代 鵬 姜雅慧 王之盛

(1.四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產高校重點實驗室，成都611130；2.四川農業(yè)大學動物科技學院，成都611130)

提高飼糧內富含碳水化合物的飼料原料比例是反芻動物生產中提高生產效率的普遍手段，但瘤胃內微生物的發(fā)酵速率顯著加快，揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的產生速率大于瘤胃上皮的吸收和代謝速率，導致瘤胃VFA蓄積、pH降低、菌群紊亂，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)，現主要的SARA評定標準為瘤胃內低pH狀態(tài)超過3 h/d，且維持在5.2～5.8[1]。SARA擾亂了瘤胃發(fā)酵，破壞了瘤胃上皮完整性，降低了飼料消化率和營養(yǎng)物質代謝率，還誘發(fā)腹瀉、局部炎癥、肝膿腫、蹄病以及乳脂下降綜合征等疾病，進一步發(fā)展為酸中毒，還會導致休克或死亡，影響反芻動物的生存和生產[2-3]。丁酸占總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid，TVFA)的比例為10%～20%，參與反芻動物的能量代謝，其生理功能較為活躍[4]。研究發(fā)現，丁酸具有促進反芻動物胃腸道發(fā)育、改善瘤胃屏障功能、維持胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、抵抗炎癥等生理功能[5]。作為信號分子的丁酸還能通過細胞膜上的G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPRs)激活下游信號通路，調控細胞炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白等的表達，從而緩解炎癥反應和改善屏障功能[6]。

1 丁酸的概述及在反芻動物體內的生成

丁酸又稱酪酸，是產丁酸菌利用碳水化合物發(fā)酵合成的一元羧酸，在瘤胃內主要通過被動轉運、離子交換等多種轉運方式被瘤胃壁吸收，進入瘤胃上皮細胞后參與能量代謝[7]。丁酸能以β-羥基丁酸(β-hydroxybutyrate，BHBA)形式為反芻動物供能，還是乳脂和體脂的前體物。在反芻動物瘤胃中，丁酸梭菌是主要產丁酸菌，飼料中的蔗糖、纖維二糖和乳糖等碳水化合物被其產生的胞外酶水解成小分子單糖，進入細胞胞漿后又在酶的作用下進行糖酵解，最終轉化成丁酸[8-10]。丁酸的合成過程中，關鍵步驟是丁酰輔酶A的生成，限速酶是鐵氧還原蛋白氧化還原酶，由于其對氧的敏感性決定了丁酸的產量與厭氧程度呈正相關。瘤、網胃壁吸收丁酸后，在上皮細胞中轉化為BHBA，再被瘤胃上皮基底側細胞膜上的轉運蛋白轉運入血液，最終被機體代謝產能。丁酸在瘤胃上皮細胞中經酰基輔酶A合成酶縮合生成乙酰輔酶A[11]，且主要有2條去路：一是直接進入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)代謝產能，為瘤胃上皮細胞ATP的產生提供了主要來源[9]；二是在3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA)合成酶、HMG-CoA裂解酶和BHBA脫氫酶的作用下進行生酮反應，最終將乙酰輔酶A轉化為BHBA，后進入血液循環(huán)為機體供能[12]。丁酸梭菌產生丁酸的主要生化反應途徑見圖1。

