宋 丹 段 濤 成俊林 喬 琳 王 麗 陳麗仙 李愛(ài)科* 王薇薇*

(1.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院糧食品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)研究所，北京100037；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊陵712100)

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)健康綠色有機(jī)食品的需求量不斷增加。據(jù)報(bào)道，全球家禽消費(fèi)量以每年超過(guò)3.6%的速度增長(zhǎng)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素的使用在促進(jìn)畜禽生產(chǎn)方面發(fā)揮了重要作用，然而，使用飼料抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥病原體和在家禽產(chǎn)品中的藥物殘留[2]，抗生素耐藥性和食源性病原體也會(huì)對(duì)公共健康造成威脅，在“替抗”的大背景下，益生菌作為抗生素的替代品日益受到關(guān)注[3]。益生菌可以提高機(jī)體免疫力，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和抗氧化能力[4]，益生菌的應(yīng)用正成為全身性炎癥的一種有效的治療和預(yù)防策略。乳酸菌是腸道中重要的生理菌屬，在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要作用。此外，由于其對(duì)腸道屏障功能、免疫和抑制細(xì)胞凋亡的有益影響，乳酸菌已被證明是最有前途的飼料益生菌之一[5-7]。研究指出，植物乳桿菌可以提高肉雞生長(zhǎng)性能和改善腸道菌群[8-9]，增強(qiáng)腸道屏障和免疫功能[9]，抑制細(xì)胞凋亡[7]，降低氨氣排放量[10]。飼糧添加屎腸球菌可提高肉雞平均日增重(ADG)[11]，改善磷的吸收和骨礦化以及改善腸道菌群[12]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化功能[4-5]。不過(guò)，益生菌的有益作用很大程度上取決于它們的生存能力，而這取決于其對(duì)飼料加工、儲(chǔ)存和飼糧在胃腸道消化過(guò)程中不利環(huán)境的耐受性[13]。微囊化包被可以通過(guò)形成微囊覆蓋活的益生菌，進(jìn)而提高益生菌對(duì)存活不利的胃和膽汁豐富的小腸環(huán)境的抵御能力[4]，提高益生菌的存活率；而保護(hù)劑包被則可以將保護(hù)劑捕獲在載體材料中，并通過(guò)促進(jìn)控釋和優(yōu)化作用部位的傳遞，增強(qiáng)益生菌的功效[14]。基于前人的研究成果，為進(jìn)一步驗(yàn)證包被益生菌的應(yīng)用效果，本試驗(yàn)旨在研究雙層包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能、臭味物質(zhì)排放以及腸道菌群的影響，為植物乳桿菌和屎腸球菌在肉雞養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用植物乳桿菌菌株LP15-1和屎腸球菌菌株RS047均為本課題組保藏菌種。包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌采用國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院專利技術(shù)(ZL 201310218187.8)生產(chǎn)(包括微囊化包被和保護(hù)劑包被)，活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼糧

本試驗(yàn)選取1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞公雞144只，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只雞。各組肉仔雞初始體重之間無(wú)顯著差異(P<0.05)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加1 g/kg包被植物乳桿菌(ELP組)、1 g/kg包被屎腸球菌(EEF組)和1 g/kg包被植物乳桿菌+1 g/kg包被屎腸球菌(ELE組)的飼糧?；A(chǔ)飼糧參照我國(guó)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，為玉米-豆粕型飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)期42 d，分為1～21日齡和22～42日齡2個(gè)階段。

1.3 飼養(yǎng)管理和樣品采集

本試驗(yàn)采用4層籠養(yǎng)，雞舍環(huán)境溫度第1周保持在32～35 ℃，隨后逐漸降低到25 ℃，23 h光照，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種，自由采食和飲水。每天07:00、13:00和17:00各投料1次，監(jiān)測(cè)雞群健康狀況并記錄死淘雞數(shù)。分別于試驗(yàn)第21和42天，每重復(fù)隨機(jī)取1只雞，翅靜脈采血于促凝管中，2 000×g、4 ℃離心15 min，制備血清，存于-20 ℃?zhèn)錅y(cè)。雞只采血后，二氧化碳窒息后頸靜脈放血致死，取肝臟于-20 ℃保存。試驗(yàn)第42天，雞只采血后取盲腸食糜，以重復(fù)為單位收集糞便并取樣于離心管中，-80 ℃保存待測(cè)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content1～21日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of ageL-賴氨酸鹽酸鹽 L-Lys·HCl0.03L-蘇氨酸 L-Thr0.01合計(jì) Total100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)12.4712.62粗蛋白質(zhì) CP 21.5120.23鈣 Ca0.990.95總磷 TP0.660.66有效磷 AP0.420.43賴氨酸 Lys 1.151.05蛋氨酸 Met0.560.44蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.910.78

