卓儒浩 吳嘉敏 許夢慧 陶生祥 孟 闖 鐘 翔,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210095；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009)

豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起60日齡內(nèi)仔豬急性腸道傳染病的主要病原體[1-2]。PRV感染仔豬可損壞腸道黏膜結(jié)構(gòu)與功能，攪亂正常新陳代謝，引起脫水性腹瀉，抑制仔豬生長，甚至導(dǎo)致高達(dá)100%的死亡率，嚴(yán)重威脅仔豬健康和豬群生產(chǎn)力[3-5]。近年來，PRV感染呈現(xiàn)全球流行趨勢，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給全球畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，疫苗接種是防控PRV感染的唯一方法，但病毒的變異重組可降低疫苗的保護(hù)率[6]。因此，在研發(fā)更高效疫苗的基礎(chǔ)上，迫切需要尋求并開發(fā)新型抗病毒藥物抑制PRV感染，從而保障仔豬健康，促進(jìn)畜牧業(yè)平穩(wěn)發(fā)展。

姜黃素是從天然植物姜黃的根莖中提取的一種多酚類化合物，已被大量研究證明具有廣泛且有益的生物學(xué)特性，包括抗氧化、消炎、抗腫瘤、抑菌以及抗病毒等作用[7-8]。近年來，姜黃素被證實(shí)在人類免疫缺陷病毒(HIV)[9]、甲型流感病毒(IAV)[10]、丙型肝炎病毒(HCV)[11]、寨卡病毒(ZIKV)[12]和基孔肯雅病毒(CHIKV)[12]等多種病毒的感染過程中發(fā)揮了重要的抗病毒作用。在機(jī)制上，姜黃素可通過直接靶向病毒關(guān)鍵成分或影響細(xì)胞代謝通路來抑制病毒的吸附或復(fù)制。然而，目前有關(guān)姜黃素對PRV感染的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究探討PRV對豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的影響、姜黃素可否緩解PRV感染對細(xì)胞的不利影響以及姜黃素劑量與作用效果的關(guān)系等問題，從而揭示姜黃素在IPEC-J2細(xì)胞中對PRV的抗病毒作用，為今后研發(fā)防控PRV感染的相關(guān)藥物或飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

G9P7型PRV毒株NJ2012由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室李彬研究員惠贈(zèng)；IPEC-J2細(xì)胞和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)均由本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔谩?/p>

1.2 病毒感染與擴(kuò)繁試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，長滿至單層貼壁。取適量溶于DMEM/F12中的PRV[感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.1]，加入胰蛋白酶并使其終濃度為10 μg/mL，37 ℃金屬浴30 min激活PRV。用1×PBS潤洗細(xì)胞2次，棄凈殘液，加入病毒-胰蛋白酶混合液，置于37 ℃和5% CO2條件下吸附1 h，期間每隔20 min搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，使病毒均勻吸附。吸附結(jié)束后，再用1×PBS潤洗細(xì)胞1次，棄凈殘液，加入含1 μg/mL胰蛋白酶的適量DMEM/F12作為細(xì)胞維持液，置于37 ℃和5% CO2條件下維持細(xì)胞至出現(xiàn)85%以上細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。將病變細(xì)胞置于-80 ℃反復(fù)凍融3次，隨后5 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞沉淀，取上清液即為擴(kuò)繁后的病毒。測定并記錄擴(kuò)繁后的病毒滴度，置于-80 ℃保存。

1.3 病毒滴度測定

將提取的病毒溶于DMEM/F12中并連續(xù)作10倍梯度稀釋，從10-1稀釋至10-10。將稀釋后的病毒分別接種至96孔板的Vero細(xì)胞中，每一稀釋度接種1列8孔，每孔接種100 μL。設(shè)置2列未接種正常細(xì)胞作為陰性對照。接種病毒后24 h觀察CPE，按照Reed-Muench兩氏法[13]計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)作為病毒滴度。計(jì)算方式如下：

病毒滴度(-lg TCID50/mL)=(高于50%的
病變率-50%)/(高于50%的病變率-低于50%的
病變率)×稀釋度對數(shù)差+高于50%病變率的
稀釋度對數(shù)。