Glucose：葡萄糖；HK：己糖激酶 hexokinase；G-6-P：葡萄糖-6-磷酸 glucose-6-phosphatase；GPI：葡萄糖磷酸異構酶 glucose phosphate isomerase；F-6-P：果糖-6-磷酸 fructose-6-phosphate；PFK-1：磷酸果糖激酶-1 phosphofructokinase-1；F-1,6-BP：果糖1,6-二磷酸 fructose 1,6-diphosphate；ALDO：醛縮酶 aldolase；DHAP：磷酸二羥丙酮 dihydroxyacetone phosphate；TPI：磷酸丙糖異構酶triosephosphateisomerase；G3P：3-磷酸-甘油醛 3-phosphoricacid-glyceraldehyde；GAPDH：磷酸甘油醛激酶 phosphoglyceraldehyde kinase；1,3-BP-glycerate：1,3-二磷酸-甘油酸 1,3-diphosphate-glyceric acid；PGK：磷酸甘油酸激酶 phosphoglyceric kinase；3-P-glycerate：3-磷酸-甘油酸 glycericacid-3-phosphoric acid；PGM：磷酸甘油酸變位酶 phosphoglyceromutase；2-P-glycerate：2-磷酸-甘油 2-phosphate-glycerol；ENO：烯醇化酶 enolase；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸 phosphoenolpyruvic acid；PK：丙酮酸激酶 pyruvate kinase；Pyruvate：丙酮酸；PFOR：丙酮酸中還原酶 pyruvate ferredoxinoxidoreductase；Acetyl-CoA：乙酰輔酶A acetyl coenzyme A；THL：硫解酶 thiolase；Acetoacetyl-CoA：乙酰乙酰輔酶A acetoacetyl coenzyme A；BHBD：β-羥乙酰輔酶A脫氫酶 β-hydroxylacetyl coenzyme A dehydrogenase；β-hydroxybutyryl-CoA：β-羥乙酰輔酶A β-hydroxyacetyl coenzyme A；ECH：烯酰輔酶A水化酶 enyl coenzyme A hydration enzyme；Crotonyl-CoA：巴豆酰輔酶A crotonyl coenzyme A；Butyryl-CoA：丁酰輔酶A butyryl coenzyme A；PTB：丁酰磷酸轉移酶 butyryl phosphate transferase；Butyryl-P：丁酰磷酸 butyryl phosphate；BK：丁酸激酶 butyrate kinase；Butyrate：丁酸；ACS：?；o酶A合成酶 acyl-coenzyme A synthetase；ATP：三磷酸腺苷酶 adenosine triphosphatase；HMGCL：3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A裂解酶 3-hydroxy-3-methylglutarate monoacyl coenzyme A lyase；MCT：單羧酸轉運蛋白體 monocarboxylic acid transporter。

2 SARA對反芻動物的影響

2.1 破壞瘤胃上皮的屏障功能

瘤胃上皮結構的完整、細胞吸收功能的高度選擇性和緊密連接蛋白將細胞層緊密連接構成了瘤胃上皮的生理屏障，阻斷了瘤胃內的微生物和瘤胃異常代謝產物通過跨細胞途徑隨營養(yǎng)物質或旁細胞途徑進入血液[13]。其中，瘤胃上皮細胞間緊密連接因具有維持細胞極性、調控小分子物質的跨上皮轉運、阻礙有害物質跨上皮入體的功能，決定了瘤胃上皮的通透性[14]。SARA能夠導致瘤胃上皮角質層脫落和損傷，基底層、顆粒層、棘突層變薄，破壞細胞間緊密連接和上皮完整性，增加上皮的通透性[15-16]。生產中常飼喂高精料飼糧引起瘤胃內pH降低和產生高濃度脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，進而誘發(fā)SARA，導致瘤胃上皮的通透性和屏障功能受損。LPS主要能夠提高細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellular signals regulate protein kinases，ERK)1/2磷酸化比例，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)/ERK1/2信號通路，抑制緊密連接蛋白轉錄后機制，降低緊密連接蛋白表達[17]。此外，LPS還能夠激活LPS/Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)-核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)/MAPK信號通路，抑制核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)基因的表達，抑制細胞的抗氧化應激系統(tǒng)[18]，引起細胞的氧化應激，增加細胞的凋亡比例[18-20]。