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于試驗(yàn)第21和42天，禁食12 h后，每只雞逐只稱重，以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)采食量，分別計(jì)算1～21日齡、22～42日齡和1～42日齡的ADG、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 免疫和抗氧化功能

按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥法和比色法測(cè)定血清和肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)。采用雞特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(北京華英生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量。

1.4.3 臭味物質(zhì)排放

根據(jù)Knarreborg等[15]的方法，采用高效液相色譜法測(cè)定糞便中吲哚和糞臭素(3-甲基吲哚)含量。

1.4.4 腸道菌群

采用北京諾禾致源科技股份有限公司的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)盲腸食糜微生物區(qū)系進(jìn)行分析，主要包括DNA提取、16S rRNA PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增子測(cè)序和序列數(shù)據(jù)處理[16]。采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分析腸道菌群物種的alpha多樣性，并在門和屬水平上比較優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相對(duì)豐度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，1～21日齡，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞末重和ADG顯著提高(P<0.05)，其中ELP組末重和ADG比對(duì)照組分別提高了12.77%和13.86%；22～42日齡和1～42日齡，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞末重、ADG、ADFI和F/G均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞免疫功能的影響

由表3可知，21日齡，與對(duì)照組相比，ELE組肉雞血清IgG和IgA含量顯著提高(P<0.05)，EEF組血清IgA和IgM含量顯著提高(P<0.05)；42日齡，各組肉雞血清IgG、IgA和IgM含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。21和42日齡，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞血清TNF-α、IL-2和IL-6含量顯著降低(P<0.05)，血清IL-10含量顯著提高(P<0.05)；其中，ELE組血清IL-10含量最高，血清TNF-α、IL-6和IL-2含量最低。

表2 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

表3 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞免疫功能的影響

2.3 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞抗氧化功能的影響

由表4可知，21日齡，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC顯著提高(P<0.05)，血清MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；其中，ELE組血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC最高。42日齡，ELP組、EEF組和ELE組肉雞血清GSH-Px和SOD活性顯著提高(P<0.05)，EEF組和ELE組血清MDA含量顯著降低(P<0.05)；其中ELE組血清GSH-Px和SOD活性最高，血清MDA含量最低。21和42日齡，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞肝臟GSH-Px、SOD活性和T-AOC顯著提高(P<0.05)，肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05)；其中，ELE組肝臟GSH-Px、SOD活性和T-AOC最高，肝臟MDA含量最低。

表4 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞抗氧化功能的影響

2.4 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞糞便臭味物質(zhì)排放的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，ELP組肉雞糞便中糞臭素含量顯著降低(P<0.05)，糞便中吲哚含量有降低趨勢(shì)(P>0.05)；EEF組和ELE組糞便中吲哚和糞臭素含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞盲腸菌群的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，ELP組肉雞盲腸菌群Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著提高(P<0.05)，表明飼糧添加包被植物乳桿菌顯著提高肉雞盲腸菌群的物種豐富度；EEF組和ELE組盲腸菌群α多樣性相關(guān)指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由表7可知，在門水平，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞盲腸菌群相對(duì)豐度無(wú)顯著差異(P>0.05)，各組優(yōu)勢(shì)菌群都為厚壁菌門(Firmicutes)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)。在屬水平，與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組盲腸菌群中未鑒別毛螺菌科(unidentified Lachnospiraceae)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，ELP組和EEF組梭菌目(Clostridiales)相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，ELP組糞桿菌屬(Faecalibacterium)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)、f_瘤胃球菌科(f_Ruminococcaceae)相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，ELP組、EEF組和ELE組肉雞盲腸乳桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度分別提高了20.11倍、8.61倍和16.22倍(P>0.05)。

