張振威 周 倩 鄭 芮 王永輝 朱明霞 王長法

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，聊城252000)

德州驢是中國大型驢品種，身材高大，結(jié)構(gòu)緊湊，肌肉發(fā)達，皮重性能好，具有耐粗飼、適應(yīng)性強和抗病力高的特點[1]。驢具有特殊且發(fā)達的盲結(jié)腸結(jié)構(gòu)，棲息著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，能夠發(fā)酵降解飼料纖維生成揮發(fā)酸脂肪酸(VFA)而被機體吸收利用[2]。有研究表明，馬屬動物的盲結(jié)腸微生物能夠供給宿主機體60%～70%的能量[3]。驢機體本身不能夠降解飼料纖維，而是依靠驢盲腸和結(jié)腸微生物分泌的一系列纖維素酶與半纖維素酶來消化利用飼料纖維[4]。

驢養(yǎng)殖業(yè)中使用較多的纖維粗飼料主要包括玉米秸稈、小麥秸稈、稻秸、花生秧和小麥糠等低質(zhì)高纖維含量的農(nóng)作物秸稈及副產(chǎn)品。上述粗飼料的細胞壁則主要由纖維素(40%～50%)、半纖維素(30%～35%)、木質(zhì)素和果膠等構(gòu)成[5]。驢盲結(jié)腸微生物對于飼料細胞壁的降解需要多種纖維素酶和半纖維素酶的協(xié)同參與[6-7]。其中，內(nèi)切(羧甲基)纖維素酶、外切(微晶)纖維素酶及β-葡萄糖苷酶是驢盲結(jié)腸中水解飼料細胞壁纖維素主鏈的降解酶[8]，木聚糖酶(xylanase, XYL)則是降解飼料細胞壁半纖維素結(jié)構(gòu)的主要水解酶。羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase, CMAase)是一類可以隨機切斷纖維素多糖鏈非結(jié)晶區(qū)(β-1，4糖苷鍵)的內(nèi)切纖維素酶[9]。微晶纖維素酶(avicelase, AVI)作用于纖維素多糖鏈的非還原末端，釋放纖維二糖[9]。β-葡萄糖苷酶能夠切開纖維二糖的β-1，4糖苷鍵，進而從纖維二糖和短的纖維寡糖鏈中釋放葡萄糖[9]。XYL負責(zé)將木聚糖分解為木二糖和低聚木糖，反映盲結(jié)腸微生物降解飼料半纖維素的能力[9]。此外，驢盲結(jié)腸微生物可能與反芻動物瘤胃微生物相似，還能夠分泌木質(zhì)素降解酯酶[阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase, FAE)、乙酰脂酶(acetyl esterase, AE)和對香豆酸酯酶]來催化水解飼料細胞壁的半纖維素與木質(zhì)素分子間的酯鍵連接，消除阻礙纖維素和半纖維素分子降解的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)[10-11]。

目前，相關(guān)驢盲結(jié)腸微生物的纖維降解酶與半纖維素酶活性的研究報道很少。梁婷玉[12]測定了關(guān)中驢盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物的XYL活性達0.86～2.50 U/mL。劉利林[9]則測定了新疆驢盲腸液的CMAase和XYL活性，分別為0.21和0.46 U/mL。此外，有關(guān)驢盲結(jié)腸食糜液FAE、AE活性的研究更未見報道。本研究擬采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液，比較分析其纖維素酶、半纖維素酶以及木質(zhì)素降解酯酶(FAE、AE)活性及VFA含量，以期為深入開展驢內(nèi)源性纖維素酶學(xué)特性及其降解飼料細胞壁的作用機理奠定理論基礎(chǔ)，為進一步提高驢機體對纖維粗飼料的能量利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取24月齡左右、體重[(242±20) kg]相近的健康德州驢9頭，對比分析德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性及VFA的生成。

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗飼糧

試驗德州驢均散欄飼養(yǎng)，每天飼喂2次，飼喂時間分別為07:00和18:00，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)周期60 d，德州驢自由采食、飲水與運動。試驗期間驢只體重與采食量均無顯著差異(P>0.05)。