2.2 誘發(fā)炎癥反應

瘤胃內持續(xù)的的低pH狀態(tài)導致瘤胃內的革蘭氏陰性菌大量裂解和死亡以及促進某些細菌釋放組氨酸脫羧酶，增加瘤胃中LPS和組胺的濃度[21-22]。LPS和組胺通過細胞旁途徑易位進入血液和淋巴液參與體循環(huán)，激活系統(tǒng)炎癥并引起保護性免疫反應[23-24]。LPS和組胺等毒素誘導的急性期反應就是這種免疫的一部分，如LPS誘導脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)濃度增加[25]。LPS和LBP形成復合物和組胺又通過上調信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平，激活炎癥相關的信號通路，促進炎癥因子mRNA和蛋白的表達，誘導炎癥反應的發(fā)生[26-28]。首先，LPS-LBP復合物催化轉移至CD14，并與TLR-4和髓樣分化蛋白-2(myeloid differential protein-2，MD-2)結合成復合物，再被巨噬細胞膜內受體識別，活化下游的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等[26]?；罨蟮难装Y因子和LPS誘導核因子-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)家族的抑制劑蛋白(包括IκBa、IκBb、IκBg和IκBe)和p38迅速磷酸化，激活NF-κB/MAPK，致使NF-κB p50/p65二聚體與IκB分離易位至細胞核內與DNA結合，p38發(fā)生核轉位，誘導靶基因的轉錄，促進炎癥因子mRNA的表達[27,29]。SARA還能夠增加機體中組胺的濃度，上調組胺特異性受體mRNA的表達，激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)/NF-κB或蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/NF-κB信號通路促發(fā)炎癥反應。機體中的組胺除了從瘤胃中易位的外，炎癥因子和LPS還分別誘導嗜堿性粒細胞和巨噬細胞合成并釋放組胺，增加機體內組胺的濃度[30]。LPS與LBP形成的復合物活性的增強和組胺濃度的增加進一步加劇了局部和全身的炎癥反應。

3 丁酸緩解SARA的影響機制

3.1 改善瘤胃上皮的屏障功能

3.1.1 加強瘤胃上皮的緊密連接

丁酸除了作為瘤胃上皮細胞的能量底物，還可以作為信號分子和酶的抑制劑，促進反芻動物胃腸道的發(fā)育進而改善胃腸道的屏障功能。丁酸作為機體的信號分子識別細胞膜上的GPRs，隨后調控下游的信號通路，如抑制MAPK、PKC等信號通路，進而促進緊密連接相關蛋白的表達[31]。在高精料飼糧誘導山羊瘤胃上皮的損傷試驗中，丁酸鈉鹽就通過抑制PKC和MAPK信號通路逆轉了瘤胃上皮的緊密連接損傷，減輕了高精料飼糧對瘤胃上皮的損傷[32]。在斷奶羔羊飼糧中添加丁酸鈉還降低了NF-κB蛋白表達量，抑制炎癥因子的表達；同時，促進了閉合蛋白(Occludin)、封閉蛋白(Claudin)和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein 1，ZO-1)蛋白的表達，增強了細胞間的緊密連接[31]。