1.4 病毒感染對細(xì)胞存活率的影響

按照CCK-8試劑說明書進(jìn)行操作，方法如下：在96孔板中接種1×104個(gè)IPEC-J2細(xì)胞，置于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置未感染組和感染組，每組4個(gè)重復(fù)，分別設(shè)置空白孔和對照孔。取PRV(MOI=0.1)感染各組細(xì)胞，感染后用細(xì)胞維持液于37 ℃和5% CO2條件下分別維持細(xì)胞6、12和24 h。向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃和5% CO2條件下孵育1～4 h，然后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。

1.5 病毒感染對細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

在6孔板中接種1×106個(gè)IPEC-J2細(xì)胞，置于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24～48 h。分別設(shè)置未感染組和感染組，每組3個(gè)重復(fù)。取PRV(MOI=0.1)感染細(xì)胞，感染后用細(xì)胞維持液于37 ℃和5% CO2條件下維持細(xì)胞24 h。按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，方法如下：按照1∶1 000的比例用DMEM/F12稀釋熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，使其終濃度為10 μmol/L。收集細(xì)胞后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃孵育25 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使DCFH-DA和細(xì)胞充分接觸。用1×PBS潤洗細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通過流式細(xì)胞儀檢測裝載DCFH-DA后的各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。

1.6 姜黃素對細(xì)胞活力檢測

將姜黃素溶于DMSO中配制成100 mmol/L的貯存液，置于-20 ℃保存。按照CCK-8試劑說明書進(jìn)行操作，方法如下：在96孔板中接種1×104個(gè)IPEC-J2細(xì)胞，置于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將姜黃素用DMSO稀釋至5、10、20、40、60、80、100 μmol/L。將不同濃度的姜黃素加入到96孔板中，每種濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)，分別設(shè)置含DMSO的對照孔和空白孔。將96孔板置于37 ℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃和5% CO2條件下孵育1～4 h，然后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。

1.7 姜黃素對PRV復(fù)制的影響

為了探究姜黃素對PRV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響，分別設(shè)置低劑量(5 μmol/L)姜黃素組和高劑量(20 μmol/L)姜黃素組，每組均先添加不同濃度姜黃素預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞24 h，隨后PRV(MOI=0.1)與不同濃度姜黃素共同加入細(xì)胞中，感染后再用含不同濃度姜黃素的細(xì)胞維持液置于37 ℃和5% CO2條件下維持24 h，每組3個(gè)重復(fù)。設(shè)置只接種PRV的陽性對照。分別收取細(xì)胞和病毒上清液，檢測各組病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

1.8 不同時(shí)間段加入姜黃素對PRV感染的影響

為了進(jìn)一步探究姜黃素抑制病毒復(fù)制的具體過程，分別在PRV(MOI=0.1)感染的不同時(shí)間段添加姜黃素(20 μmol/L)處理IPEC-J2細(xì)胞。分組設(shè)置如下：1)感染前階段(P1)：在PRV感染前添加姜黃素預(yù)處理細(xì)胞24 h，1×PBS潤洗后接種PRV，置于37 ℃和5% CO2條件下維持24 h；2)病毒吸附階段(P2)：姜黃素和PRV共同加入細(xì)胞中，吸附1 h，1×PBS潤洗后置于37 ℃和5% CO2條件下維持24 h；3)感染后階段(P3)：PRV感染細(xì)胞后，用含姜黃素的細(xì)胞維持液在37 ℃和5% CO2條件下維持24 h；4)感染前和后2階段(P4)：在PRV感染前添加姜黃素預(yù)處理細(xì)胞24 h，1×PBS潤洗后接種PRV，再用含姜黃素的細(xì)胞維持液在37 ℃和5% CO2條件下維持24 h；5)全階段(P5)：感染前、病毒吸附和感染后階段，細(xì)胞培養(yǎng)液和維持液中均含有姜黃素，置于37 ℃和5% CO2條件下維持24 h。每組3個(gè)重復(fù)。設(shè)置只接種PRV的陽性對照。觀察各組CPE，分別收取細(xì)胞和病毒上清液，檢測各組病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