1.3 樣品采集

待9頭德州驢屠宰后，立即無菌操作采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜，使用4層滅菌紗布過濾后得到液相樣品，分裝至滅菌的10 mL離心管，置于-20 ℃保存。

1.4 pH及纖維素酶活性的測定[13]

pH：采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液后，使用pH計((Model BPP-7800，貝爾分析儀器有限公司)迅速測定其pH，并記錄。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

FAE活性：以阿魏酸甲酯為底物，使用分光光度計在340 nm檢測阿魏酸甲酯和阿魏酸的吸光值，根據(jù)二者消光系數(shù)差異計算FAE活性。

AE活性：以4-硝基苯乙酯為底物，使用分光光度計在415 nm檢測反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基酚的吸光值，根據(jù)4-硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，計算AE活性。

CMAase活性：以羧甲基纖維素為底物，使用分光光度計在540 nm檢測反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖的吸光值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，計算CMAase活性。

AVI活性：以微晶纖維素溶液為底物，使用分光光度計在540 nm檢測反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖的吸光值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算AVI活性。

XYL活性：以木聚糖為底物，使用分光光度計在540 nm檢測反應(yīng)產(chǎn)物木糖的吸光值，根據(jù)木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，計算XYL活性。

圖1 4-硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 VFA含量測定

取1 mL驢盲結(jié)腸食糜液，加入300 μL偏磷酸(25%)，充分混合后，置于10 000×g離心10 min。取上清液使用氣相色譜儀測定驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量，計算乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸摩爾比例。

1.6 統(tǒng)計分析

利用SAS 9.4的一般線性模型(GLM)程序，通過方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。使用最小二乘法Lsmeans計算和校正標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(SEM)。所有測定指標(biāo)的平均值之間采用Duncan氏法進行多重比較分析。P<0.05代表差異顯著；0.05

2 結(jié) 果

2.1 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

表2可知，驢背結(jié)腸食糜液中CMCase、AVI、Xylase和AE的活性均顯著高于驢盲腸和腹結(jié)腸(P<0.05)，但驢盲腸和腹結(jié)腸食糜液中纖維素酶活之間無顯著差異(P>0.05)。此外，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中FAE活性無顯著差異(P>0.05)。

2.2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

由表3可知，德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中pH和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量均無顯著差異(P>0.05)。驢盲結(jié)腸的VFA發(fā)酵模式存在差異：乙酸摩爾比例在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加(P<0.05)，而丙酸和丁酸摩爾比例在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著降低(P<0.05)，乙酸/丙酸在驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加(P<0.05)。此外，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中支鏈VFA(包括異丁酸和異戊酸)摩爾比例依次顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

3.1 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

驢是典型的單胃食草動物，屬后腸發(fā)酵類型。后消化道主要包括盲腸和結(jié)腸，棲息著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，類似于反芻動物瘤胃，對飼料纖維的降解利用具有重要作用。驢對飼料纖維具有較高的降解利用效率，驢對苜蓿干草和燕麥干草的中性洗滌纖維消化率高達2%～10%[14]。而且驢對低質(zhì)纖維粗飼料的消化率甚至與Bedouin黑山羊相當(dāng)。這歸根結(jié)底是由于驢胃腸道中較高的微生物活性，其中，驢盲結(jié)腸微生物分泌的纖維素酶可能在飼料纖維的降解消化過程中起到關(guān)鍵作用。Glinsky等[3]指出，馬屬動物后腸道微生物能夠降解羊草纖維素和半纖維素而釋放可溶性糖。驢機體本身并不能直接降解飼料纖維，而是依靠盲結(jié)腸微生物分泌的一系列纖維素酶來發(fā)揮作用。Miyaji等[15]研究發(fā)現(xiàn)，盲結(jié)腸對于干草飼料中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的消化率占全消化道飼料纖維消化率的90%，盲結(jié)腸微生物具有較高的CMAase和XYL活性。

