潘 鋒 朱彥賓 王之盛 巴桑旺堆 薛 白 王立志 胡 瑞 安添午 譚 武 孫光明 田 剛 彭全輝**

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩850009；3.四川省草原科學(xué)研究院，成都611731；4.四川省紅原縣刷經(jīng)寺農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心，阿壩624402)

牧區(qū)牧草季節(jié)性生長，牦牛犏牛在春冬季往往沒有充足的飼草資源，常常造成牛只掉膘，甚至是死亡的發(fā)生。而肉牛的“北繁南育”是協(xié)調(diào)南北飼料資源，降低生產(chǎn)成本，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)收入的重要舉措[1]。但是，由于生存環(huán)境和飼料的劇烈變化以及長途運(yùn)輸帶來的多種綜合應(yīng)激往往導(dǎo)致牛采食量下降，免疫功能下降，發(fā)病率暴增，死亡率居高不下。因此，迅速提高長途運(yùn)輸后的異地育肥牛只的干物質(zhì)采食量(DMI)、恢復(fù)體質(zhì)是降低疾病發(fā)生率和死亡率的關(guān)鍵。

酵母培養(yǎng)物(yeast culture，YC)是酵母菌在特定的培養(yǎng)基中發(fā)酵后形成的微生態(tài)制品，富含蛋白質(zhì)、寡糖和有機(jī)酸等成分。Dann等[2]研究表明，在圍產(chǎn)期奶牛飼糧中添加YC可提高其DMI和泌乳早期產(chǎn)奶量，減少體儲消耗。Wagner等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，YC可以顯著提高育肥牛的DMI與平均日增重(ADG)。糖蜜(molasses，MO)是制糖業(yè)副產(chǎn)品，主要成分是糖。Havekes等[4]報(bào)道，MO具有顯著提高干奶期奶牛DMI，改善瘤胃健康的作用。Mordent等[5]報(bào)道，MO可以提高反芻動(dòng)物的DMI，并且對提高放牧肉牛、水牛、綿羊和山羊的DMI效果更佳。前人研究大都從YC和MO本身如口感和香味等角度出發(fā)去探究其提高動(dòng)物DMI的原因，本試驗(yàn)擬考察YC和MO對異地育肥肉牛的影響，并嘗試從微生物的角度去解釋YC和MO改變?nèi)馀MI的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

YC購自某生物發(fā)酵工程技術(shù)(深圳)有限公司。MO是甘蔗糖蜜，購自當(dāng)?shù)毓S。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

1.3 飼糧組成及營養(yǎng)水平

飼糧配方設(shè)計(jì)參照中國《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)，基礎(chǔ)飼糧與MO飼糧的營養(yǎng)水平相近，除了添加MO以外，飼糧結(jié)構(gòu)保持不變。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2020年10—12月在四川省成都市都江堰市某牛場完成。試驗(yàn)開始前對牛圈進(jìn)行清潔和消毒等準(zhǔn)備工作。試驗(yàn)牛只進(jìn)行舍飼分欄栓養(yǎng)。每天07:30和18:30，以全混合日糧(TMR)的形式飼喂，自由采食與飲水。

1.5 樣品采集及指標(biāo)測定

1.5.1 生長性能

于試驗(yàn)第1和70天晨飼前對試驗(yàn)牛稱重，記錄試驗(yàn)牛每天的采食量。計(jì)算ADG、DMI、料重比(F/G)。

1.5.2 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

于試驗(yàn)第66～69天每4 h采集1次糞樣，采集完成后將每頭試驗(yàn)牛的糞樣混合均勻加入10%的稀硫酸固氮，在此期間收集飼料樣品。糞樣和飼料樣65 ℃烘至恒重，回潮24 h后粉碎過40目篩保存。

糞樣和飼料樣中干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007和GB/T 6432—2018測定。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率采用鹽酸不溶灰分(AIA)法測定，計(jì)算公式如下：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100-[(飼糧中
AIA含量×糞中該營養(yǎng)物質(zhì)含量)/(糞中AIA
含量×飼糧中該營養(yǎng)物質(zhì)含量)]×100。

1.5.3 微生物16S擴(kuò)增子高通量測序

于試驗(yàn)第69天晨飼前，用無菌棉簽刮取試驗(yàn)牛直腸末端糞樣約5 g，凍存管液氮保存到實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測。

使用Zymo Research BIOMICS DNA Microprep Kit(Cat# D4301)進(jìn)行樣本DNA提取與純化；使用Primer5′-3′對樣本16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物為515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)；2%凝膠電泳檢測，對合格的樣品使用Zymoclean Gel Recovery Kit(D4008)回收；使用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)定量；在Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行測序。