1.9 姜黃素直接對PRV感染性的影響

將姜黃素(20 μmol/L)與溶于DMEM/F12中的PRV(MOI=0.1)直接混合，37 ℃孵育30 min，然后將混合物接種至IPEC-J2細(xì)胞中。設(shè)置不添加姜黃素的陽性對照。接種后置于37 ℃和5% CO2條件下維持24 h。觀察CPE，分別測定病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

1.10 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)量

采用熒光定量PCR方法檢測病毒基因組拷貝數(shù)和IPEC-J2細(xì)胞免疫相關(guān)基因的表達(dá)量。按照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，測定濃度后取1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入ddH2O對cDNA進(jìn)行5倍稀釋，配制PCR體系。PCR體系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，50×ROX Reference Dye I 0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 2.4 μL，共10 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因?qū)颖具M(jìn)行歸一化處理，每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。本試驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

續(xù)表1基因名稱Gene names引物序列Primer sequences (5'—3')GenBank登錄號(hào)GenBank accession number線粒體抗病毒信號(hào)蛋白MAVSF:CTACTGCCTCCTCCTCCACTR:CAAATGCTGAGTTGGTGGGCMK302496.1髓樣分化因子88MYD88F:GATGGTAGCGGTTGTCTCTGATR:GATGCTGGGGAACTCTTTCTTCMK302494.1Toll樣受體適配器分子TRIFF:TGACGTCACAGACCAGAAGCR:GGGGAGCTGAAGAAAGGGTCMK302497.1干擾素誘導(dǎo)蛋白44樣蛋白抗體 IFI44LF:GGCCCTATGCAGACTTGGTTR:CTATGGCCTGGCGAGTCAAAXM_021096421.1干擾素-βIFN-βF:CTTCGAGGTCCCTGAGGAGAR:TGACGGTTTCATTCCAGCCANM_001003923.1

1.11 數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 20軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素ANOVA分析和Student-t檢驗(yàn)，分析各組數(shù)據(jù)之間是否具有顯著性差異。利用GraphPad(Prism 8.0)軟件對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行圖表繪制。其中，P<0.05表示差異顯著并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P<0.01表示差異極顯著并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV感染破壞細(xì)胞形態(tài)并抑制細(xì)胞活力

在PRV感染IPEC-J2細(xì)胞后，分別于感染后6、12和24 h利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察CPE。結(jié)果顯示，與對照組未感染細(xì)胞相比，PRV感染后6 h細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮變圓，12 h出現(xiàn)聚集拉網(wǎng)并部分脫落死亡，24 h完全病變，表現(xiàn)為細(xì)胞膜融合，細(xì)胞核固縮并空泡化，同時(shí)細(xì)胞大量脫落死亡，成碎片狀漂浮于維持液中，結(jié)果如圖1所示。收取病變細(xì)胞檢測感染后病毒基因組復(fù)制水平，發(fā)現(xiàn)PRVNSP5基因拷貝數(shù)顯著升高(P<0.05)，并具有時(shí)間依賴性，結(jié)果如圖2所示。通過CCK-8法對PRV感染后不同時(shí)間的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率在病毒感染后顯著降低(P<0.05)，并具有時(shí)間依賴性，結(jié)果如圖3所示。

2.2 PRV感染顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量

在PRV感染IPEC-J2細(xì)胞后24 h收取病變細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果顯示，與正常未感染細(xì)胞相比，PRV感染后細(xì)胞內(nèi)ROS含量極顯著升高(P<0.01)，結(jié)果如圖4所示。

A：正常未感染；B：感染后6 h；C：感染后12 h；D：感染后24 h。

2.3 姜黃素對細(xì)胞活力的檢測

將不同濃度的姜黃素處理IPEC-J2細(xì)胞24 h，通過CCK-8法檢測不同濃度的姜黃素對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，0～20 μmol/L的姜黃素對IPEC-J2細(xì)胞的增殖沒有明顯影響，結(jié)果如圖5所示。因此，本研究選擇5和20 μmol/L作為工作濃度進(jìn)行后續(xù)姜黃素相關(guān)試驗(yàn)。

