀體移植坐標(biāo)（前囟后1.0 mm，中線旁開2.0 mm，深度2.5 mm）。用5 μL微量注射器，每只小鼠接受3 μL細胞懸液（2×105），左、右側(cè)紋狀體各注射1.5 μL 細胞懸液。注射速度約0.5 μL/min，停針10 min 后緩慢退針，針孔用無菌骨蠟封口。Sham組紋狀體注射等體積生理鹽水。

表1 震顫麻痹評分Table 1 Paralysis tremor scores

2.3 小鼠行為學(xué)評估旋轉(zhuǎn)實驗和爬桿實驗

建模前及建模后第7、14、28和42 d對各鼠進行行為學(xué)檢測，旋轉(zhuǎn)實驗時所有小鼠在一根直徑約3 cm的旋轉(zhuǎn)桿上訓(xùn)練獲得統(tǒng)一基線水平后才開始MPTP 注射。旋轉(zhuǎn)桿轉(zhuǎn)速每分鐘25 圈，每次桿上維持不超過5 min，間隔5 min，連續(xù)3次。正式實驗時記錄大鼠在180 s內(nèi)桿上持續(xù)時間，間隔5 min旋轉(zhuǎn)3次取平均值。爬桿實驗正式實驗前也訓(xùn)練至統(tǒng)一基線水平，所有小鼠在一根長30 cm，寬8 mm的豎立的桿上訓(xùn)練。頭放置于桿頂部，記錄小鼠爬到桿底部的時間。正式實驗時，小鼠每次爬桿3次，記錄時間取平均值。

2.4 紋狀體多巴胺含量測定

行為學(xué)評分結(jié)束后，迅速斷頭后取腦，冰上分離紋狀體，稱重后將紋狀體放入1 mL冰冷溶液（含0.1 mol/L高氯酸和0.4 mol/L亞硫酸鈉）中，用玻璃勻漿器手動勻漿。離心后取少量勻漿液用BCA 蛋白定量試劑盒測總蛋白。余下組織勻漿液在4 ℃，10 000 r/min離心15 min后取上清液，再用0.45 μm 孔徑一次性濾過器過濾，濾液進行高效液相-電化學(xué)法測DA 含量。電化學(xué)檢測器（UltiMate?3000 ECD-3000RS，美國）電壓0.7 V，進樣量20 μL，流速0.6 mL/min。最后計算紋狀體內(nèi)總DA含量，結(jié)果用μg/g 組織總蛋白表示。

2.5 紋狀體線粒體提取及膜電位檢測

根據(jù)組織線粒體分離試劑盒說明分離收集紋狀體線粒體沉淀，線粒體膜電位檢測參照J(rèn)C-1試劑盒說明步驟進行。JC-1單體和聚合物激發(fā)后分別發(fā)綠色和紅色熒光，以紅、綠熒光的比值代表線粒體的膜電位高低。比值越高，說明線粒體的膜電位越高。

2.6 紋狀體組織Nrf2、COX2和iNOS基因檢測

紋狀體取出后，采用常規(guī)Trizol 法提取組織總RNA。使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mix分別進行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。各基因引物合成來自上海生工生物工程股份有限公司（表2）。熒光定量PCR 儀（Bio-Rad CRX96TM，美國）反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃，10 sec、60 ℃，30 sec，39個循環(huán)；融解曲線95 ℃，15 sec、60 ℃，60 sec、95 ℃，15 sec。

表2 Nrf、COX2和iNOS基因引物Table 2 Primers of Nrf,COX2 and iNOS

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。以測定時間點為重復(fù)測量因素和組內(nèi)因素，處理方式為組間因素，采用重復(fù)測量方差分析時間和組別交互作用是否對測量因素有顯著影響，Tukey事后檢驗分析組間差異，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)