3.1.2 促進瘤胃上皮細胞的生長

瘤胃上皮屏障功能的完善需要瘤胃上皮間的緊密連接和具有高度選擇性的瘤胃上皮細胞共同完成，因此瘤胃上皮細胞的增殖和凋亡至關重要[13]。已有研究發(fā)現，丁酸鈉能夠通過調控犢牛和山羊瘤胃上皮細胞的增殖、分化和凋亡，調控瘤胃上皮的生理功能[33-34]。哺乳動物細胞(包括瘤胃上皮細胞)的增殖主要由細胞周期決定，而細胞周期又分為4個階段：G1期、S期、G2期、M期，縮短或延長任何一個階段都會對細胞周期產生影響。通過對山羊屠宰前瘤胃灌注丁酸(0.3 g/kg BW)發(fā)現，丁酸顯著上調了參與細胞周期調控的調控因子：細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E1、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B以及細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)1、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA的表達，縮短了細胞周期，增加了瘤胃上皮的細胞層數和瘤胃乳頭的長度、寬度[35]。其中，細胞周期蛋白D1、CDK2、CDK4和CDK6參與調控G0/G1期；細胞周期蛋白E1參與調控G1/S期；細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B和CDK1參與調控S/M期。細胞周期蛋白D1與CDK4/6形成的復合物，主要促進細胞從G1早期到中期[36]，而細胞周期蛋白E1/CDK2形成的復合物，只要是使細胞周期進入至G1/S晚期[37]。Malhi等[34]研究也發(fā)現，丁酸通過上調細胞周期蛋白D1，縮短了G1期，促進了瘤胃上皮細胞的生長。同時，丁酸在促進細胞快速增殖的過程中也促進了細胞的凋亡[35]。研究發(fā)現，丁酸上調了瘤胃組織中p21的mRNA的表達水平，p21具有抗增殖的作用，通過與CDK結合，在G0/G2期的任何階段阻止細胞周期的發(fā)展，但值得注意的是，丁酸誘導的增殖的比例大于凋亡，最終促進細胞的增殖[35,38]。Kowalski等[39]在奶牛飼糧中添加丁酸還發(fā)現，丁酸顯著增加了生長期奶牛瘤胃乳頭長度和瘤胃肌肉層的厚度，并且增強了產犢后泌乳奶牛的瘤胃適應產后飼料的潛力且不影響泌乳性能。同時，丁酸通過調節(jié)激素和生長因子[34,40]、影響組蛋白乙?；虻谋磉_[41]、刺激微生物發(fā)酵產物的吸收和代謝[42]，也間接促進了瘤胃上皮細胞的生長。

3.2 緩解SARA引發(fā)的炎癥反應

3.2.1 作為信號分子抑制炎癥反應

丁酸作為瘤胃中VFA的一種，具有顯著的抗炎、抗氧化、調節(jié)細胞增殖/凋亡功能[43-45]，并且作為GPRs的配體，能夠被細胞膜上GPRs識別調節(jié)下游的信號通路[6]。Shen等[46]通過對山羊瘤胃上皮轉錄組分析發(fā)現，瘤胃上皮細胞中存在20個GPRs家族成員，并參與維持上皮細胞的完整性和調控動物的生長。Chang等[47]在奶山羊飼糧中添加丁酸鈉(1% BW)也發(fā)現，丁酸鈉顯著降低了炎癥因子及GPR41/GPR43 mRNA的表達，降低GPR41/43、ERK1/2和p38的蛋白表達水平，緩解了山羊盲腸黏膜的炎癥損傷。丁酸鈉還改變了GPR41/43基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化和染色質壓實的比例[48]，需要指出的是，DNA甲基化和染色質重塑也有助于丁酸鈉的抗炎作用。此外，高精料飼糧添加丁酸鈉還能夠顯著提高瘤胃中的pH，降低瘤胃中的LPS、γ-D-谷氨?；?內消旋-二氨基庚二酸(γ-D-Glu-mDAP，IE-DAP)和炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的濃度，顯著下調核苷酸結合寡聚化域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1，NOD1)、pp65、p-IκBα、p-NF-κB/p-p65、p-ERK1/2、p-c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase JNK)、p-p38蛋白表達以及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2,9的活性，抑制LPS-NOD1/NF-κB炎癥通路緩解反芻動物瘤胃上皮、乳腺、肝臟等局部炎癥的發(fā)生[44,48-50]。