2.4 姜黃素抑制PRV的復(fù)制與增殖

將不同濃度的姜黃素與PRV共同加入IPEC-J2細(xì)胞中，均于感染后24 h檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。結(jié)果表明，姜黃素顯著抑制了PRV基因組復(fù)制，顯著降低了病毒滴度(P<0.05)，抑制了病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖，并且抑制作用在20 μmol/L時(shí)最顯著，結(jié)果如圖6和圖7所示。

ND表示未檢出；數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3、圖6、圖7、圖9、圖10、圖13同。

2.5 姜黃素在PRV吸附階段發(fā)揮抑制作用

為了探究姜黃素在PRV感染過程中具體發(fā)揮作用的階段，本研究設(shè)置了5個(gè)不同階段的處理方式，均于感染后24 h觀察CPE并檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。結(jié)果顯示，在感染前階段添加姜黃素預(yù)處理和病毒吸附階段添加姜黃素均能在一定程度上抑制PRV感染，維持細(xì)胞形態(tài)，并顯著降低病毒滴度，尤其是在吸附階段抑制作用最為顯著，而在感染后病毒復(fù)制階段添加姜黃素對PRV復(fù)制無明顯影響，結(jié)果如圖8、圖9和圖10所示。

圖3 PRV感染后IPEC-J2細(xì)胞活力

NC：正常未感染；PRV：感染后24 h；**表示差異極顯著(P<0.01)。圖12同。

圖5 姜黃素對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響

PC：陽性對照。

圖7 姜黃素抑制PRV增殖呈劑量依賴性

2.6 姜黃素對PRV的直接影響

為了進(jìn)一步明確姜黃素對PRV感染性的影響，將姜黃素與PRV在37 ℃條件下孵育30 min，然后感染IPEC-J2細(xì)胞。結(jié)果顯示，與僅接種PRV的陽性對照相比，姜黃素處理后PRV的復(fù)制沒有受到明顯影響，但病毒滴度顯著下降(P<0.05)，提示姜黃素在一定程度上能直接影響病毒的感染性，結(jié)果如圖11和圖12所示。

PC：陽性對照；P1：感染前階段；P2：病毒吸附階段；P3：感染后階段；P4：感染前和后2階段；P5：全階段。圖9和圖10同。

圖9 不同階段添加姜黃素對PRV基因組復(fù)制的影響

圖10 不同階段添加姜黃素對PRV滴度的影響

PC：陽性對照；CUR：姜黃素處理。圖12同。

2.7 姜黃素影響感染PRV后細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)因子的表達(dá)

本研究通過熒光定量PCR檢測了添加姜黃素對感染PRV后IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)因子表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與正常未感染細(xì)胞相比，感染PRV后細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)、干擾素誘導(dǎo)因子干擾素誘導(dǎo)蛋白44樣蛋白抗體(IFI44L)和干擾素-β(IFN-β)的mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，但細(xì)胞內(nèi)干擾素調(diào)節(jié)因子Toll樣受體適配器分子1(TRIF)、抗病毒因子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)和炎癥因子髓樣分化因子88(MYD88)的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與此相反的是，添加姜黃素后這些因PRV感染導(dǎo)致顯著上調(diào)或下調(diào)的免疫相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平得到了顯著恢復(fù)，結(jié)果如圖13所示。該研究結(jié)果表明，PRV感染后，宿主通過識(shí)別病毒基因組激活干擾素信號(hào)通路抵抗病毒入侵，而姜黃素在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮了抗病毒作用，緩解了因病毒感染導(dǎo)致的宿主免疫與炎癥相關(guān)因子表達(dá)的失調(diào)。