旋轉(zhuǎn)實驗分析結(jié)果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=7.924，P ＜0.001），不同時間點對桿上持續(xù)時間有顯著影響（F=2 448.312，P ＜0.001）。在MPTP 注射后第7 d，模型鼠在180 s 內(nèi)桿上持續(xù)時間較正常組、Sham組、Sham+EPO組和Sham+GDNF-NSCs組明顯下降。EPO、GDNF-NSCs 和GDNF-NSCs+EPO 干預(yù)后在第14、28 和42 d 桿上持續(xù)時間均較第7 d 顯著增加（P ＜0.001）。第28 d 時，MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組增加較MPTP+GDNF-NSCs 組（P ＜0.001）和MPTP +EPO 組（P ＜0.001）更明顯。第48 d，MPTP+EPO 組和MPTP+GDNF-NSCs 組大鼠桿上持續(xù)時間下降，但MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組大鼠桿上持續(xù)時間仍呈上升趨勢，且這種上升趨勢較單獨干預(yù)的MPTP+EPO組（P ＜0.001）和MPTP+GDNF-NSCs 組（P ＜0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3 MPTP誘導(dǎo)建立小鼠帕金森模型，經(jīng)EPO、GDNF-NSCs和兩者聯(lián)用干預(yù)后評估各組不同時間旋轉(zhuǎn)行為學(xué)時間變化（s）Table 3 MPTP-induced Parkinson's mouse model,and the time changes of rotation behavior in each group at different time points were evaluated after EPO,GDNF-NSCs and their combined intervention(s)

爬桿實驗分析結(jié)果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=3.694，P ＜0.001），對桿上下來時間影響顯著，不同時間點之間也存在顯著差異（F=232.023，P ＜0.001）。在MPTP 注射后第7 d，模型鼠從桿上下來時間較正常組和Sham 組明顯增加（P ＜0.001）。EPO、GDNF-NSCs 和GDNF-NSCs+EPO 干預(yù)后在第14、28和42 d 從桿上下來時間均較第7 d 顯著降低（P ＜0.001）。第14、28 和42 d 時MPTP+GDNF-NSCs+EPO組（P ＜0.001）和MPTP+GDNF-NSCs 組（P=0.015）下桿時間均較MPTP+EPO 組下降更顯著，但MPTP +EPO 組爬桿時間沒有明顯變化，聯(lián)合干預(yù)組爬桿時間進一步下降接近正常組（表4）。

表4 MPTP誘導(dǎo)建立小鼠帕金森模型，經(jīng)EPO、GDNF-NSCs和兩者聯(lián)用干預(yù)后評估各組不同時間爬桿行為學(xué)時間變化（s）Table 4 MPTP-induced Parkinson's mouse model,and the time changes of pole climbing behavior in each group at different time points were evaluated after EPO,GDNF-NSCs and their combined intervention(s)

3.2 紋狀體多巴胺含量

紋狀體多巴胺含量分析結(jié)果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=6.559，P ＜0.001），對紋狀體多巴胺含量影響顯著。不同時間點之間也存在顯著差異（F=1 159.502，P ＜0.001）。MPTP注射第7 d，小鼠紋狀體多巴胺含量較正常組明顯下降（P ＜0.001）。GDNF-NSCs、EPO 和聯(lián)用治療后，在第14、28 和42 d 紋狀體多巴胺含量均較第7 d 顯著增加（P ＜0.001），也均較MPTP 模型組明顯增加（P ＜0.001）。單純EPO 治療組隨時間延長呈下降趨勢，而聯(lián)用治療組隨時間延長較MPTP+GDNF-NSCs組（P ＜0.001）和MPTP+EPO組（P ＜0.001）增加更明顯（表5）。

表5 小鼠紋狀體多巴胺含量變化（ng/g）Table 5 Changes of dopamine content in striatum of mice(ng/g)

