蒲俊華 劉茵茵* 陳大偉 高玉時** 陸俊賢 張小燕 唐夢君 周 倩 孔令武

(1.江蘇省家禽科學研究所，揚州225125；2.揚州雙揚生物科技有限公司，揚州225124)

近年來，隨著人們對食品安全的重視，飼料中的鎘(cadmium，Cd)污染也日漸引起人們的關(guān)注。Cd是一種毒性較強的重金屬，易在土壤、水體等環(huán)境中蓄積，并向植物遷移，最終通過食物鏈遷移至動物和人體內(nèi)蓄積[1]。Cd的半衰期可長達25～30年，對機體的肝臟、腎臟和骨骼等組織系統(tǒng)造成嚴重損害，并具有強烈的致癌作用，被國際癌癥研究所(IARC)列為Ⅰ級致癌物[2-3]。

鑒于Cd的嚴重危害性，《飼料衛(wèi)生標準》(GB 13078—2017)對配合飼料中Cd的含量規(guī)定了限量：Cd≤0.5 mg/kg(水產(chǎn)配合飼料除外)。有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，飼料中Cd元素存在超標現(xiàn)象和風險，如湖北省2012—2016年飼料Cd含量最高為1.2 mg/kg[4]，而四川省、河北省蛋雞配合飼糧中Cd含量雖未超標但有超標風險[5]。針對飼料中存在Cd超標的狀況和風險，可采用吸附劑如麥飯石、沸石等減少動物體內(nèi)Cd的吸收[6-7]，或者補加維生素[8]、抗氧化劑[9]等降低Cd對機體造成的氧化損害，但目前還沒有專一、安全有效地降低Cd毒性的方法[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，可調(diào)節(jié)動物腸道發(fā)育、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收的乳酸菌可通過在腸道吸附Cd，減少Cd經(jīng)腸道吸收進入血液和組織，還可通過調(diào)控腸肝循環(huán)促進動物體內(nèi)Cd的排泄，減輕Cd對動物機體的損害和毒性[10-11]。乳酸菌是目前公認的安全微生物[12]，在食品工業(yè)中應用廣泛，而在《飼料添加劑品種目錄》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2045號)[13]，允許使用的34種微生物添加劑中有16種為乳酸菌。目前具有耐Cd性質(zhì)的菌株多是從土壤或糞便[14]、污泥[15]、食品[16]等篩選獲得，且在動物上的應用研究多集中在鼠類和魚類上[17-18]，在家禽上的應用研究僅見于本團隊在雞上開展的試驗[19-21]。而來源于動物體內(nèi)的具有耐重金屬乳酸菌的篩選研究僅見于耐鉛[22-23]和耐汞[24]，耐Cd的乳酸菌篩選還未見有報道。本研究的目的即是從雞體內(nèi)分離篩選出具有Cd吸附能力的耐Cd乳酸菌株，并對其進行生物學鑒定，為將其開發(fā)應用于家禽飼料中提供理論基礎，同時對防控家禽飼料及動物養(yǎng)殖中Cd及其他重金屬污染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：MRS肉湯培養(yǎng)基(Soarbio，M8540)、MRS瓊脂培養(yǎng)基(Soarbio，M8330)、乙酸鎘(國藥，33061)、牛膽鹽(Soarbio，G8210)、DNA提取試劑盒(TaKaRa，9763)、磷酸鹽緩沖液(PBS，Soarbio，P1032)、LB培養(yǎng)基。

儀器：生化培養(yǎng)箱(HPS-150，太倉市華美生化儀器廠)、生物安全柜(ESCO AC2，新加坡藝思高科技有限公司)、高壓滅菌鍋(MLS-3750，日本SANYO公司)、分光光度計(V-5000，上海元析儀器有限公司)、全溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQTY-90S，知楚儀器公司)、原子吸收分光光度計(AA800，鉑金埃爾默公司)。

1.2 耐Cd乳酸菌株的分離鑒定

1.2.1 耐Cd乳酸菌株的分離

取雞腸道內(nèi)容物1 g，用無菌PBS逐級稀釋至10-4、10-5、10-6，用接種環(huán)取1環(huán)接種于含50 mg/L Cd(取0.238 g C4H6CdO4·2H2O，溶解于10 mL超純水中，配制成10 g/L的Cd溶液，按1∶200比例加入MRS培養(yǎng)基中，使Cd2+濃度為50 mg/L)的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落，接種于含100 mg/L Cd(取10 g/L的Cd溶液，按1∶100比例加入MRS培養(yǎng)基中，使Cd2+濃度為100 mg/L)的MRS固體培養(yǎng)基上，同條件培養(yǎng)48 h后，挑選單菌落，重復接種于含100 mg/L Cd的MRS固體培養(yǎng)基上純化后，挑選單菌落進行革蘭氏染色。

1.2.2 耐Cd乳酸菌株生物學鑒定

提取乳酸菌株基因組DNA，利用16S rRNA基因通用上游引物27F(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)和下游引物1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR擴增16S rRNA基因，PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s， 30個循環(huán)，72 ℃ 5 min，16 ℃。PCR擴增產(chǎn)物取4 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳，剩余PCR擴增產(chǎn)物送山東青島英賽特生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定乳酸菌種屬。

