閆金玲 李蓓蓓 李 妍 張秀江 陳 璇 張?jiān)鲑t 李建國(guó) 高艷霞 李秋鳳* 曹玉鳳*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定071001；3.保定市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，保定071000；4.寧晉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，寧晉055550)

牛肉因富含多種人體必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等而備受消費(fèi)者青睞[1]。如今隨著人們生活水平的提高，優(yōu)質(zhì)牛肉供不應(yīng)求，因此肉牛生產(chǎn)相關(guān)從業(yè)者和科研人員應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注如何改善牛肉品質(zhì)以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉。氨基酸營(yíng)養(yǎng)是反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的核心，肉中氨基酸的含量和比例是評(píng)價(jià)肉類蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[2]，特別是限制性氨基酸，其平衡與否將會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的利用效率。可通過補(bǔ)飼氨基酸平衡氨基酸比例來(lái)提高蛋白質(zhì)的利用效率，改善肉牛的生產(chǎn)性能及肉品質(zhì)。蛋氨酸是構(gòu)成人體的必需氨基酸之一，參與蛋白質(zhì)的合成，是動(dòng)物體中的第一大限制性氨基酸，也是動(dòng)物生長(zhǎng)必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，參與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)眾多的代謝途徑，為動(dòng)物提供甲基，合成動(dòng)物生長(zhǎng)所需要的蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)，飼糧中必須添加適量的蛋氨酸以滿足動(dòng)物生長(zhǎng)的需要[3]。賴氨酸既是人體的必需氨基酸，也是反芻動(dòng)物的必需氨基酸。作為反芻動(dòng)物體內(nèi)第二大限制性氨基酸，賴氨酸是合成機(jī)體蛋白質(zhì)，形成骨骼肌、酶蛋白的原料。在飼糧中添加賴氨酸可以增加小腸可消化氨基酸總數(shù)，提高蛋白質(zhì)的利用率，減少蛋白質(zhì)在瘤胃轉(zhuǎn)化過程中的損失[4]。

由于反芻動(dòng)物瘤胃微生物會(huì)消耗機(jī)體所攝取的氨基酸，導(dǎo)致到達(dá)小腸的氨基酸的量和比例發(fā)生顯著改變，尤其是限制性氨基酸，因此越來(lái)越多研究人員開始研究過瘤胃氨基酸產(chǎn)品，而由于飼糧組成、動(dòng)物品種、生長(zhǎng)階段及地理位置的不同，不同研究得出的過瘤胃氨基酸的添加量不盡相同[5-9]。

在反芻動(dòng)物飼糧中添加適量的過瘤胃氨基酸可有效地增加小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和自身機(jī)體的健康狀況，既可在某種程度上緩解蛋白質(zhì)飼料短缺的問題，又能提高反芻動(dòng)物氮素沉積率[10-15]，改善肉品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)擬在降低飼糧蛋白質(zhì)水平的基礎(chǔ)上補(bǔ)充不同劑量過瘤胃賴氨酸(rumen-protected lysine，RPLys)和過瘤胃蛋氨酸(rumen-protected methionine，RPMet)，研究其對(duì)荷斯坦公牛生長(zhǎng)性能、屠宰性能、肉品質(zhì)及氮代謝的影響，以期為過瘤胃氨基酸在改善牛肉品質(zhì)方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RPLys和RPMet購(gòu)于杭州某公司，瘤胃保護(hù)率為60.0%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用36頭體重[(424±15) kg]相近、體況良好、健康無(wú)病的荷斯坦公牛作為試驗(yàn)牛，隨機(jī)分為3組，每組12頭。對(duì)照組(Ⅰ組)飼喂蛋白質(zhì)水平為13%的正常飼糧，2個(gè)試驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ組)均飼喂蛋白質(zhì)水平為11%的低蛋白質(zhì)飼糧，同時(shí)Ⅱ組補(bǔ)充34 g/(d·頭)RPLys+2 g/(d·頭)RPMet，Ⅲ組補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet。預(yù)試期7d，正試期83 d。根據(jù)NRC(2001)[16]肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2016年3—6月在河北省保定市宏達(dá)牛場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)用奶公牛飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，每天上午、下午各飼喂1次，自由飲水。飼喂后，認(rèn)真打掃牛棚，為奶公牛提供潔凈的水源和整潔的休息場(chǎng)地。試驗(yàn)期間牛棚定期消毒，維持牛棚內(nèi)外的干燥和衛(wèi)生。