使用FLASH拼接雙端序列得到原始Tags(raw tags)使用QIIME進(jìn)行質(zhì)控得到高質(zhì)量Tags(clean tags)，使用UCHIME算法與數(shù)據(jù)庫比對去除嵌合體得到有效Tags(effective Tags)，使用Usearch在97%水平上進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，使用UCLUST分類法與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類注釋。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016整理后，用SPSS 27.0對生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并以Duncan氏法進(jìn)行多重比較；對微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 添加YC和MO對肉牛生長性能的影響

由表2可知，3個(gè)試驗(yàn)組的DMI均顯著高于CK組(P<0.05)，分別提高了7.80%、9.57%和14.89%，但3個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)；4個(gè)組之間的初始體重(IBW)、終末體重(FBW)、ADG和F/G差異不顯著(P>0.05)。

2.2 添加YC和MO對肉牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，YC組和YM組NDF表觀消化率極顯著高于CK組(P<0.01)，YM組顯著高于CK組(P<0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組ADF表觀消化率顯著高于CK組(P<0.05)，但3個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。4個(gè)組之間的DM和CP表觀消化率差異不顯著(P>0.05)。

2.3 添加YC和MO對肉牛糞便微生物區(qū)系組成的影響

2.3.1 OTU和Alpha多樣性指數(shù)

由表4可知，YM組的OTU極顯著高于CK組(P<0.01)，顯著高于YC組(P<0.05)，MO組的OTU顯著高于CK組(P<0.05)。YM組的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于CK組、YC組和MO組(P<0.05)，CK組、YC組和MO組之間的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；3個(gè)試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)極顯著高于CK組(P<0.01)，但3個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3.2 Beta多樣性分析

由圖1可知，主坐標(biāo)1(PCo1)的貢獻(xiàn)值為36.5%，主坐標(biāo)2(PCo2)的貢獻(xiàn)值為15.8%，3個(gè)試驗(yàn)組跟CK組明顯區(qū)分開，而3個(gè)試驗(yàn)組交叉在一起。CK組的8個(gè)樣品較為分散，而3個(gè)試驗(yàn)組的樣品間距離較近，均一性較好。

2.3.3 糞便微生物物種豐度分析

本試驗(yàn)在生長肉牛的糞便中共鑒定出微生物35個(gè)門(phylum)、77個(gè)綱(class)、163個(gè)目(order)、287個(gè)科(family)和644個(gè)屬(genus)。

相對豐度排名前10的菌門如圖2所示，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)3個(gè)菌門是糞便優(yōu)勢菌門，占總細(xì)菌相對豐度91.73%以上。由表5可知，3個(gè)試驗(yàn)組的擬桿菌門的相對豐度顯著高于CK組(P<0.05)，螺旋體門(Spirochaetes)相對豐度極顯著高于CK組(P<0.01)，但3個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。MO組和YM組軟壁菌門(Tenericutes)和髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)的相對豐度極顯著高于CK組(P<0.01),YC組顯著高于CK組(P<0.05)。MO組和YM組厚壁菌門的相對豐度極顯著低于CK組(P<0.01)，YC組顯著低于CK組(P<0.05)。4個(gè)組之間的變形菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、奇古菌門(Thaumarchaeota)的相對豐度差異不顯著(P>0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Acidobacteria：酸桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Crenarchaeota：泉古菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Patescibacteria：髕骨細(xì)菌門；Thaumarchaeota：奇古菌門；Others：其他。

12種優(yōu)勢菌屬(相對豐度>1%)如圖3所示。由表6可知，YC組和YM組理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae RC9 gut group)和瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae UCG-005)相對豐度極顯著高于CK組(P<0.01)，MO組顯著高于CK組(P<0.05)。MO組和YM組鼠桿菌科未定義菌屬(Unidentified-Muribaculaceae)和類桿菌真核菌群([Eubacterium]coprostanoligenesgroup)相對豐度極顯著高于CK組(P<0.01)，YC組顯著高于CK組(P<0.05)。3個(gè)試驗(yàn)組的普雷沃氏菌科UCG-004(Prevotellaceae UCG-004)相對豐度顯著高于CK組(P<0.05)。YC組和YM組克里斯滕森氏菌科R-7群(Christensenellaceae R-7 group)相對豐度極顯著低于CK組(P<0.01)，MO組顯著低于CK組(P<0.05)。4個(gè)組之間的瘤胃球菌科UCG-013(Ruminococcaceae UCG-013)、瘤胃球菌科UCG-010(Ruminococcaceae UCG-010)、理研菌科dgA-11腸道群 (Rikenellaceae dgA-11 gut group)、青枯菌屬(Ralstonia)、毛螺菌科NC2004(Lachnospiraceae NC2004 group)和大腸埃希菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 添加YC和MO對肉牛生長性能的影響