3.2.2 作為組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACIs)抑制炎癥反應

丁酸還能夠作為HDACIs抑制組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的活性，抑制組蛋白乙酰基的去除，促進組蛋白的乙?；剑种苹蜣D錄[51]，其中，DNA結合組蛋白的乙?；?，調控著染色質結構和轉錄因子的結合親和力，影響基因的表達[52]。最新的研究發(fā)現，HDACIs通過促進HDAC的乙酰化，抑制LPS刺激而引發(fā)的磷酸化，促進了HDAC3的活性，上調NF-κB p65賴氨酸216處的乙?；?，抑制NF-κB信號通路的激活[53]。且在人體結腸中的研究已證實丁酸是一種強抑制劑，能夠抑制80% HDAC1/2的活性[54]。Shen等[46]對山羊瘤胃上皮進行轉錄組典型相關分析(canonical correlation analysis，CCA)發(fā)現，瘤胃微生物衍生的丁酸摩爾比值與HDAC1的表達呈高度負相關，證明在反芻動物中丁酸也是HDAC1強有效的抑制因子。Sun等[55]進一步對永生化奶牛乳腺上皮細胞的研究發(fā)現，添加丁酸鈉或組蛋白去乙?；锩敢种苿┣乓志谹(trichostatin A，TSA)對乳腺細胞預處理18 h后，丁酸鈉除了能夠下調LPS引起的組蛋白H3乙?；鞍棕S度升高，還能夠降低炎癥因子轉錄水平、p-IκBα/IκBα和p-p65/p65蛋白豐度的比值以及NF-κB p65蛋白核定位水平，通過抑制NF-κB信號傳導的翻譯后機制減輕了乳腺細胞的促炎反應。同時，在奶山羊高精料飼糧中添加丁酸鈉(1% BW)也發(fā)現，丁酸鈉能夠降低奶山羊肝臟和乳腺中的HDAC3蛋白的表達，緩解SARA引起的肝臟和乳腺炎癥損傷[48,56]。丁酸對屏障功能和抗炎作用的機制見圖2。

Butyrate：丁酸根離子；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；TLR-4：Toll樣受體-4 Toll-like receptor-4；CD14：LPS受體 lipopolysaccharide receptor；LBP：脂多糖結合蛋白 LPS binding protein；GPR：G蛋白偶聯受體G protein-coupled receptor；TIRAP：Toll/白細胞介素-1受體域銜接因子蛋白 Toll-interleukin-1 receptor domain containing adaptor protein；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation protein 88；TOLLIP：Toll樣受體接頭蛋白 Toll-like receptor connector protein；IRAK：白細胞介素受體相關激酶 interleukin receptor-associated kinase；PKR：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶 double-stranded RNA-dependent protein kinase；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關因子 tumornecrosisfactor receptor associated factor；TAK：轉化生長因子激酶 transformed growth factor kinase；NIK：核因子-κB誘導激酶 NF-κB induces kinase；MKK/MEK：絲裂原活化蛋白激酶激酶 mitogen-activated protein kinase kinase；MEKK：絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶 mitogen-activated protein kinase kinase kinase；p38：p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen-activated protein kinase；JNK：c-Jun 氨基末端激酶 c-Jun amino-terminal kinase；IκB：核因子-κB抑制蛋白 nuclear factor-κB inhibitor protein；IKK：核因子-κB抑制蛋白激酶 nuclear factor-κB inhibitor protein kinase；p65/p50：核因子-κB1二聚體蛋白 nuclear factor-κB1 dimer protein；ELK-1：轉錄激活因子ETS樣蛋白1 transcriptional activator ETS like protein-1；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體 peroxisome proliferator activated receptor；Occludin：閉合蛋白；Claudin-1：封閉蛋白；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1 zonula occludens protein 1；cytokines：細胞因子；adhesions：黏附因子；HDPs：宿主防御肽 host defense peptides；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；IL-6：白細胞介素-6 interleukin-6；IL-1β：白細胞介素-1β interleukin-1β。

4 小 結

SARA引起了瘤胃發(fā)酵紊亂、瘤胃上皮屏障功能受損以及炎癥反應。丁酸作為瘤胃產生的代謝物之一，能促進組織生長發(fā)育修補已損傷的瘤胃壁和增加瘤胃壁的抵抗力、調控瘤胃上皮細胞的增殖周期；丁酸作為信號分子調控了瘤胃上皮中緊密連接蛋白的表達，改善了瘤胃上皮的屏障功能。另外，丁酸作為信號分子和HDACIs通過NF-κB和MAPK等信號通路直接或間接抑制炎癥因子的表達，緩解局部性和全身性炎癥反應。