1.4 樣品的采集與處理

1.4.1 飼料樣品的采集與處理

在試驗(yàn)期內(nèi)，采用四分法對(duì)飼糧多次取樣。將樣品置于烘箱烘干(105.0 ℃ 15 min，65.0 ℃ 48 h)，取出回潮24 h后制成風(fēng)干樣品，粉碎后分成2份，分別過10和40目篩，儲(chǔ)存?zhèn)錅y(cè)養(yǎng)分含量。粉碎過10目篩的風(fēng)干樣品用于測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量，粉碎過40目篩的風(fēng)干樣品用于測(cè)定水分、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和磷(P)含量。

1.4.2 糞便樣品的采集與處理

在正試期末采用全收糞法連續(xù)3 d收集試驗(yàn)牛的糞便，每頭每天取糞便樣品600 g，均勻分成2份，其中一份添加60.0 mL 10%的硫酸溶液，另一份不加酸，烘干粉碎過篩置于室溫保存，備測(cè)養(yǎng)分含量。糞便中各養(yǎng)分含量的測(cè)定方法同飼糧中各養(yǎng)分含量的測(cè)定方法一致。

1.4.3 血液樣品的采集與處理

在正試期結(jié)束后晨飼前，每組隨機(jī)選取4頭試驗(yàn)牛通過頸靜脈無(wú)菌采血，將采集的血液放入促凝管。將裝有血樣的促凝劑管于37.0 ℃水浴0.5 h后，3 000 r/min離心15 min，收集血清分裝至1.50 mL的塑料離心管，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 肌肉樣品的采集與處理

在正試期結(jié)束后稱重，每組選3頭試驗(yàn)牛用于屠宰試驗(yàn)。測(cè)定試驗(yàn)牛宰前活重(空腹?fàn)顟B(tài))、胴體重(活牛屠宰后去皮、頭、蹄、尾、內(nèi)臟及生殖器的軀體，保留腎周脂肪和腹腔脂肪)。屠宰后在排酸車間放置48 h后分割，計(jì)算凈肉重等屠宰性能指標(biāo)。在第12～13肋間橫截面處取1 kg左右肉樣，將肉樣分為2份，一份用來(lái)測(cè)定剪切力、蒸煮損失、失水率、肉色等；另一份剁碎置于-20 ℃凍存，用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定。

試驗(yàn)牛屠宰后，馬上割取背腰最長(zhǎng)肌(第12～13肋間肌肉)組織，分成2份，一份置于0.5 mL離心管中加入RNA保存液，用于肌肉中氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

正試期開始及結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)牛在早晨空腹進(jìn)行稱重，計(jì)算平均日增重(ADG)；試驗(yàn)期內(nèi)每隔15 d，連續(xù)3 d測(cè)定各組試驗(yàn)牛的干物質(zhì)采食量(DMI)，計(jì)算日均干物質(zhì)采食量(ADDMI)；利用日均干物質(zhì)采食量、平均日增重計(jì)算料重比(F/G)。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率

根據(jù)國(guó)標(biāo)方法測(cè)定飼糧和糞便中水分[17]、粗蛋白質(zhì)[18]、粗脂肪[19]、鈣[20]、磷[21]的含量，參照Van Soest等[22]的方法測(cè)定飼糧和糞便中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量，參照《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》(GB/T 23742—2009)測(cè)定酸不溶灰分(AIA)含量。

養(yǎng)分表觀消化率計(jì)算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-
100×(b×c)/(a×d)。

式中：a為飼糧中該養(yǎng)分的含量(%)；b為糞便中該養(yǎng)分的含量(%)；c為飼糧中酸不溶灰分的含量(%)；d為糞便中酸不溶灰分的含量(%)。

1.5.3 血清游離氨基酸含量

血清游離氨基酸含量采用柱前衍生高效液相色譜法[23]測(cè)定。

1.5.4 屠宰性能

屠宰性能測(cè)定指標(biāo)主要有胴體重、凈肉重、屠宰率、凈肉率、胴體產(chǎn)肉率、眼肌面積。

屠宰率、凈肉率、胴體產(chǎn)肉率計(jì)算公式如下：

屠宰率(%)=100×胴體重(排酸前)/宰前活重；
凈肉率(%)=100×凈肉重(排酸前)/宰前活重；
胴體產(chǎn)肉率(%)=100×凈肉重
(排酸前)/胴體重(排酸前)。

眼肌面積：把硫酸紙貼放于第12～13肋骨間的外脊橫切面，拿2B鉛筆沿肌肉輪廓?jiǎng)澗€，用KP-90N求積儀計(jì)算眼肌面積。

1.5.5 肉品質(zhì)