表5 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞糞便臭味物質(zhì)排放的影響

表6 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞盲腸菌群alpha多樣性的影響

表7 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞盲腸菌群相對(duì)豐度的影響

3 討 論

3.1 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

已有大量研究指出，飼糧添加植物乳桿菌和屎腸球菌能夠提高肉雞生長(zhǎng)性能[17-19]。Wang等[12]在飼糧中添加屎腸球菌未改善肉雞生長(zhǎng)性能，但能改善磷的吸收和骨礦化。Ding等[9]在飼糧中添加植物乳桿菌未改善肉雞生長(zhǎng)性能，但降低了死亡率。飼糧添加植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)生長(zhǎng)性能的影響不同的原因可能是因?yàn)榫甑念悇e和活性、肉雞品種、飼喂方式和環(huán)境的不同[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌及其組合顯著提高肉雞1～21日齡末重和ADG，其中ELP組的末重和ADG比對(duì)照組分別提高了12.77%和13.86%。飼糧添加植物乳桿菌和/或屎腸球菌可能因?yàn)樵黾恿四c道中益生菌的豐度，從而能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，以此來(lái)增強(qiáng)腸道的消化、吸收和代謝功能，進(jìn)而提高肉雞生長(zhǎng)性能[18]。

3.2 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞免疫功能的影響

免疫球蛋白在免疫調(diào)節(jié)和黏膜防御中發(fā)揮著重要作用[21]，其中IgG、IgA和IgM分別通過(guò)清除病原微生物、黏膜上抗原和溶解細(xì)菌以及中和病毒發(fā)揮作用[22]。細(xì)胞因子的產(chǎn)生是炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制，過(guò)度產(chǎn)生或不適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生促炎細(xì)胞因子會(huì)加劇炎癥和組織破壞[23]。細(xì)胞因子主要由Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌，Th1細(xì)胞在病毒或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染后產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-2和TNF-α，Th2細(xì)胞在感染后分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10和白細(xì)胞介素-13(IL-13)[24]。Mollazadeh等[25]研究指出，IL-10是氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子[即TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和干擾素-γ(INF-γ)]的抑制劑。因此，免疫球蛋白和細(xì)胞因子分別通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫反映機(jī)體免疫功能。Dong等[4]和Ding等[9]研究表明，飼糧添加微囊化屎腸球菌顯著提高了肉雞血清IgA含量，添加植物乳桿菌15-1提高了21日齡肉雞血清IgA和IgG含量；飼糧添加屎腸球菌抑制了肉雞脾臟IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表達(dá)，促進(jìn)了IL-10基因的表達(dá)[5]；飼糧添加植物乳桿菌提高了肉雞回腸黏膜IL-10基因的表達(dá)[7]，降低了回腸IL-2、IL-4、INF-γ和TNF-α含量[8]；飼糧添加嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和屎腸球菌的混合物降低了肉兔血清TNF-α、IL-1β和INF-γ含量，提高了血清IgA和IgG含量[26]。本研究與前人研究結(jié)果一致，飼糧添加包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌及其組合顯著提高了肉雞血清IL-10含量，降低了血清TNF-α、IL-6和IL-2含量，其中二者聯(lián)合使用改善細(xì)胞因子效果最強(qiáng)，且能顯著提高21日齡血清IgG和IgA含量。植物乳桿菌和屎腸球菌通過(guò)調(diào)節(jié)肉雞的細(xì)胞免疫和體液免疫能力，對(duì)雞的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力可能是通過(guò)平衡促炎和抗炎反應(yīng)來(lái)激活免疫反應(yīng)，以保護(hù)機(jī)體免受病原體入侵，并維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[7]。

3.3 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞抗氧化功能的影響

GSH-Px、SOD和T-AOC等重要抗氧化酶是抗氧化損傷的第一道防線[27]，MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，它們可以共同反映機(jī)體抗氧化的潛在能力。研究表明，飼糧添加屎腸球菌和植物乳桿菌顯著降低肉雞血清MDA含量，提高血清SOD活性[4,23]，表明屎腸球菌和植物乳桿菌可以通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)緩解氧化應(yīng)激。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌及其組合提高了肉雞血清和肝臟GSH-Px、SOD活性和T-AOC，并降低了血清和肝臟MDA含量，其中ELE組抗氧化效果最好。植物乳桿菌和屎腸球菌提高機(jī)體抗氧化能力可能是通過(guò)激活和轉(zhuǎn)移核因子來(lái)誘導(dǎo)抗氧化防御系統(tǒng)各種酶的表達(dá)，從而促進(jìn)清除活性氧，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，并促進(jìn)抗氧化功能的提升[28]。

