曾 鈺 劉 垚* 張康林 彭忠利** 肖偉偉 于星宇 吳華卓

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，成都610041；2.四川省甘孜藏族自治州畜牧科學(xué)研究所，康定626000；3.成都美溢德生物技術(shù)有限公司，成都610000)

我國肉牛業(yè)正逐步從傳統(tǒng)的養(yǎng)殖方式向現(xiàn)代化畜牧業(yè)轉(zhuǎn)變，成為僅次于美國、巴西的世界第三大牛肉生產(chǎn)國，但頭均產(chǎn)肉量遠低于美國等發(fā)達國家，“小群體、大規(guī)模”仍是我國肉牛養(yǎng)殖的主要模式，養(yǎng)殖成本高、產(chǎn)品質(zhì)量差等生產(chǎn)實際問題較為突出。同時，隨著我國飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展，蛋白質(zhì)飼料資源的匱乏、成本較高已逐漸成為制約我國飼料工業(yè)發(fā)展的主要因素[1-2]，然而豆粕、魚粉等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料主要依賴進口。因此，探尋安全、有效的新型飼料添加劑，提高飼料原料的利用效率，促進飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用就顯得尤為重要；不僅有效地緩解蛋白質(zhì)飼料資源的匱乏，還有利于減少氮的排放和保護生態(tài)環(huán)境。小肽一般是指含有2～3氨基酸，能以二肽、三肽的形式直接被動物機體吸收的小分子肽[3]。研究表明，飼糧中蛋白質(zhì)進入瘤胃后，在瘤胃微生物和多種酶的協(xié)同作用下，水解為小肽、多肽或游離氨基酸等小分子物質(zhì)，一部分會被瘤胃微生物攝取用于微生物蛋白的合成，一部分會被瘤胃上皮直接吸收，剩下部分可直接進入后腸道被機體吸收利用[4]。Volden等[5]研究發(fā)現(xiàn)，小肽過瘤胃率高于游離氨基酸和長鏈肽，與游離氨基酸相比，小肽具有轉(zhuǎn)運快、耗能低、不易飽和等特點[6]。張智安等[7]在育肥湖羊飼糧中添加蜜蜂肽可增加瘤胃微生物菌群豐富度和多樣性，增加降解纖維菌屬(瘤胃球菌屬、琥珀酸菌屬)的豐度。研究表明，飼糧中添加小肽能促進瘤胃微生物的生長，改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境，提高飼糧的消化率，增強機體免疫力，更好地發(fā)揮動物的生產(chǎn)潛力[8-12]。目前，小肽在改善動物生產(chǎn)性能中的應(yīng)用已經(jīng)趨于成熟，主要集中在玉米-豆粕型飼糧中，在發(fā)酵型飼糧中添加小肽的研究還未見報道。鑒于此，本試驗在發(fā)酵雜粕型飼糧中添加不同水平的小肽，對肉牛生長性能、養(yǎng)分表觀消化率及血清生化指標進行研究，以期為小肽在發(fā)酵雜粕型肉牛飼糧中的合理利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2018年12月至2019年3月在四川省宜賓市長寧縣九牛肉牛養(yǎng)殖有限責任公司進行。試驗期牛舍溫度為7～20 ℃。

1.2 試驗材料

小肽以棉籽蛋白質(zhì)為原料經(jīng)液態(tài)酶解制得，主要成分及含量如下：酸溶蛋白(<3 000 ku)≥28.0%，水分≤8.0%，粗蛋白質(zhì)(CP)≥45.0%，粗灰分(Ash)≤15.0%，粗纖維(CF)≥7.0%，粗脂肪(EE)2.5%，游離棉酚≤400 mg/kg，黃曲霉毒素B1≤15 μg/kg。

發(fā)酵雜粕是以菜籽粕和棉籽粕按1∶1混合作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在溫度為(35±2) ℃，料水比1∶1的條件下，接種黑曲霉、米曲霉和枯草芽孢桿菌經(jīng)過4 d發(fā)酵制得。其主要成分及含量[實測值，干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)]如下：DM 94.53%、CP 49.60%、中性洗滌纖維(NDF)38.86%、酸性洗滌纖維(ADF)22.61%、Ash 8.42%、鈣(Ca)0.39%、總磷(TP)1.31%、黃曲霉毒素B13.15 μg/kg、玉米赤霉烯酮40.65 μg/kg、游離棉酚255.17 mg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇未檢出。