肌肉的pH使用手持式UB-7型酸度計(jì)(美國(guó))測(cè)定；蒸煮損失和剪切力的測(cè)定參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1180—2006測(cè)定；失水率使用A7209型壓力儀(中國(guó)蘇州)測(cè)定；肉色使用CR-10型色差儀(日本)測(cè)定。肌肉水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量的測(cè)定方法同飼糧，氨基酸含量的測(cè)定按照《飼料中氨基酸的測(cè)定》(GB/T 18246—2000)進(jìn)行。

1.5.6 肌肉中氮代謝相關(guān)基因表達(dá)

據(jù)NCBI中已報(bào)道的?；蛐蛄屑耙镌O(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)引物，引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司代為合成，引物信息見表2。反應(yīng)體系為20 μL：iQ SYBR Green Supermix 10 μL，PCR正向引物(3 μmol/μL)2 μL，PCR反向引物(3 μmol/μL) 2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸，72 ℃，40個(gè)循環(huán)。各個(gè)樣品cDNA重復(fù)3次PCR，根據(jù)熔解曲線來(lái)評(píng)判產(chǎn)物特異性。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，肌肉中氮代謝相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法[24]計(jì)算。

表2 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

先使用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理分析，然后用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，各組間平均日增重、日均干物質(zhì)采食量、料重比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛生長(zhǎng)性能的影響

2.2 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知，各組間各養(yǎng)分表觀消化率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛屠宰性能的影響

由表5可知，各組間各屠宰性能指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

表5 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛屠宰性能的影響

2.4 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肉品質(zhì)的影響

2.4.1 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉物理和化學(xué)指標(biāo)的影響

由表6可知，各組間肌肉pH、剪切力、蒸煮損失、失水率、肉色均沒有顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

由表7可知，各組間肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛物理和化學(xué)指標(biāo)的影響

表7 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

2.4.3 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉氨基酸含量的影響

本試驗(yàn)中對(duì)照組和試驗(yàn)組共檢測(cè)出16種氨基酸。由表8可知，Ⅲ組的異亮氨酸含量極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，谷氨酸和天冬氨酸含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，其他氨基酸含量各組間均未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

表8 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉氨基酸含量的影響

2.5 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛血清游離氨基酸含量的影響

由表9可知，對(duì)于血清游離氨基酸，Ⅲ組的蘇氨酸含量極顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.01)，總氨基酸、苯丙氨酸和丙氨酸含量顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，賴氨酸含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，甘氨酸含量顯著高于Ⅱ組(P<0.05)，其他氨基酸含量與Ⅰ和Ⅱ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；Ⅰ和Ⅱ組間各血清游離氨基酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.6 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉中氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表10可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ和Ⅲ組的胰島素受體底物1(IRS1)mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；Ⅲ組的腫瘤抑制復(fù)合物1(TSC1)和腫瘤抑制復(fù)合物2(TSC2)mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)、磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)、真核細(xì)胞翻譯起始因子4B(eIF4B)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(eIF4E-BP1)mRNA相對(duì)表達(dá)量各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表9 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛血清游離氨基酸含量的影響

表10 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肌肉中氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

賴氨酸與蛋氨酸分別是反芻動(dòng)物主要的限制性氨基酸，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)氨基酸的代謝具有協(xié)調(diào)與平衡作用，可以促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成[25]。限制性氨基酸的不足會(huì)抑制機(jī)體對(duì)其他氨基酸的吸收和利用，從而影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率以及生長(zhǎng)性能。研究表明降低反芻動(dòng)物飼糧的蛋白質(zhì)水平是減少氮排放的措施之一，但可能導(dǎo)致反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能[26]和粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等養(yǎng)分表觀消化率降低[27]。為滿足反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要，并要保證反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，在降低飼糧蛋白質(zhì)水平的同時(shí)加入過瘤胃氨基酸可提高小腸可吸收氨基酸利用率，從而達(dá)到減排效果。本試驗(yàn)中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組荷斯坦公牛的料重比、日均干物質(zhì)采食量、養(yǎng)分表觀消化率等無(wú)顯著差異，這與殷溪瀚[28]的研究結(jié)果基本一致，說明低蛋白質(zhì)飼糧水平補(bǔ)充RPLys和RPMet不會(huì)影響荷斯坦公牛的生長(zhǎng)性能。郭偉等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加過瘤胃氨基酸對(duì)杜寒雜交肉羊的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。殷溪瀚[28]的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧蛋白質(zhì)水平降低1.71%的同時(shí)補(bǔ)充RPLys和RPMet時(shí)荷斯坦奶公牛的增重效果與直接飼喂高蛋白質(zhì)飼糧基本一致。本試驗(yàn)中，Ⅰ和Ⅱ組荷斯坦公牛的各養(yǎng)分表觀消化率均低于Ⅲ組，這大概是因?yàn)棰蠼M飼糧補(bǔ)充的RPLys和RPMet適量，使飼糧限制性氨基酸的比例平衡，從而提高了養(yǎng)分的消化率；此外，Ⅲ組的平均日增重高于Ⅰ和Ⅱ組，這表明Ⅲ組飼糧組成更能滿足荷斯坦公牛的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛屠宰性能的影響