異地育肥是我國肉牛生產(chǎn)的主要方式，但由于長途運(yùn)輸中的缺水缺料以及新氣候環(huán)境等多種應(yīng)激，常常導(dǎo)致牛只DMI的下降，久久不能恢復(fù)，而DMI則直接影響動(dòng)物機(jī)體健康和生產(chǎn)力[6]，DMI的恢復(fù)對動(dòng)物機(jī)體免疫力恢復(fù)與減少疾病發(fā)生有重要意義。本試驗(yàn)在飼糧中添加YC肉牛DMI顯著提高，與前人研究結(jié)果一致。Lesmeister等[7]在飼糧中添加YC發(fā)現(xiàn)犢牛DMI顯著提高。黃文明等[8]認(rèn)為YC能提高牛只的DMI的原因是其芳香氣味提高了牛只的食欲。本試驗(yàn)在飼糧中添加MO的肉牛DMI顯著提高，前人也有相似的報(bào)道。B?rsting等[9]研究表明，在奶牛飼糧中添加MO可以顯著提高泌乳期奶牛的DMI。Devries等[10]認(rèn)為MO能提高反芻動(dòng)物DMI是因?yàn)镸O可以改善飼糧適口性，大多數(shù)動(dòng)物喜食甜食。但YM組與YC組和MO組相比DMI差異不顯著，這表明同時(shí)添加YC和MO對肉牛DMI沒有進(jìn)一步的疊加效應(yīng)。

3.2 添加YC和MO對肉牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率不僅是動(dòng)物消化能力的直接反映，也是影響動(dòng)物生長性能的重要因素。Robinson[11]研究表明，YC可以有效提高產(chǎn)后奶牛的NDF、ADF等營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。本試驗(yàn)在肉牛飼糧中添加YC也觀察到NDF和ADF表觀消化率顯著提高。Haddad等[12]在育肥羔羊中也發(fā)現(xiàn)，添加YC可以顯著提高育肥羔羊的NDF和ADF表觀消化率。 Mordenti等[5]報(bào)道，MO對提高反芻動(dòng)物營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率有重要作用，本試驗(yàn)在肉牛飼糧中添加MO發(fā)現(xiàn)NDF和ADF表觀消化率顯著提高，但Zali等[13]報(bào)道，MO顯著提高了荷斯坦公犢牛的NDF表觀消化率，但對于ADF表觀消化率的影響不顯著，這可能是因?yàn)榕５钠贩N和飼糧結(jié)構(gòu)不同所致。混合添加YC和MO發(fā)現(xiàn)NDF和ADF表觀消化率顯著高于CK組，但3個(gè)試驗(yàn)組之間的NDF和ADF表觀消化率差異不顯著，這表明同時(shí)添加YC和MO對提高營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率無疊加效應(yīng)，這也從不同處理組牛只的生長性能上體現(xiàn)了出來。纖維類物質(zhì)進(jìn)入胃之后與大量水結(jié)合膨大形成凝膠狀團(tuán)狀物，增大食糜黏度，使胃腸道蠕動(dòng)減緩，導(dǎo)致動(dòng)物飽腹感增強(qiáng)，從而降低動(dòng)物采食欲望[14]。研究表明纖維類物質(zhì)消化率提高有助于泌乳奶牛DMI的提高[15]。3個(gè)試驗(yàn)組的NDF和ADF表觀消化率均高于CK組，這可能是3個(gè)試驗(yàn)組DMI高于CK組的原因。

表5 糞便微生物群落在門水平上的分布

3.3 添加YC和MO對肉牛糞便微生物區(qū)系組成的影響

飼糧中纖維類物質(zhì)的消化率提高或許跟腸道微生物區(qū)系組成的改變有關(guān)。反芻動(dòng)物胃腸道微生物對其攝入的營養(yǎng)物質(zhì)降解有重要作用[16]。纖維類物質(zhì)的降解主要依靠微生物降解，而瘤胃是纖維類物質(zhì)降解的主要場所[17]，但是研究表明反芻動(dòng)物后腸段對纖維物質(zhì)的降解也具有重要作用，約30%的纖維類物質(zhì)需要依靠后腸微生物來降解[18]。而糞便微生物可以用來評估反芻動(dòng)物后腸段的微生物區(qū)系組成[19]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肉牛的糞便微生物優(yōu)勢菌門分別是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，這與前人在野牛[19]、犢牛[20]以及山羊[21]上的報(bào)道結(jié)果一致。本試驗(yàn)在飼糧中添加YC、MO或二者同時(shí)添加均提高了擬桿菌門的相對豐度，并降低了厚壁菌門的相對豐度。研究表明，擬桿菌門是健康人類糞便中相對豐度最高的菌群[22]，可以幫助宿主高效的吸收與利用多糖[23]。而厚壁菌門的作用主要是協(xié)助多糖發(fā)酵，和擬桿菌門一起幫助宿主消化一些自身無法利用的物質(zhì)[24]。飼糧中添加YC、MO或兩者混合添加可以提高擬桿菌門相對豐度，這可能有助于提高肉牛的纖維降解消化能力。