1.2.3 耐Cd乳酸菌株的生長特性

乳酸菌株按1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在2、4、8、12、18和24 h時，取1 mL用分光光度計測量菌液在600 nm處的吸光度(OD600 nm)值，繪制生長曲線圖。

1.3 耐Cd乳酸菌株最大Cd耐受量

乳酸菌株按1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)18 h，調(diào)OD600 nm為1，分別取1環(huán)劃線接種至含100、200、400、800、1 000 mg/L Cd的培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果。

1.4 耐Cd乳酸菌株在不同pH條件下對Cd的吸附性

乳酸菌株按1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)18 h后，10 000 r/min離心10 min，去上清，超純水清洗沉淀后，調(diào)吸光度為1，取0.5 mL溶液10 000 r/min，離心10 min，去除上清，分別加入pH為2.6、4.0、6.0和7.0的50 mg/L Cd溶液0.5 mL懸浮沉淀，每株菌作3個重復。37 ℃中速振蕩2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋后，用石墨爐法測定溶液中的Cd含量，利用以下公式計算乳酸菌Cd吸附率：

吸附率(%)=[1-(C1/C0)]×100。

式中：C0為吸附前溶液Cd濃度；C1為吸附后上清液中Cd濃度。

1.5 耐Cd乳酸菌株膽鹽耐受性

參考文獻[15,22]報道的方法，稍做調(diào)整。耐Cd乳酸菌以1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，調(diào)OD600 nm為1，取1 mL乳酸菌液分別加入9 mL含0.1%、0.3%、0.5%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃中速振搖培養(yǎng)1 h后取1環(huán)接種至MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。

1.6 耐Cd乳酸菌抑菌性

耐Cd乳酸菌按1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，調(diào)菌液OD600 nm為1，取1 mL菌液10 000 r/min離心10 min，取上清液于無菌管中，將直徑6 mm的無菌濾紙片分別浸入菌液和菌液上清液中。將金黃色葡萄球菌(本實驗室分離)、大腸桿菌(ATCC 25922)、沙門氏菌(ATCC 14028)用LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h后，調(diào)三者菌液OD600 nm至0.08～0.10，各取100 μL菌液分別鋪于LB培養(yǎng)皿，將浸液濾紙片分別鋪在細菌培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA進行單因素方差分析，LSD進行均值間的多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，采用GraphPad Prism 5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐Cd乳酸菌的革蘭氏染色結(jié)果

樣品經(jīng)含50和100 mg/L Cd的MRS的培養(yǎng)基純化后，在100 mg/L的培養(yǎng)基上形成單個小而突出的菌落。挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡下呈紫色桿狀，表明菌株為革蘭氏陽性菌(圖1)。

圖1 耐Cd乳酸菌株的革蘭氏染色

2.2 耐Cd乳酸菌生物學鑒定

從篩選出的耐Cd乳酸菌株中選取5株菌，提取菌株的DNA經(jīng)PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶約1 500 bp，與PCR產(chǎn)物大小相符(圖2)，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定5株耐Cd乳酸菌分別為：約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)1株，命名為Cd3-1，卷曲乳桿菌(Lactobacilluscurella)4株，分別命名為Cd1-1、Cd5-2、Cd4-5、Cd8-2。

1～5為耐Cd乳酸菌株Cd1-1、Cd3-1、Cd5-2、Cd4-5、Cd8-2；6、7為陰性對照；M為Marker。

2.3 耐Cd乳酸菌的生長特性

耐Cd乳酸菌的24 h生長曲線(圖3)顯示，耐Cd乳酸菌的生長增殖符合一般微生物的生長特性，在0～2 h生長較為緩慢，在4～12 h處于對數(shù)生長期，在12～18 h處于緩慢生長期，而在18 h后數(shù)量開始減少。

圖3 5株耐Cd乳酸菌生長曲線

2.4 耐Cd乳酸菌的最大Cd耐受量

表1顯示，菌株Cd3-1、Cd5-2和Cd8-2可耐受的最大Cd濃度為1 000 mg/L，而Cd1-1和Cd4-5可耐受的最大Cd濃度為400 mg/L，表明Cd3-1、Cd5-2和Cd8-2菌株的Cd耐受量高于Cd1-1和Cd4-5。

表1 耐Cd乳酸菌耐受最大Cd濃度

2.5 不同pH條件對耐Cd乳酸菌吸附Cd的影響

圖4顯示，pH對菌株吸附Cd的影響較大。在pH為2.6時，各菌株對50 mg/L Cd溶液Cd的吸附率在20%左右，菌株間的Cd吸附率無顯著差異(P>0.05)。隨著pH的升高，Cd的吸附率上升，pH為6.0時，除Cd5-2外，其余菌株Cd的吸附率均超過30%，其中，Cd4-5的Cd吸附率達到最高，接近40%，顯著高于Cd3-1、Cd5-2和Cd8-2(P<0.05)。在pH 7.0時除Cd3-1的Cd吸附率略低于30%外，其余菌株的Cd吸附率均高于30%，其中Cd5-2的Cd吸附率最高，為38.8%，顯著高于Cd3-1和Cd4-5(P<0.05)。各菌株在pH 6.0和7.0時Cd吸附率均顯著高于其在pH 2.6時的Cd吸附率(P<0.05)。

