張書(shū)閱 熊安然 潘予琮 余詩(shī)強(qiáng) 蔣林樹(shù)* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

燕麥草是反芻動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的粗飼料來(lái)源之一，然而燕麥草品質(zhì)易受品種、產(chǎn)地、加工方式、成熟度及刈割時(shí)期等因素的影響，不同來(lái)源的燕麥草營(yíng)養(yǎng)成分及含量差異較大[1-3]。傳統(tǒng)化學(xué)方法測(cè)定飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分需要大量人力、物力和財(cái)力，過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、危險(xiǎn)性大，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用不夠便捷，因此，尋求燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的高效、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定方法顯得尤為重要[4]。近紅外光譜(near infrared spectrum，NIRS)分析技術(shù)是1970年發(fā)展起來(lái)結(jié)合傳統(tǒng)濕化學(xué)方法、化學(xué)計(jì)量學(xué)以及近紅外光譜技術(shù)的高新分析技術(shù)[5]。NIRS在原料樣品的分子水平上提供了光譜特征，可用于預(yù)測(cè)樣品成分信息，與傳統(tǒng)化學(xué)分析與物理分析方法相比，具有檢測(cè)速度快、效率高、環(huán)保無(wú)污染、檢測(cè)水平較為穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)[6]。此外，NIRS測(cè)定具有定量分析優(yōu)勢(shì)，在操作過(guò)程中不需要進(jìn)行樣品稱量，就可以連續(xù)進(jìn)行無(wú)限次的樣品分析[7]。NIRS分析技術(shù)的快速發(fā)展，為飼料品質(zhì)快速鑒定、飼料消化參數(shù)預(yù)測(cè)、飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分快速測(cè)定、飼料產(chǎn)地溯源等提供了技術(shù)途徑[8-16]。研究利用NIRS分析技術(shù)快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的可行性是非常必要的。本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)燕麥草的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定和NIRS掃描，建立燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的近紅外預(yù)測(cè)模型，為生產(chǎn)中快速高效測(cè)定燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本試驗(yàn)于2017—2019年期間，從我國(guó)京津翼地區(qū)的牛場(chǎng)及種植基地收集了80份不同品種、不同產(chǎn)地和不同成熟度的燕麥草樣品。將80份燕麥草樣品經(jīng)烘箱干燥(65 ℃，48 h)后用旋風(fēng)磨進(jìn)行粉碎，然后用四分法縮分至400 g并將其分為3部分：一部分用于燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的濕化學(xué)檢測(cè)；一部分用于NIRS的掃描；一部分留樣保存。使用密封袋密封樣品然后置于-18 ℃的冰箱中待用，在掃描樣品光譜圖和檢測(cè)樣品的營(yíng)養(yǎng)成分含量前把燕麥草拿出置于26 ℃下平衡溫度1 d左右再對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 模型構(gòu)建流程圖

1.2 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的檢測(cè)

燕麥草中水分(MSTR)含量參照GB/T 6435—2014方法測(cè)定；粗蛋白質(zhì)(CP)含量參照GB/T 6432—2018方法(KDY-9830凱氏定氮儀、KXL-1010溫控消煮爐)測(cè)定；中性洗滌纖維(NDF)含量參照GB/T 20806—2006方法(ANKOM 2000i全自動(dòng)纖維分析儀)測(cè)定；酸性洗滌纖維(ADF)含量參照NY/T 1459—2007方法(ANKOM 2000i全自動(dòng)纖維分析儀)測(cè)定；粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006方法(DFA-2型分布式脂肪測(cè)定儀)測(cè)定；粗灰分(Ash)含量參照GB/T 6438—2007方法(SX2-2 5-12A數(shù)顯箱式電爐)測(cè)定。每個(gè)樣品的每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值作為最終理化測(cè)定值，所有營(yíng)養(yǎng)成分含量均以干物質(zhì)(DM)為基礎(chǔ)。