屠宰率、凈肉率、胴體產(chǎn)肉率等是評(píng)價(jià)肉牛屠宰性能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，雖然低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組荷斯坦公牛的屠宰率高于其他2組，但3組間并無(wú)顯著差異，表明在低蛋白質(zhì)飼糧中補(bǔ)充過瘤胃氨基酸對(duì)荷斯坦公牛的屠宰性能無(wú)顯著影響，這與周玉香等[29]的相關(guān)研究結(jié)果一致。殷溪瀚[28]研究也表明，在低蛋白質(zhì)飼糧中補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦奶公牛的屠宰率、凈肉率無(wú)顯著影響。

3.3 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛肉品質(zhì)的影響

評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的物理和化學(xué)指標(biāo)主要有pH、剪切力、蒸煮損失、失水率、肉色及粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量。肌肉pH反映肌肉酸度和機(jī)體糖酵解速率，其高低與肉色、蒸煮損失及嫩度相關(guān)。失水率是指肌肉中的蛋白質(zhì)經(jīng)過物理處置后的保水力，其值越小說明肌肉保水力越高，嫩度越好；剪切力也是表現(xiàn)肌肉的嫩度的重點(diǎn)指標(biāo)，剪切力越小則肌肉嫩度越好[30]。薛豐等[31]研究結(jié)果，飼糧中補(bǔ)充適量的RPLys可增加利木贊雜交肉牛肌肉蛋白質(zhì)含量，降低系水力，對(duì)肉色等其他性狀沒有顯著影響。本試驗(yàn)中，雖然3組荷斯坦公牛的肌肉物理和化學(xué)指標(biāo)以及常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量無(wú)顯著差異，但是低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組的肌肉粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量均高于其他2組，肌肉剪切力和失水率低于其他2組。

3.4 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛血清游離氨基酸含量的影響

血清游離氨基酸主要是從小腸吸收的氨基酸以及機(jī)體蛋白質(zhì)分解的氨基酸，其含量具有顯示動(dòng)物氨基酸平衡和代謝的重要作用[32-33]。研究表明，添加過瘤胃氨基酸可增加血液中游離賴氨酸與蛋氨酸以及總游離氨基酸的含量，但是對(duì)其他游離氨基酸含量的影響不一致。孫華等[34]在奶牛飼糧中添加RPMet的研究發(fā)現(xiàn)，添加60 g/d的RPMet后奶牛血漿總游離氨基酸含量提高12.49%，機(jī)體合成乳蛋白的效率提高。韓兆玉等[35]的研究顯示，奶牛飼糧中補(bǔ)充RPMet后血清游離蛋氨酸含量顯著增加，其他游離氨基酸含量沒有顯著改變。Lee等[8]的研究表明，泌乳期奶牛飼糧中補(bǔ)充RPMet會(huì)增加血漿游離蛋氨酸含量，沒有使其他游離氨基酸含量產(chǎn)生較大變化。郭玉琴[36]的研究表明，奶牛飼糧補(bǔ)充RPLys后，血液游離氨基酸中賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量顯著提高，蛋氨酸含量也有提高的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組荷斯坦公牛的血清游離賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量較對(duì)照組顯著增加，總游離氨基酸和游離蛋氨酸含量高于其余2組，其他游離氨基酸含量無(wú)顯著差異，同前人研究結(jié)果基本一致。

3.5 低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充RPLys和RPMet對(duì)荷斯坦公牛氮代謝的影響