3.3 紋狀體線粒體膜電位

紋狀體線粒體膜電位分析結(jié)果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=4.187，P ＜0.001），對紋狀體線粒體膜電位影響顯著。不同時間點之間也存在顯著差異（F=501.359，P ＜0.001）。MPTP 注射后第7 d，小鼠紋狀體線粒體膜電位較正常組和Sham 組明顯下降。GDNF-NSCs、EPO 和聯(lián)合干預(yù)后，在第14、28 和42 d時，三組線粒體膜電位均較第7 d時顯著增加。在第14、28 和42 d，GDNF-NSCs 和聯(lián)合干預(yù)組也較MPTP 組線粒體膜電位顯著增加。EPO 治療在第14、28 和42 d 時沒有顯著差異。聯(lián)合治療組在第14、28和42 d時線粒體膜電位也較單純GDNF-NSCs治療組顯著增加（表6）。

表6 小鼠紋狀體線粒體膜電位（紅/綠，%）變化Table 6 Changes of mitochondrial membrane potential(red/green,%)in striatum of mice

3.4 紋狀體組織抗氧化相關(guān)基因表達

熒光定量PCR 檢測抗氧化基因Nrf2、COX2和iNOS表達結(jié)果分析顯示：組別與時間之間有交互作用（Fnrf2交互=2.256，P=0.004；Fcox2交互=4.329，P ＜0.001；Fi-NOS交互=7.905，P ＜0.001），均對紋狀體抗氧化相關(guān)基因影響顯著。在不同時間點檢測也存在顯著差異（Fnrf2=46.569，P ＜0.001；Fcox2=1 544.488，P ＜0.001；FiNOS=3 232.150，P ＜0.001）。MPTP 腹腔連續(xù)注射7 d 時MPTP組、MPTP+EPO 組、MPTP+GDNF-NSCs 組和MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組 紋 狀 體Nrf2、COX2和iNOS的mRNA 水平均較Normal 組和Sham 組顯著增加（P ＜0.001）。在第14、28和42 d 時，GDNF-NSCs 及聯(lián)合干預(yù)后，Nrf2、COX2和iNOS的mRNA水平均較第7 d時顯著降低；在第28、42 d 時，EPO 干預(yù)組Nrf2、COX2和iNOS的mRNA 水平均較第7、14 d 時顯著降低（P ＜0.001）；聯(lián)合干預(yù)組COX2和iNOS的mRNA 水平在第14、28 和42 d 時也較GDNF-NSCs 干預(yù)組顯著降低（P ＜0.001）（表7，8，9）。

表7 各組不同時間點小鼠紋狀體Nrf2基因表達變化Table 7 Changes of Nrf2 gene expression in striatum of mice at different time points in each group

4 討論

帕金森病已經(jīng)成為社會人群中主要的中樞神經(jīng)退行性疾病之一，研究資料提示，遺傳因素為PD 的主要根源，環(huán)境因素是誘導(dǎo)因素，氧化應(yīng)激、免疫異常等是發(fā)病表現(xiàn)。目前左旋多巴仍為治療PD 的一線臨床藥物，是PD 患者因多巴胺分泌不足采用的替代療法，治標(biāo)不治本。因此，需要尋找新的治療方法，本文利用GDNF基因修飾的NSCs 聯(lián)合EPO 治療帕金森小鼠，顯示兩者聯(lián)用在針對多巴胺含量、線粒體膜電位、抗氧化相關(guān)基因的表達方面，較單一治療有明顯優(yōu)勢，且兩者聯(lián)用治療效果能持續(xù)到建模后42 d；聯(lián)用組行為學(xué)檢測旋轉(zhuǎn)實驗和爬桿實驗也顯示相似的趨勢，提示兩者聯(lián)用使帕金森小鼠的神經(jīng)功能得到明顯改善。PD最主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡而引起紋狀體DA 含量的顯著性減少。有文獻報道在MPTP 誘導(dǎo)的大鼠[7]和非人靈長類動物[8]帕金森疾病模型中，GDNF均顯示對黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元的保護作用。由于GDNF 不能透過血腦屏障，并且腦室內(nèi)給藥有強烈的副作用[9]，因此目前主要通過構(gòu)建過表達GDNF基因的各類病毒載體，如腺病毒[10]、腺相關(guān)病毒[11]等病毒載體或者構(gòu)建過表達GDNF基因干細胞，如間充質(zhì)干細胞[12]、神經(jīng)干細胞[13]等干細胞，經(jīng)靜脈或腦內(nèi)定向注射給藥。本文用GDNF基因修飾的神經(jīng)干細胞治療帕金森小鼠也顯示出治療有效性，和文獻報道是一致的。