1.3 燕麥草的NIRS分析

1.3.1 燕麥草的NIRS采集

使用MPA型多功能NIRS儀(德國(guó)BRUKER公司)進(jìn)行燕麥草光譜圖的采集，測(cè)定條件為積分球附件，掃描光譜范圍為4 000～12 800 cm-1，分辨率為16 cm-1，旋轉(zhuǎn)掃描次數(shù)是64次，以logl/R形式記錄數(shù)據(jù)。每份燕麥草重復(fù)裝樣及掃描2次，控制2次裝樣深度，表面平整度盡量保持一致，取平均值作為建模參比值。80份燕麥草樣品的近紅外原始光譜圖見(jiàn)圖2，不同燕麥草樣品中所含碳?xì)滏I、氧氫鍵、氮?dú)滏I的含量多少不一，其所對(duì)應(yīng)的吸收峰也存在差異，根據(jù)每個(gè)樣品的吸收峰來(lái)判定其營(yíng)養(yǎng)成分含量。

圖2 燕麥草原始光譜圖

1.3.2 近紅外預(yù)測(cè)模型建立

構(gòu)建模型之前對(duì)得到的燕麥草NIRS進(jìn)行預(yù)處理，使用多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、矢量歸一化(vector normalization,SNV)、減去一條直線、最小-最大歸一化、一階導(dǎo)數(shù)(1st derivative)、二階導(dǎo)數(shù)(2nd derivative)、一階導(dǎo)數(shù)+SNV、一階導(dǎo)數(shù)+減去一條直線、一階導(dǎo)數(shù)+MSC這幾種方法處理光譜圖，并通過(guò)對(duì)比所建模型的均方根誤差，確定最終的預(yù)處理方式，提高模型信噪比及準(zhǔn)確性。利用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件OPUS 7.5對(duì)80份燕麥草樣品按3∶1進(jìn)行隨機(jī)分組，其中60份燕麥草樣品作定標(biāo)集(n=60)，用來(lái)建立定標(biāo)模型；20份燕麥草樣品作驗(yàn)證集(n=20)，用于對(duì)定標(biāo)模型效果進(jìn)行外部驗(yàn)證。使用OPUS 7.5中的偏最小二乘(partial least squares regression,PLS)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法將燕麥草的光譜圖和理化指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，交叉檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型效果。以校正決定系數(shù)(calibration decision coefficient,RSQcal)、校正均方根誤差(calibration root mean square error,RMSEC)、交叉驗(yàn)證決定系數(shù)(cross-validation determination coefficient,1-VR)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(cross-validation root mean square error,RMSECV)、交叉驗(yàn)證相對(duì)分析誤差(cross-validation relative analysis error,RPDCV)、平均偏差(Bias)6個(gè)指標(biāo)對(duì)定標(biāo)模型效果進(jìn)行評(píng)估。RSQcal和1-VR越接近于1，所建模型效果越好；RMSEC和RMSECV越低，所建模型效果越好。當(dāng)1-VR最大，RMSECV最小時(shí)的預(yù)測(cè)模型效果準(zhǔn)確性相對(duì)較高。

1.3.3 近紅外預(yù)測(cè)模型外部驗(yàn)證

對(duì)構(gòu)建的燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量預(yù)測(cè)模型，使用驗(yàn)證集對(duì)定標(biāo)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，得到預(yù)測(cè)決定系數(shù)(prediction coefficient,RSQV)、預(yù)測(cè)均方根誤差(prediction root mean squared error,RMSECP)和預(yù)測(cè)相對(duì)分析誤差(ratio of performance to deviation for validation,RPDV)3種評(píng)定模型效果的參數(shù)，其中RSQV和RPDV越高，RMSECP越低，表明模型預(yù)測(cè)效果越好，模型的適用性較強(qiáng)。實(shí)際生產(chǎn)中，常設(shè)定RSQV>0.80時(shí)，定標(biāo)模型可用于實(shí)際檢測(cè)；0.66≤RSQV<0.80時(shí)，定標(biāo)模型可用于粗略預(yù)測(cè)；RSQV<0.66時(shí)，模型不能用于實(shí)際檢測(cè)；RPDV≥2.5時(shí)，定標(biāo)模型可用于實(shí)際檢測(cè)；2.0≤RPDV<2.5時(shí)，定標(biāo)模型可用于樣品的粗略篩選；RPDV<2.0時(shí)，定標(biāo)模型的使用受到限制[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量及變異

