白 貞，沈 建，徐文其，趙昕源，郭賽飛，馬田田

(1 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088；2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所，上海 200092)

石斑魚(Epinephelussp)滋味鮮美，肉質(zhì)嫩滑，逐漸成為中國東海南部和南海地區(qū)的重要經(jīng)濟養(yǎng)殖品種[1]。2020年，中國石斑魚捕撈與養(yǎng)殖總產(chǎn)量已經(jīng)達到28.3萬t，已成為深受國內(nèi)消費者喜愛的高端海鮮品種[2]。其中，廣東省與海南省為石斑魚的主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的78.2%[2]。石斑魚產(chǎn)量地域性特征明顯，為滿足內(nèi)陸消費者對其的消費需求，石斑魚的高效長途運輸十分重要。石斑魚對脅迫的應(yīng)激反應(yīng)十分劇烈，如果操作不當，極易造成品質(zhì)惡化和死亡，嚴重影響了石斑魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)與運輸流通[3-4]。

目前，魚類麻醉主要有化學(xué)麻醉和物理麻醉兩種[5]。物理麻醉方法主要分為生態(tài)冰溫麻醉與電麻醉兩種，物理麻醉方法沒有禁藥期，也沒有藥物殘留風(fēng)險[5-6]。電麻醉無須長時間的低溫馴化，麻醉用時短，已經(jīng)成功地運用在受精取卵、疫苗注射、標志流放等魚類外科操作上[7]。但目前國內(nèi)外針對電麻醉的研究，主要局限在淡水魚，對海水養(yǎng)殖魚類涉及較少；并且由于不同品種、規(guī)格的魚對電擊的承受能力有較大差異，電麻醉參數(shù)、效果各有不同；總體而言，電麻醉技術(shù)還處于探索階段。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

本試驗選用人工養(yǎng)成后上市的鮮活珍珠龍膽石斑魚，采購于上海江楊水產(chǎn)市場，體質(zhì)量500 ± 50 g。

采用充氣有水運輸至實驗室，停食暫養(yǎng)24 h后進行試驗。暫養(yǎng)條件參考朱乾峰[3]研究結(jié)果，設(shè)置為：循環(huán)過濾人工海水，曝氣24 h，鹽度22～25，水溫26 ±1℃，溶氧6～8 mg/L。

1.2 儀器與設(shè)備

LR-24便攜式魚類電麻醉設(shè)備，美國SMITH-ROOT公司(輸出電壓50～990V ，輸出頻率1～120 Hz ，輸出功率25～400 W ，通電區(qū)域1 000 mm×400 mm可調(diào)節(jié))；SpectraMax i3多功能酶標儀，美國美谷分子儀器公司；VS-15000CFNⅡ高速冷凍離心機(轉(zhuǎn)速0～15 000 r/min) ，上海民儀電子有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)試劑盒，魚皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均來自南京建成生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 行為學(xué)試驗

參考Chatakondi[8]的研究結(jié)果，采用標準脈沖直流電作為電源，占空比25%，頻率30 Hz。 根據(jù)石斑魚體質(zhì)量進行預(yù)試驗篩選，設(shè)定試驗電壓范圍為80～150 V，電擊時間3 s，每間隔10 V設(shè)置一個試驗梯度。試驗時，每次迅速將一尾魚撈起投入電麻醉水箱(500 mm ×400 mm)，電擊3 s后撈出投入暫養(yǎng)水箱，觀察并記錄試驗魚行為狀態(tài)、休眠時間。每12尾魚為一個試驗組，每尾魚僅實驗1次。試驗后統(tǒng)計不同試驗組石斑魚的麻醉率以及72 h存活率。

1.3.2 血液生化指標測定

根據(jù)行為學(xué)試驗結(jié)果，優(yōu)選100 V、110 V、120 V 3個電壓梯度，將試驗魚電擊后的即刻標記為0 h,分別在電擊后的0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h抽取血液，測定指標。另取一對照組，不經(jīng)任何電擊處理，標記為0 V。

每次抽血時隨機挑選3條試驗魚，迅速從恒溫養(yǎng)殖箱中撈起，采用一次性注射器尾靜脈或尾動脈取血，取血量約為2 mL，每尾魚僅抽取一次血液。取血后將血液室溫靜置40 min、 4℃條件下，4 000 r/min反復(fù)離心，吸取上層血清測定其谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖、乳酸以及皮質(zhì)醇含量。

1.4 指標測定

1.4.1 完全麻醉狀態(tài)

參照馮廣朋等[9]對西伯利亞幼鱘魚電麻醉的不同階段分類，當試驗魚身體僵直，鰓動微弱，對外界刺激無條件反射能力時，認為其進入完全麻醉狀態(tài)。

1.4.2 休眠時間

電麻醉達到完全麻醉狀態(tài)的試驗魚，認為其從停止受到電擊刺激至可以自主直立游動，且對外界刺激有條件反射能力的時間為休眠時間。

1.4.3 麻醉率

將試驗魚在不同電壓下電擊3 s后，取達到完全麻醉狀態(tài)的試驗魚統(tǒng)計麻醉率，計算公式為：

(1)