1.3 試驗設(shè)計

試驗選取28頭體重[(481.43±36.36) kg]相近、健康狀況良好的西門塔爾雜交肉牛(西門塔爾牛×本地黃牛)，采用單因素隨機試驗設(shè)計，將試驗牛分為4組，每組7個重復(fù)，每個重復(fù)1頭牛，對照組(Ⅰ組)飼喂發(fā)酵雜粕型飼糧，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組飼喂在發(fā)酵雜粕型飼糧中分別添加0.5%、1.0%、1.5%小肽的全混合日糧(TMR)。試驗共85 d，其中預(yù)試期25 d，正試期60 d。

1.4 試驗飼糧

試驗飼糧參考中國《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)[13]，體重500 kg，平均日增重(ADG)為1 000 g/d的營養(yǎng)需要量設(shè)計，由精料和粗料按50∶50混合配制成TMR，其組成及營養(yǎng)水平見表1。發(fā)酵酒糟購至四川新通達生物飼料科技有限公司，一次性備齊試驗所需量，統(tǒng)一存放備用。粗料為發(fā)酵酒糟和皇竹草?；手癫莠F(xiàn)割現(xiàn)用，飼喂前切斷為1～3 cm的長度。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items組別 GroupsⅠⅡⅢⅣ營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)干物質(zhì) DM62.4663.0763.2463.19總能 GE/(MJ/kg)17.1317.1717.2017.14粗蛋白質(zhì) CP13.9313.8413.8913.91中性洗滌纖維 NDF45.9546.9145.3947.43酸性洗滌纖維 ADF27.2025.6128.0825.54粗灰分 Ash8.438.698.388.43鈣 Ca0.950.940.940.97總磷 TP0.510.500.520.51

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗牛進場前，做好圈舍清潔和消毒等準備工作，進場后每頭牛采用分欄栓系飼養(yǎng)，統(tǒng)一驅(qū)蟲，每7 d消毒1次，由專人管理，保證牛舍清潔衛(wèi)生。每天按預(yù)估采食量提供TMR，分2次飼喂(08:30和15:30)，自由采食，自由飲水。

1.6 樣品采集及測定

1.6.1 生長性能

正式試驗前后對每頭牛進行空腹稱重，記錄初重和末重，用于計算ADG。試驗期間每2 d記錄1次采食量，根據(jù)飼糧投喂量和剩余量計算平均日采食量(ADFI)。然后根據(jù)ADG和ADFI計算料重比(F/G)。計算公式如下：

ADG=(末重-初重)/飼喂天數(shù)；
ADFI=每日投料量-每日剩料量；
F/G=ADFI/ADG。

1.6.2 養(yǎng)分表觀消化率

試驗結(jié)束前3天，每天采集糞便100 g，加20 mL 10%的硫酸固氮，3 d收糞結(jié)束后，將同一頭牛的糞便混合，隨機取150 g于-20 ℃保存待測。同時，每天采用四分法收集飼糧1 kg，將同一組3 d采集的飼糧混合均勻用于養(yǎng)分分析。采用鹽酸不溶灰分(AIA)作指示劑，測定飼糧養(yǎng)分表觀消化率。樣品中DM、CP、Ash、Ca和P含量的測定參照張麗英[14]的方法，NDF、ADF含量的測定參照Van Soest等[15]方法，有機物(OM)含量通過計算得出。AIA含量的測定參照GB/T 23742—2009[16]中灼燒和酸處理法，某養(yǎng)分表觀消化率的計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×
[1-(RAIA/MAIA)×(Mn/Rn)]。

式中：RAIA和MAIA分別表示飼糧和糞中AIA含量；Rn和Mn分別表示飼糧和糞中某養(yǎng)分含量。

1.6.3 血清生化指標

試驗第60天，每組選取5頭體重接近平均體重的試驗牛進行靜脈采血20 mL，置于采血管中，采血完成后立即進行離心(GENIUS 6K-C, 4 ℃, 2 245×g, 5 min)，取上清液分裝于2 mL小管中，-80 ℃保存待測。采用獸用全自動生化分析儀(BC-240VET)測定血清中的總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)含量及堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。球蛋白(GLB)含量根據(jù)TP和ALB含量計算得出。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過Excel 2016整理后，使用SPSS 24.0進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，隨后對小肽添加水平進行線性(linear)和二次函數(shù)(quadratic)的回歸分析。結(jié)果用平均值表示，各組的變異程度用平均值的標準誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛生長性能的影響

由表2可知，隨著小肽添加水平的增加，ADG先升高后降低，有二次曲線變化的趨勢(P=0.062)，Ⅲ組ADG有顯著高于Ⅳ組的趨勢(P=0.059)；F/G先降低后升高，呈二次曲線變化(P<0.05)，Ⅳ組的F/G顯著高于其余組(P<0.05)；以Ⅲ組的生長性能最優(yōu)。