燕麥草全集、定標(biāo)集以及驗(yàn)證集的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表1。80份燕麥草樣品中各營(yíng)養(yǎng)成分含量范圍(DM基礎(chǔ))：MSTR 2.82%～9.54%、ADF 26.39%～44.53%、NDF 49.51%～70.28%、CP 5.23%～13.91%、EE 0.06%～3.10%以及Ash 1.23%～15.07%。燕麥草的各項(xiàng)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的變異系數(shù)為7.3%～43.4%，其中MSTR、CP、EE和Ash的變異系數(shù)均大于10%，變異較大。

表1 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量及變異范圍(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量近紅外預(yù)測(cè)模型的建立和優(yōu)化

采用PLS分別對(duì)經(jīng)過(guò)不同預(yù)處理的光譜進(jìn)行建模分析，并以交叉驗(yàn)證的方式進(jìn)行預(yù)測(cè)，具有最低RMSECV和最高的1-VR的模型作為最優(yōu)模型，定標(biāo)過(guò)程中根據(jù)全局距離(GH≥3)和T檢驗(yàn)(T>2.5)進(jìn)行異常值的剔除。最優(yōu)定標(biāo)模型評(píng)價(jià)參數(shù)如表2所示。對(duì)原始光譜施以不同的預(yù)處理方法可以使燕麥常規(guī)草營(yíng)養(yǎng)成分含量模型達(dá)到理想的預(yù)測(cè)水平。其中，通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行減去一條直線處理，MSTR含量定標(biāo)結(jié)果RSQcal=0.968、RMSEC=0.317、1-VR=0.953、RMSECV=0.378、RPDCV=4.23；對(duì)原始光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，CP含量定標(biāo)結(jié)果RSQcal=0.977、RMSEC=0.300、1-VR=0.948、RMSECV=0.410、RPDCV=4.18；對(duì)原始光譜進(jìn)行MSC處理，NDF含量定標(biāo)結(jié)果RSQcal=0.950、RMSEC=1.060、1-VR=0.927、RMSECV=1.180、RPDCV=3.70。上述3個(gè)指標(biāo)定標(biāo)模型較為精準(zhǔn)(1-VR均>0.9，RPDCV均≥3)，可有效應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。ADF含量預(yù)測(cè)模型通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)+SNV處理，定標(biāo)結(jié)果RSQcal=0.950、RMSEC=0.856、1-VR=0.893、RMSECV=1.160、RPDCV=3.00；Ash含量預(yù)測(cè)模型通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行最小-最大歸一化處理，定標(biāo)結(jié)果RSQcal=0.886、RMSEC=1.300、1-VR=0.840、RMSECV=1.440、RPDCV=2.50。ADF和Ash含量預(yù)測(cè)模型效果較好(1-VR均>0.84，RSQcal均≥0.886)。EE含量預(yù)測(cè)模型通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，定標(biāo)結(jié)果為RSQcal=0.870、RMSEC=0.250、1-VR=0.772、RMSECV=0.316、RPDCV=1.80，其中1-VR<0.8，RPDCV<2，模型效果不理想，不能應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)中。

2.3 燕麥草最優(yōu)定標(biāo)模型的驗(yàn)證

燕麥草MSTR、CP、NDF、ADF、EE和Ash含量定標(biāo)模型建立后，用驗(yàn)證集樣品對(duì)這6個(gè)指標(biāo)的最優(yōu)定標(biāo)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，并將其預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3、圖4所示。結(jié)果表明：燕麥草中MSTR、CP、NDF、ADF和Ash含量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間的RSQv均大于0.80，分別為0.945、0.918、0.940、0.886、0.846，RPDV均大于2.5，表明上述所構(gòu)建的NIRS預(yù)測(cè)能夠有效地對(duì)燕麥草中的MSTR、CP、NDF、ADF和Ash含量進(jìn)行預(yù)測(cè)且適用性良好；燕麥草中EE含量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間的RSQv為0.735，0.66≤RSQV<0.80，RPDV=1.95<2.0，定標(biāo)模型暫不能應(yīng)用于燕麥草中EE含量的實(shí)際檢測(cè)

表2 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的最優(yōu)定標(biāo)模型

表3 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量最優(yōu)定標(biāo)模型的外部驗(yàn)證(干物質(zhì)基礎(chǔ))