本試驗(yàn)在飼糧中添加YC、MO或二者混合添加均提高了理研菌科RC9腸道群、鼠桿菌科未定義菌屬、普雷沃氏菌科UCG-004、瘤胃球菌科UCG-005和類桿菌真核菌群的相對豐度。Zhu等[25]研究表明，理研菌科RC9腸道群可以有效降解可溶性多糖和不溶性纖維素，這或許是在飼糧中添加YC、MO或二者同時(shí)添加肉牛NDF與ADF表觀消化率顯著提高的原因之一。也有研究表明，理研菌科菌屬對維護(hù)腸道健康有重要作用[26]。Li等[27]報(bào)道，普雷沃氏菌屬可以降解淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等。也有研究表明普雷沃氏菌屬有協(xié)作降解纖維的能力[28]，這可能也是本試驗(yàn)中3個(gè)試驗(yàn)組的NDF與ADF表格消化率顯著高于CK組的原因。此外，有研究表明普雷沃氏菌屬對降低腸道炎癥方面也具有重要作用[29]。瘤胃球菌科UCG-005和類桿菌真核菌群均屬于瘤胃球菌科，前人的研究表明，瘤胃球菌科菌屬是重要的纖維降解菌，可以降解宿主不能消化的纖維類物質(zhì)[30]。Patra等[31]和Zhao等[32]的研究表明，瘤胃中瘤胃球菌科菌屬的相對豐度跟飼糧的纖維消化率呈正相關(guān)，這也是本試驗(yàn)中3個(gè)試驗(yàn)組的NDF與ADF表觀消化率顯著高于CK組的原因。本試驗(yàn)中3個(gè)試驗(yàn)組的克里斯滕森氏菌科R-7的相對豐度低于CK組，而前人的報(bào)道表明，克里斯滕森氏菌屬的相對豐度與牦牛增重呈負(fù)相關(guān)[33]。本試驗(yàn)中3個(gè)試驗(yàn)組與CK組相比糞便微生物發(fā)生了相似的變化，且這些變化的菌群均對動(dòng)物的纖維物質(zhì)的消化、腸道代謝與健康有一定的積極作用，從而使NDF和ADF表觀消化率提高，進(jìn)而提高DMI。

Ruminococcaceae UCG-013：瘤胃球菌科UCG-013；Ruminococcaceae UCG-010：瘤胃球菌科UCG-010；Rikenellaceae dgA-11 gut group：理研菌科dgA-11腸道群；Christensenellaceae R-7 group：克里斯滕森氏菌科R-7；Rikenellaceae RC9 gut group：理研菌科RC9腸道群；Ralstonia：青枯菌屬；Lachnospiraceae NC2004 group：毛螺菌科NC2004群；Unidentified-Muribaculaceae：鼠桿菌科未定義屬；Prevotellaceae UCG-004：普雷沃氏菌科UCG-004；Escherichia-Shigella：大腸埃希菌-志賀菌屬；Ruminococcaceae UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005；[Eubacterium] coprostanoligenes group：類桿菌真核菌群；Others：其他。

表6 糞便微生物群落在屬水平上的分布

續(xù)表6項(xiàng)目Items組別 GroupsCKYCMOYMSEMP值P-value普雷沃氏菌科UCG-004Prevotellaceae UCG-0041.97b4.18a4.20a4.28a0.3510.015大腸埃希菌-志賀菌屬Escherichia-Shigella1.913.774.712.410.5130.087瘤胃球菌科UCG-005Ruminococcaceae UCG-0051.81Bb5.72Aa4.38ABa5.76Aa0.4030.001類桿菌真核菌群[Eubacterium] coprostanoligenesgroup1.42Bb3.31ABa3.81Aa4.78Aa0.3350.004

4 結(jié) 論

添加YC、MO或兩者混合添加均可以提高肉牛胃腸道中擬桿菌門的相對豐度，提高理研菌科RC9腸道群和普雷沃氏菌科UCG-004等菌屬的相對豐度，從而提高NDF和ADF表觀消化率，進(jìn)而提高DMI，但兩者混合添加對改善肉牛消化率和采食量并無疊加效應(yīng)。