表2 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛生長性能的影響

2.2 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3可知，隨著小肽添加水平的增加，OM表觀消化率先升高后降低，呈二次曲線變化(P<0.05)，其中Ⅲ組顯著高于對照組和Ⅳ組(P<0.05)；Ⅲ組CP表觀消化率顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，與對照組和Ⅱ組間顯著差異(P>0.05)；NDF表觀消化率有二次曲線變化的趨勢(P=0.087)。

表3 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛血清生化指標的影響

由表4可知，隨著小肽添加水平的增加，血清ALT、AST活性和UN含量呈二次曲線變化(P<0.05)，血清T-CHO和GLU含量有差異顯著的趨勢(P=0.096，P=0.055)。Ⅲ組血清ALT活性顯著低于其余組(P<0.05)，Ⅳ組血清AST活性顯著高于對照組、Ⅱ組和Ⅲ組(P<0.05)，且對照組和Ⅱ組顯著高于Ⅲ組(P<0.05)。

表4 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛血清生化指標的影響

3 討 論

3.1 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛生長性能的影響

目前，小肽不僅廣泛應(yīng)用于單胃動物中，在反芻動物中的應(yīng)用也取得了較為理想的效果，反芻動物飼糧中添加小肽對其生長性能和產(chǎn)奶量、乳成分均有一定的改善作用[9]。司燕玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在舍飼牦牛飼糧中添加0.75%小肽后較對照組可顯著增加干物質(zhì)采食量(6.51%)及ADG(10.74%)，降低F/G(5.39%)。宋增廷[18]研究發(fā)現(xiàn)，在肉羊飼糧中添加500和800 mg/kg的谷胱甘肽，ADG分別較對照組提高了14.6%和11.4%，F(xiàn)/G分別降低了11.0%和8.1%，還能改善羊肉的嫩度和系水力。劉麟等[19]發(fā)現(xiàn)，在生長豬飼糧中添加0.2%的小肽復(fù)合劑，可增加豬的采食量，提高ADG和飼料轉(zhuǎn)化效率，降低腹瀉率和F/G。本試驗中，在發(fā)酵雜粕型飼糧中添加小肽，肉牛的ADG先升高后降低，有差異顯著的趨勢，F(xiàn)/G顯著降低呈二次曲線變化，與上述研究結(jié)果相似。課題組前期研究表明，在牦牛飼糧中添加0.75%、1.50%、2.25%的小肽，能顯著提高牦牛的ADG，降低F/G，以2.25%的添加水平生長性能最優(yōu)[12]，與本試驗結(jié)果相似；本研究還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵雜粕型飼糧中添加1.5%的小肽，肉牛的ADG降低，F(xiàn)/G升高。涂瑞等[20]在體外研究中也得到相似的結(jié)論，既小肽添加水平超過2.25%時會出現(xiàn)負面效應(yīng)。推測可能是雜粕經(jīng)微生物發(fā)酵后產(chǎn)生一定量的小肽，在此基礎(chǔ)上添加1.5%的小肽會降低瘤胃微生物的生長速度，限制瘤胃微生物蛋白的合成，導(dǎo)致肉牛的生長性能降低。本課題組在瘤胃微生物區(qū)系研究分析中發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門的豐度隨小肽添加水平的升高先降低后升高，厚壁菌門的豐度先升高后降低，擬桿菌門主要降解非纖維物質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生丙酸，厚壁菌門主要降解纖維物質(zhì)產(chǎn)生乙酸，而乙酸與丙酸的產(chǎn)量和反芻動物的生長性能密切相關(guān)[21-22]，推測添加1.5%的小肽生長性能降低可能與此有關(guān)。