3 討 論

本試驗(yàn)中所收集的燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量變化幅度較大、覆蓋面較為廣泛，有利于NIRS模型的構(gòu)建和預(yù)測(cè)；樣品間的離散程度大，表明所選樣品分布廣泛，具有較強(qiáng)的代表性。燕麥草中MSTR、CP、NDF、ADF和Ash含量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間的RSQv均大于0.80，證明所構(gòu)建的近紅外預(yù)測(cè)模型能夠有效地對(duì)燕麥草中MSTR、CP、NDF、ADF和Ash含量進(jìn)行預(yù)測(cè)且適用性良好。通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)的處理得到的EE含量預(yù)測(cè)模型效果不理想，不能應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)中。NIRS預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物的極限含量是0.1%，本試驗(yàn)中EE含量近紅外預(yù)測(cè)模型效果較差可能是由于燕麥草中粗脂肪含量過(guò)低導(dǎo)致的[18]。劉哲等[19]采集了內(nèi)蒙古錫林郭勒盟草原主要粗飼料及混合粗飼料樣品共407份，用修正偏最小二乘回歸 (modified partial least squares,MPLS)法對(duì)其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量構(gòu)建近紅外預(yù)測(cè)模型，EE含量的外部驗(yàn)證相對(duì)分析誤差(relative prediction deviation，RPD)小于2.5，外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(coefficient of determination of external validation,RSQ)為0.806，無(wú)法用于生產(chǎn)中定量分析，而NDF、DM、CP、Ash含量等指標(biāo)都取得了較好的定標(biāo)效果，這與本研究的結(jié)果相類(lèi)似。

圖3 燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值相關(guān)圖

NIRS與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法聯(lián)用，包括光譜預(yù)處理、變量選擇、多元校正和模型轉(zhuǎn)移，一定程度上能夠提高NIRS模型的可靠性和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度[20]。Chen等[21]研究采用NIRS與多元線性回歸(multivariable linear regression,MLR)、主成分回歸(principal component regression,PCR)和PLS相結(jié)合的新技術(shù)，對(duì)黑龍江羊草(Leymuschinensis)的化學(xué)品質(zhì)包括CP、ADF、NDF和氨基酸含量進(jìn)行了較為可靠的預(yù)測(cè)。Xu等[14]使用主成分分析(principal component analysis,PCA)、判別分析(discriminant analysis,DA)和判別式偏最小二乘法(discriminant partial least-square,DPLS)回歸方法，應(yīng)用NIRS對(duì)浙雜205和浙雜207兩個(gè)商品化番茄新品種進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒別。本試驗(yàn)在構(gòu)建燕麥草不同營(yíng)養(yǎng)成分含量近紅外預(yù)測(cè)模型中，對(duì)近紅外原始光譜圖進(jìn)行了不同的預(yù)處理，在此基礎(chǔ)上再結(jié)合PLS分析，將燕麥草的光譜圖和理化指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，交叉檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型效果，最終得到準(zhǔn)確度較高的MSTR、CP、NDF、ADF和Ash含量5個(gè)預(yù)測(cè)模型。

儲(chǔ)存環(huán)境、刈割時(shí)期、來(lái)源產(chǎn)地、葉莖比等都會(huì)影響燕麥草的品質(zhì)[22-24]。在本研究中構(gòu)建的近紅外預(yù)測(cè)模型能夠快速對(duì)燕麥草中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量進(jìn)行測(cè)算，但是本研究只選取了京津冀地區(qū)共80份不同來(lái)源的燕麥草，60份燕麥草作為校準(zhǔn)集、20份燕麥草作為預(yù)測(cè)集，還不足以涵蓋更廣泛的營(yíng)養(yǎng)特性。為提高燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量近紅外預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和適用性，應(yīng)在今后的研究中擴(kuò)大建模樣品的數(shù)量，進(jìn)一步加強(qiáng)樣品的代表性，獲取更多更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)完善模型的應(yīng)用性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用NIRS分析技術(shù)建立了燕麥草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的近紅外預(yù)測(cè)模型。其中除了EE含量預(yù)測(cè)模型暫不能應(yīng)用以外，MSTR、CP、NDF、ADF以及Ash含量預(yù)測(cè)模型外部驗(yàn)證RSQV為0.846～0.945、RPDV為2.57～4.20，均可應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中且適用性良好，其中MSTR、CP、NDF含量的定標(biāo)模型效果更為準(zhǔn)確和可靠。