3.4 包被植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)肉雞臭味物質(zhì)排放和腸道菌群的影響

氨、硫化物、揮發(fā)性脂肪酸、糞臭素和吲哚是動(dòng)物糞便中最常見(jiàn)的臭味物質(zhì)，也是導(dǎo)致肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)氣味的主要因子。已有研究指出，飼糧添加益生菌可以減少氨氣的排放[10]，但未有研究報(bào)道益生菌是否影響家禽糞臭素和吲哚的排放。本研究結(jié)果表明，飼糧添加包被植物乳桿菌降低了肉雞糞便中吲哚和糞臭素含量，其可能是因?yàn)橹参锶闂U菌增加了腸道內(nèi)有益菌數(shù)量，使得消耗的氨基酸含量增加，從而抑制了色氨酸轉(zhuǎn)化為糞臭素；同時(shí)，飼糧添加植物乳桿菌能夠提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率[18]，進(jìn)而降低了臭味物質(zhì)的排放。

腸道菌群是腸道生態(tài)的重要組成部分，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物能夠改善家禽營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、代謝以及整體健康和生長(zhǎng)性能[29]。菌群多樣性直接影響菌群穩(wěn)定性和抵抗致病菌的能力[30]，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映菌群豐富度，其值越大，表明菌群豐富度和多樣性越大。本研究結(jié)果表明，飼糧添加包被植物乳桿菌顯著提高肉雞盲腸菌群Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，表明植物乳桿菌顯著提高了菌群豐富度，而菌群多樣性增加可以降低糞臭素的排放[31]，這進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)的結(jié)果。此外，飼糧植物乳桿菌能夠增加肉雞腸道菌群的豐度，可能通過(guò)改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而增強(qiáng)腸道消化、吸收和代謝功能[18]，最終提高肉雞生長(zhǎng)性能。

本研究結(jié)果表明，飼糧添加包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌及其組合未顯著影響肉雞盲腸菌群門水平上的微生物組成，其優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門，其次是擬桿菌門。厚壁菌門內(nèi)的細(xì)菌參與各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和改善宿主的健康[30]。飼糧添加微囊化屎腸球菌和植物乳桿菌B1均能減少肉雞盲腸大腸桿菌的數(shù)量，增加盲腸乳酸菌的數(shù)量[4,8]。Wang等[12]研究指出，飼糧添加屎腸球菌抑制了潛在致病菌糞桿菌屬的增殖，上調(diào)了瘤胃球菌科的相對(duì)豐度。瘤胃球菌科能夠增加丁酸鹽產(chǎn)量，而丁酸是腸上皮細(xì)胞重要的能量底物[32]。乳桿菌屬通過(guò)降低pH或改變受體來(lái)產(chǎn)生多種短鏈脂肪酸和細(xì)菌素發(fā)揮抑菌或殺菌作用[33]。本研究結(jié)果表明，在屬水平，與對(duì)照組相比，ELP組肉雞盲腸糞桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低，f_瘤胃球菌科相對(duì)豐度顯著提高，乳酸菌屬相對(duì)豐度無(wú)顯著差異，但提高了20.11倍。結(jié)果提示，飼糧添加包被植物乳桿菌降低了肉雞盲腸有害菌豐度，提高了有益菌豐度，而病原菌的減少可能有助于維持腸道的正常功能，進(jìn)而提高生長(zhǎng)性能[30]。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加包被植物乳桿菌能夠顯著提高肉雞21日齡末重、1～21日齡ADG和42日齡腸道菌群豐富度，降低盲腸糞桿菌屬相對(duì)豐度以及糞便中糞臭素和吲哚含量。

② 飼糧添加包被植物乳桿菌和包被屎腸球菌及其組合均能顯著提高肉雞免疫和抗氧化功能，且聯(lián)合添加效果更佳。