圖12 姜黃素直接影響PRV的感染性

3 討 論

3.1 PRV感染對宿主細(xì)胞的影響

PRV感染導(dǎo)致的仔豬病毒性腹瀉已成為阻礙全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。研究表明，空腸和回腸的上皮細(xì)胞胞漿是PRV的主要感染和復(fù)制場所，可導(dǎo)致細(xì)胞變性死亡、腸絨毛萎縮和變短、阻礙水分吸收及電解質(zhì)功能障礙等病理變化，從而造成仔豬脫水性死亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)PRV感染后顯著破壞IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。同時(shí)，隨著感染后時(shí)間的增加，PRVNSP5基因組拷貝數(shù)顯著升高，證實(shí)病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。此外，病毒感染誘導(dǎo)的宿主氧化應(yīng)激已在HIV[15]、IAV[16]、乙型肝炎病毒(HBV)[17]、HCV[18]和呼吸道合胞體病毒(RSV)[19]等的研究中被報(bào)道。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)PRV感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，而過量的ROS已被證實(shí)是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的誘因之一[20]，因此我們推測PRV感染通過上調(diào)ROS含量誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞的裂解死亡，提示ROS可能參與病毒復(fù)制與細(xì)胞反應(yīng)，從而促進(jìn)病毒的感染。

NC：正常未感染；PC：陽性對照；CUR：姜黃素處理。

3.2 姜黃素對PRV感染的影響

既往研究表明，源自植物的天然化合物可成為新型抗病毒藥物研發(fā)的重要來源[8]。值得注意的是，作為源自姜科植物姜黃的一種天然化合物，姜黃素近年來被廣泛報(bào)道具有抵御不同病毒科的病毒感染的強(qiáng)大抗病毒作用。大量研究證實(shí)姜黃素能影響病毒整合酶、蛋白酶和反式轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白等多種病毒蛋白的功能，從而抑制HIV的復(fù)制[21-23]。Dutta等[24]研究指出姜黃素通過失調(diào)的泛素蛋白酶體系統(tǒng)和泛素化蛋白的積累抑制乙型腦炎病毒的復(fù)制。有趣的是，姜黃素被發(fā)現(xiàn)可通過抑制囊膜病毒與細(xì)胞表面的吸附從而抑制ZIKV、HCV和CHIKV的復(fù)制[11-12]。本研究結(jié)果表明，姜黃素能夠抑制PRV在IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與增殖，并具有劑量依賴性。通過分析姜黃素對病毒生命周期的影響，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素主要在PRV吸附和穿透細(xì)胞階段發(fā)揮抑制作用，但并未影響感染后期病毒的復(fù)制，這與最近報(bào)道的姜黃素對豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)[25]和馬立克氏病病毒(MDV)[26]的抑制作用類似，提示姜黃素或許可以作為一種預(yù)防初始感染的有效手段，但對控制已發(fā)生的感染無效。此外，Du等[27]研究報(bào)道姜黃素與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)直接孵育后可防止Marc-145細(xì)胞被感染，而本研究結(jié)果表明姜黃素與PRV直接孵育也具有一定的抗感染效果。

3.3 姜黃素對感染后細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)因子的影響

越來越多的證據(jù)顯示姜黃素通過調(diào)控宿主的抗病毒信號(hào)通路及免疫相關(guān)因子發(fā)揮抗病毒作用。馮春等[26]研究顯示姜黃素顯著影響了感染MDV后細(xì)胞內(nèi)IFN-β、ISG12-2、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等免疫和炎癥因子的mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果表明，PRV感染后刺激了細(xì)胞內(nèi)MDA5、IFI44L和IFN-β的mRNA高度表達(dá)，同時(shí)抑制了部分抗病毒和炎癥因子的mRNA表達(dá)，但姜黃素能顯著緩解上述因子表達(dá)的失調(diào)，提示姜黃素可能通過影響MDA5-IFN信號(hào)通路的激活在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮了特定的抗病毒作用，在一定程度上抵御了病毒對細(xì)胞的侵襲。然而，鑒于PRV的感染及傳播機(jī)制尚不明晰，因此姜黃素在病毒與宿主細(xì)胞的互作中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還有待今后進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，PRV感染導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，誘導(dǎo)細(xì)胞ROS含量升高并造成細(xì)胞大量死亡，首次證實(shí)姜黃素具有顯著抑制PRV感染豬腸上皮細(xì)胞的抗病毒作用，顯著緩解了PRV感染對豬腸上皮細(xì)胞活力和免疫相關(guān)因子的不利影響，有望開發(fā)成新型抗病毒藥物或新型飼料添加劑，為我國養(yǎng)豬生產(chǎn)提供重要的保障。