3.2 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

肽作為影響瘤胃微生物生長達到最大效率的關(guān)鍵因子，與微生物蛋白的合成、小腸內(nèi)氨基酸組成、微生物對粗飼料的降解及飼糧的消化率等密切相關(guān)[23]。小肽通過刺激瘤胃微生物的生長，加速對CP、淀粉、纖維物質(zhì)的降解，提高養(yǎng)分的消化率[12]。王文娟[4]研究黃牛瘤胃灌注大豆小肽的結(jié)果表明，大豆小肽能顯著提高DM、OM、NDF和氮的消化率，增加氮的沉積。本試驗中，隨著小肽添加水平的增加，OM和NDF的表觀消化率先升高后降低，與前人報道結(jié)果全一致。而本課題組前期通過瘤胃體外發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，在不同精粗比飼糧中添加小肽各養(yǎng)分降解率先升高后降低，瘤胃中肽含量存在適度范圍，過高會產(chǎn)生負面影響[22]，與本試驗結(jié)果相呼應(yīng)。有研究指出，高含量的肽會降低部分蛋白分解菌的數(shù)量，抑制蛋白質(zhì)的消化和氨的產(chǎn)生[24-25]，從而降低CP的消化率，DM和粗纖維的消化也會受到影響。本試驗中，添加1.0%小肽CP表觀消化率顯著提高，而添加水平為1.5%時出現(xiàn)顯著下降。推測可能與發(fā)酵雜粕中含有一定量的小肽有關(guān)，發(fā)酵雜粕型飼糧中添加1.5%的小肽導(dǎo)致瘤胃中肽含量過高，降低瘤胃微生物的生長速度，大量可溶性氮不能及時被微生物攝取從瘤胃逸出進入血液中[26]，降低氮的利用率，從而使得CP的消化率降低。

3.3 發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽對肉牛血清生化指標的影響

血清生化指標能反映機體組織器官的功能和生理狀態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)的代謝及免疫水平等。AST和ALT在機體蛋白質(zhì)合成和代謝中發(fā)揮轉(zhuǎn)氨基的作用，其活性是準確反映心肌細胞和肝臟功能的重要指標。ALP與骨骼的生長密切相關(guān)，也可以反映機體蛋白質(zhì)和脂肪代謝的效率[27]。孫海元[28]研究表明，在生長豬飼糧中添加小肽能降低血清AST和ALT活性，改善肝臟功能，降低肝臟損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著小肽添加水平的增加，血清AST和ALT活性先降低后升高，血清ALP活性無顯著變化。與苗建軍等[12]在牦牛飼糧中添加小肽，血清AST和ALT活性線性降低，ALP活性無顯著變化的結(jié)果不完全一致。這表明發(fā)酵雜粕型飼糧中添加適宜水平的小肽有利于改善肝臟的功能，飼糧中高水平的肽會造成氮代謝的負擔，進而損傷肝臟。

GLU是機體代謝直接的能量來源，能反映機體能量水平的高低、糖生成與消耗的動態(tài)平衡[29]。TG是機體體脂的重要組成部分，其含量可作為脂肪肝診斷的依據(jù)[30]。T-CHO能反映機體脂肪代謝的情況，也是臨床上診斷和預(yù)防疾病的重要指標。本試驗中，Ⅳ組血清GLU含量有高于其余組的趨勢，而血清TG和T-CHO含量無顯著變化，劉雙[9]在奶牛飼糧中添加“富力肽”也得到類似的結(jié)果。這表明發(fā)酵雜粕型飼糧添加小肽能在一定范圍內(nèi)增強機體代謝能力。

TP包括ALB和GLB，是反映機體蛋白質(zhì)合成代謝的重要指標，TP含量的提高可促進機體蛋白質(zhì)的沉積和免疫力的加強等，ALB用于修補組織和提高能量，還可以維持血液滲透壓[31]，而GLB與機體的抗體水平密切相關(guān)。本試驗中，在發(fā)酵雜粕型飼糧中添加小肽對血清TP、ALB和GLB含量均無顯著影響。UN含量準確反映機體蛋白質(zhì)代謝和飼糧氨基酸平衡狀況，UN含量越低氨基酸平衡性越好，蛋白質(zhì)的合成效率也越高[32]，本試驗中，隨著小肽添加水平的增加,血清UN含量呈先降低后升高的二次曲線變化，且Ⅳ組血清UN含量有顯著高于對照組、Ⅱ組、Ⅲ組的趨勢，與王文娟[4]瘤胃灌注小肽肉牛血漿UN含量隨小肽添加的增加而升高的結(jié)果相似。此外，瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮的含量過高會降低微生物生長的速度，抑制微生物合成微生物蛋白，導(dǎo)致血液中UN含量升高，加重機體氮代謝的負擔[33-34]。這表明在發(fā)酵雜粕型飼糧添加1.5%的小肽會加重動物機體氮代謝的負擔，降低蛋白質(zhì)的利用效率。

4 結(jié) 論

發(fā)酵雜粕型飼糧添加1.0%的小肽，可提高CP和OM的消化率，改善肝臟功能，增加機體代謝能力，進而提高肉牛ADG，降低F/G，改善生長性能，但添加水平為1.5%時會出現(xiàn)負面影響；綜合考慮，小肽添加水平以1.0%為宜。