表2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

表3 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

本研究明確了驢盲結(jié)腸微生物能夠分泌一系列的纖維素酶。其中，CMAase和AVI是驢盲結(jié)腸中水解飼料細胞壁纖維素主鏈的降解酶[8]，反映微生物降解飼料纖維的能力。XYL則是降解飼料細胞壁半纖維素結(jié)構(gòu)的主要水解酶，主要反映盲結(jié)腸微生物降解飼料半纖維素的能力[16]。FAE與AE協(xié)同作用能夠切斷飼料細胞壁內(nèi)的半纖維素與木質(zhì)素分子間的酯鍵連接，打破纖維分子間的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，促進飼料纖維與酶之間的結(jié)合，增加飼料纖維的降解利用[10-11]。驢結(jié)腸食糜液中CMAase、AVI、XYL和AE的活性均高于驢盲腸，表明驢的結(jié)腸可能在飼料纖維的降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這可能是由于飼料物質(zhì)隨著在驢胃腸道中的后移，容易降解的可溶性淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)在小腸降解，而飼料纖維的含量在盲腸和結(jié)腸中不斷增加，促進了纖維降解菌的生長繁殖，進而使得驢結(jié)腸成為飼料纖維的主要降解場所。

目前有關(guān)驢盲結(jié)腸食糜的纖維酶活性報道資料有限。梁玉婷[12]測定了關(guān)中驢盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物的XYL活性高達0.86～2.50 U/mL，而CMAase和AVI的活性較低[12]。劉利林[9]測定了新疆驢盲腸液的CMAase和XYL活性分別為0.21和0.46 U/mL。本研究中，驢的盲結(jié)腸食糜液中CMAase活性達0.12～0.42 U/mL；AVI活性達0.13～0.23 U/mL；XYL活性達2.27～6.82 U/mL，均與上述研究報道相似。此外，本研究測定了驢盲結(jié)腸食糜液中木質(zhì)素降解酯酶活性。其中，F(xiàn)AE活性高達4.2～4.8 mU/mL，高于荷斯坦公牛瘤胃液的FAE活性(3.7 mU/mL)[17]。

3.2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

飼料纖維經(jīng)驢盲結(jié)腸微生物的纖維素酶水解后可產(chǎn)生VFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和支鏈VFA。本研究中，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中TVFA含量達96～110 mmol/L。Glinsky等[3]研究表明，馬屬動物機體盲腸代謝生成的VFA能夠為機體供應(yīng)30%的能量。此外，結(jié)腸微生物代謝生成的VFA也可以為機體提供大量能量[18]。

乙酸摩爾比例在驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加，與之相對應(yīng)，驢背結(jié)腸食糜液中CMCase、AVI、Xlyase和AE活性均高于盲結(jié)和腹結(jié)腸。這表明驢背結(jié)腸與盲腸相比具有更高的纖維降解活性，能夠降解飼料纖維生成更多的乙酸。與之相反，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中丙酸摩爾比例依次顯著降低，說明驢盲腸可能會降解相對較多的精飼料而生成丙酸。此外，BCVFA是纖維分解菌的生長因子，在低質(zhì)飼糧中添加支鏈VFA能夠增加纖維分解菌的數(shù)量，提高微生物對飼料纖維的降解能力[19]。驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中支鏈VFA(包括異丁酸、異戊酸和戊酸)逐漸顯著增加，這進一步表明，德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸微生物的纖維降解活性逐漸升高。驢結(jié)腸食糜液與盲腸相比，具有更高的纖維降解活性，這可能是由于盲腸和結(jié)腸食糜液中微生物群落組成不同造成的。梁玉婷[12]測定了驢盲腸和結(jié)腸的微生物群落組成，結(jié)果指出，驢盲腸液的厚壁菌門占比達39.7%，而結(jié)腸食糜液中厚壁菌門占比高達48.7%。厚壁菌門主要負責(zé)降解飼料纖維物質(zhì)，驢結(jié)腸食糜液比盲腸具有更高含量的厚壁菌門進一步印證了我們的試驗結(jié)果。

4 結(jié) 論

德州驢背結(jié)腸食糜液中CMAase、AVI、XYL和AE活性均高于腹結(jié)腸和盲腸。與之相對應(yīng)，乙酸和支鏈VAF的摩爾比例在德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中逐漸顯著增加，丙酸摩爾比例則依次在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中逐漸降低。此外，本研究明確了德州驢盲結(jié)腸具有較高的FAE和AE活性。