2.6 耐Cd乳酸菌對膽鹽的耐受性

選取的5株耐Cd乳酸菌株Cd1-1、Cd3-1、Cd5-2、Cd4-5、Cd8-2經(jīng)0.3%膽鹽作用1 h后均可在MRS培養(yǎng)基上生長，其中Cd3-1和Cd8-2經(jīng)0.5%膽鹽作用1 h后在MRS培養(yǎng)基上長出單菌落，結(jié)果表明這5株菌可耐受0.3%的膽鹽，且Cd3-1和Cd8-2可耐受0.5%的膽鹽。

2.7 耐Cd乳酸菌抑菌結(jié)果

5株耐Cd乳酸菌的抑菌試驗結(jié)果表明，不含耐Cd乳酸菌的上清培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均無抑菌效果，而含耐Cd乳酸菌的培養(yǎng)液均對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出可抑制其生長，其中以Cd3-1、Cd5-2和Cd8-2菌株抑菌圈較大，Cd1-1和Cd4-5抑菌圈較小，表明前3株菌的抑制金黃色葡萄球菌的效果強于后2株菌(圖5)。含耐Cd乳酸菌的培養(yǎng)液對大腸桿菌和沙門氏菌未表現(xiàn)出抑菌作用。

同一pH的數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5 耐Cd乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用

3 討 論

3.1 耐重金屬Cd乳酸菌的篩選

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱，屬于兼性厭氧菌。乳酸菌因其細胞壁的結(jié)構(gòu)特征，可耐受一定濃度的Cd[25-26]。利用乳酸菌的這種吸附特性可篩選出高耐受Cd的乳酸菌。熊婧[14]通過最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定方法，從土壤、糞便及標準乳酸桿菌中篩選出11株對Cd具有高耐受性的乳酸桿菌(MIC≥4.0 g/L)。Matyar等[27]以菌株能耐受Cd的MIC超過100 mg/L則認為其對Cd有耐受性。不同的菌株對Cd的耐受性相差較大，Zhai等[28]篩選的高耐受植物乳桿菌CCFM8610耐受超過1 000 mg/L的Cd，而低耐受性的植物乳桿菌CCFM191僅耐受10 mg/L的Cd。本研究以能耐受100 mg/L的Cd為篩選標準，從雞腸道中分離獲得耐Cd乳酸菌5株，其中3株菌最高可耐受1 000 mg/L的Cd。

3.2 耐Cd乳酸菌對Cd的吸附能力

耐Cd乳酸菌對Cd的吸附能力除與其自身結(jié)構(gòu)相關(guān)外還與吸附條件包括菌量、濃度、溫度、時間、pH等相關(guān)[29]，而菌體吸附Cd受pH影響較大[30]。Ameen等[31]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MF042018在pH為2.0，溫度為22 ℃時，1 h內(nèi)對Cd2+和鉛離子(Pb2+)的吸附達到最大容量。而Topco等[32]報道屎腸球菌(Enterococcusfaecium)在pH低于3時對Cd和鉛(Pb)的移除率最低，但隨著pH的升高，其對Cd和Pb的移除率直線增加。本研究的結(jié)果表明，5株耐Cd乳酸菌的Cd吸附率隨Cd溶液的pH條件的不同而變化，pH越低，耐Cd乳酸菌對Cd的吸附率越低。在pH中性和接近中性時對Cd的吸附率可達30%以上，均顯著高于pH為2.6時的Cd吸附率。上述研究結(jié)果表明，不同的微生物對Cd等重金屬的吸附有不同的最適pH，確定其適宜的pH有助于微生物發(fā)揮出最佳的吸附能力。

3.3 耐Cd乳酸菌的益生性

對耐Cd乳酸菌的篩選除考察其對Cd的耐受性和吸附性外，其自身的益生性也是考慮的重要因素。對膽鹽的抗性是益生菌的一個重要判斷標準，它確保菌株在小腸內(nèi)的定植和代謝活性[33]。Ojekunle等[34]篩選到耐Cd的魏斯菌屬(Weissellacibaria)WD2菌株對0.3%和1.0%的膽鹽有高耐受性。本研究中篩選的乳酸菌株可耐受0.3%的膽鹽，且可抑制金黃色葡萄球菌的生長，在發(fā)揮其吸附Cd的特性同時可發(fā)揮其益生菌的作用。

4 結(jié) 論

本試驗從雞腸道中分離篩選鑒定出5株耐Cd乳酸菌，包括1株約氏乳桿菌和4株卷曲乳桿菌。在pH接近中性的條件下，上述乳酸菌株對Cd的吸附率均可達30%。