大量體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明，氨基酸、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等能通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌蛋白、乳腺蛋白等的合成利用。羅鈞秋等[37]研究表明，大鼠受到血液IGF-1和血漿氨基酸組成和比例的影響，腓腸肌蛋白合成代謝增強(qiáng)。季昀等[38]認(rèn)為IGF-1可以提高乳蛋白合成通路中mTOR、S6K1基因的表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)κ-酪蛋白的合成。本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組和補(bǔ)充34 g/(d·頭)RPLys+2 g/(d·頭)RPMet組荷斯坦公牛血清游離氨基酸和亮氨酸含量的增加可能促進(jìn)了肌肉組織中SLC3A2基因表達(dá)量的上調(diào)，從而通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1(mTORC1)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)體蛋白質(zhì)合成代謝。

IGF-1、生長(zhǎng)激素(GH)等一些營(yíng)養(yǎng)因子通過PI3K/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/mTORC1信號(hào)通路激活mTORC1，對(duì)蛋白質(zhì)合成發(fā)揮作用[39]。本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組荷斯坦公牛肌肉中IRS1、PI3K、PDKmRNA相對(duì)表達(dá)量增加，且高于其他2組，這可能是因?yàn)檠逯蠭GF-1含量的提高激活了IRS1，被激活的IRS1可以磷酸化其下游信號(hào)元件PI3K使之活化，激活的PI3K繼而活化PDK，然后促進(jìn)Akt的Ser308位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，磷酸化的Akt可以激活mTOR及其下游的信號(hào)通路[40]。Akt與mTORC1之間的作用還受到TSC1、TSC2的調(diào)控。腫瘤抑制復(fù)合物(TSC)抑制小G蛋白R(shí)heb的活性，Rheb誘導(dǎo)eIF4E-BP1磷酸化，導(dǎo)致eIF4E-BP1從真核翻譯起始因子4E (eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)上分離開，使eIF4E啟動(dòng)5′cap mRNA的翻譯，所以Rheb是正向調(diào)控mTOR的；而TSC2可以抑制Rheb的活性，從而通過Rheb實(shí)現(xiàn)對(duì)mTOR的負(fù)性調(diào)控[41]。Akt可以抑制TSC1、TSC2的活性，因此上調(diào)的IRS1、PI3K、PDK基因間接抑制TSC1、TSC2基因的表達(dá)，使低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet組TSC1、TSC2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比其余組降低。由于TSC1、TSC2對(duì)mTORC1的負(fù)性調(diào)控，TSC1、TSC2表達(dá)的顯著下調(diào)激活了mTORC1基因。

S6K1和eIF4E-BP1為mTORC1的下游調(diào)節(jié)蛋白翻譯的基因。eIF4E是蛋白質(zhì)翻譯起始因子之一，活化水平低的eIF4E-BP1會(huì)和eIF4E緊密結(jié)合起來(lái)，而活化的mTORC1可以磷酸化4E-BP1，降低了其與eIF4E的親和力，使eIF4E能與其他翻譯起始因子[如真核細(xì)胞翻譯起始因子4G(eIF4G)、eIF4B、真核細(xì)胞翻譯起始因子4A(eIF4A)等]結(jié)合形成eIF4E復(fù)合物，從而啟動(dòng)mRNA的翻譯；S6K1是下游的70 kDa核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)靶蛋白激酶之一，S6K1基因可以通過刺激下游的eIF4B、核糖體蛋白S6(RPS6)、真核細(xì)胞翻譯起始因子-2(eIF-2)的磷酸化，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯。本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet可通過下調(diào)肌肉中TSC1、TSC2的表達(dá)激活mTORC1基因的表達(dá)，與前人相關(guān)研究結(jié)果相似。Arriola等[42]研究表明，降低飼糧蛋白質(zhì)水平并補(bǔ)充RPLys和RPMet后，奶牛乳腺組織mTOR通路中的S6K1和eIF4E-BP1基因的相對(duì)豐度提高了。桑丹等[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補(bǔ)充過瘤胃亮氨酸可以促進(jìn)綿羊骨骼肌的mTOR信號(hào)通路中eIF4E-BP1及p70S6K的磷酸化程度，從而促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成。綜上所述，降低飼糧蛋白質(zhì)水平的同時(shí)補(bǔ)充適量RPLys和RPMet使飼糧達(dá)到平衡對(duì)荷斯坦公牛肌肉中蛋白質(zhì)合成通路具有促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

飼糧蛋白質(zhì)水平從13%降低至11%條件下，補(bǔ)充55 g/(d·頭)RPLys+9 g/(d·頭)RPMet能夠使荷斯坦公牛的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率、屠宰性能及肉品質(zhì)不受影響，并可改善肌肉中氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)。