表8 各組不同時間點小鼠紋狀體COX2基因表達變化Table 8 Changes of COX2 gene expression in striatum of mice at different time points in each group

表9 各組不同時間點小鼠紋狀體iNOS基因表達變化Table 9 Changes of iNOS gene expression in striatum of mice at different time points in each group

氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎性是帕金森疾病多巴胺能神經(jīng)退變的早期事件，也是帕金森疾病的成因之一。腦富含線粒體，而線粒體是細胞內(nèi)活性氧的主要來源，其膜電位的下降是細胞早期凋亡的一個標(biāo)志性事件。研究結(jié)果顯示GDNF-NSCs 能在較長時間內(nèi)持續(xù)增加線粒體膜電位，在聯(lián)用EPO 后，這種改變更顯著。EPO 是由腎小管周圍間質(zhì)細胞和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠增強機體對氧的結(jié)合、運輸和供應(yīng)能力，一方面有利于紋狀體內(nèi)移植的神經(jīng)干細胞存活，另一方面，可緩解腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元凋亡[14]。已有文獻報道，在帕金森疾病模型中，EPO 發(fā)揮神經(jīng)保護作用依賴于PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路的激活，減少紋狀體神經(jīng)元凋亡，顯著改善帕金森疾病模型的功能評分[15]。本文利用GDNF-NSCs 和EPO 聯(lián)用顯示出治療帕金森疾病的協(xié)同效應(yīng)，提示治療帕金森疾病多巴胺能神經(jīng)元早期凋亡程度有所減輕。

Nrf2是目前已知的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白之一，對外源性氧化刺激敏感，激活后從細胞骨架解離進入核內(nèi)，和抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動下游數(shù)百種抗氧化、抗炎及抗凋亡相關(guān)基因的表達[16]。已有文獻報道Nrf2/ARE信號在電針治療帕金森疾病中發(fā)揮抗氧化作用[17]。在帕金森疾病模型中紋狀體COX2基因表達增加使運動功能障礙更甚[18]。iNOS可存在于內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、神經(jīng)吞噬細胞及神經(jīng)細胞中，在不同腦區(qū)呈選擇性分布，在帕金森患者腦內(nèi)，iNOS 表達增加[18]。在嚙齒類動物研究中也顯示iNOS 表達增加在慢性炎癥過程及其他一些疾病中可能起有害作用，抑制iNOS表達能減輕帕金森疾病運動功能障礙并阻止COX2表達增加[19]。所以，抗炎和抗氧化應(yīng)激在帕金森疾病治療中有重要價值。研究結(jié)果顯示，治療組紋狀體Nrf2基因表達均較帕金森模型組增加，且GDNF-NSCs組顯著增加；COX2基因和iNOS基因表達均較模型組減少，且GDNF-NSCs 組下降更顯著，提示GDNF-NSCs 治療帕金森疾病的可能機制是通過增加Nrf2基因表達、下調(diào)iNOS和COX2 基因表達達到抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用。但同時也發(fā)現(xiàn)，即使使用GDNF-NSCs 和EPO 聯(lián)合治療帕金森模型小鼠，小鼠的行為學(xué)功能也不能恢復(fù)到正常水平，由于帕金森疾病病因仍不清楚，該治療方法仍有局限性，有待進一步深入研究，尋找更好的治療方法。

5 結(jié)論

GDNF基因修飾的NSCs聯(lián)合EPO可能通過增加氧化應(yīng)激抵抗發(fā)揮帕金森小鼠神經(jīng)保護作用。基于GDNF基因修飾的神經(jīng)干細胞聯(lián)合EPO治療帕金森病有一定的應(yīng)用價值。

（利益沖突：無）