式中：A表示麻醉率%；n表示進入完全麻醉狀態(tài)的試驗魚；N表示每組試驗中試驗魚總數(shù)。

1.4.4 電麻醉階段分類

參考Henyey等[10]對鱘魚電麻醉效應(yīng)的描述，將珍珠龍膽石斑魚在電麻醉通電過程中的行為表現(xiàn)分為3個階段：電刺激期、電緊張期以及電麻醉期。電刺激期試驗魚表現(xiàn)出快速游動、逃竄、掙扎等劇烈應(yīng)激行為；電緊張期試驗魚多數(shù)停止游動，肌肉震顫，身體僵直，背鰭直立，側(cè)鰭張開；電麻醉期試驗魚魚體完全僵直，鰓蓋大張，側(cè)翻或者翻肚。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2016 處理分析，結(jié)果表示為(平均值±標準差)，采用單因素ANOVA檢驗結(jié)合鄧肯檢驗法進行差異性分析，P<0.05表示差異顯著。采用Origin 2019軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 珍珠龍膽石斑魚電麻醉行為學(xué)特征

2.1.1 電麻醉時珍珠龍膽石斑魚的行為特征

與鯰魚[11]、鱘魚[9]、銅魚[12]電麻醉時的行為類似，珍珠龍膽石斑魚在通電初始表現(xiàn)為快速游動、逃逸等行為，隨著通電時間的增加，試驗魚逐漸僵直，鰓蓋大張、背鰭豎直、側(cè)鰭遠離軀干且肌肉震顫，直至試驗魚出現(xiàn)側(cè)倒或翻肚，沉入池底，進入完全麻醉狀態(tài)。當麻醉電壓小于100 V時，試驗魚幾乎無法進入完全麻醉狀態(tài)，在通電時間內(nèi)，試驗魚快速游動、掙扎劇烈，電刺激期、電緊張期時間較長，電麻醉期時間短暫甚至不表現(xiàn)出電麻醉期的行為特征；隨著電壓的增加，麻醉的前兩個階段時間不斷縮減，當麻醉電壓為100 V左右時，絕大多數(shù)試驗魚可以進入電麻醉期進而達到完全麻醉狀態(tài)，電刺激期與電緊張期的行為特征表現(xiàn)不明顯，通電過程中偶見逃竄現(xiàn)象；當電壓增加到130 V左右時，試驗魚大多通電初始便表現(xiàn)出電麻醉期的行為學(xué)特征，即鰓蓋大張、身體僵直，隨后直接進入完全麻醉狀態(tài)。

結(jié)束通電后，在完全麻醉狀態(tài)期間，試驗魚鰓蓋閉合微弱且緩慢，身體僵直，側(cè)倒于池底，對外界刺激無反應(yīng)。隨著時間增加，鰓動速度逐漸加快，幅度加大，尾柄擺動，對外界刺激有微弱反應(yīng)。隨后實驗魚進一步恢復(fù)，身體直立，鰓動正常，可以沿池壁在魚池底部緩慢游動。此時，試驗魚在無干擾的情況下行為與未電擊前幾乎無差異，但相對于對照組，仍更易于捕撈，且對捕撈、采血等脅迫表現(xiàn)出更少的掙扎，這種表現(xiàn)持續(xù)12～24 h左右。

2.1.2 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚的休眠時間及存活率

在25 ℃的水溫下，不同電壓電擊珍珠龍膽石斑魚至完全麻醉狀態(tài)后，試驗魚的休眠時間及72 h存活率如表1。從表1得，麻醉率、休眠時間與電壓成正相關(guān)，其中，當電擊電壓為80 V時，試驗魚休眠時間為0 min，即停止通電后的試驗魚放回暫養(yǎng)水缸便立即恢復(fù)正常游動狀態(tài)；當電擊電壓為100 V時，麻醉率為92%，休眠時間為17.0±3.84 min，與80 V、90 V試驗組差異顯著，(P<0.05)；電擊電壓為130 V時，試驗魚72 h存活率僅為45%。

表1 不同電壓麻醉對珍珠龍膽石斑魚的麻醉效果

2.2 不同電壓麻醉對珍珠龍石斑魚血清中酶類的影響

如圖1所示，電麻醉后試驗魚血清中GOT活力呈先上升后下降的趨勢，100 V、110 V、120 V試驗組電擊后即刻的GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)活力分別是35.92 U/L、39.99 U/L、46.15 U/L，3組數(shù)值均與對照組有顯著性差異。相較于0 h，電麻醉后4 h各試驗組珍珠龍膽石斑魚血清中GOT活力均上升達到最大值，其中120 V試驗組GOT活力最大，達53.96 U/L，與其他組別差異顯著，100 V試驗組血清 GOT 水平低于其他試驗組；麻醉4 h之后，各試驗組GOT活力均開始持續(xù)下降。

圖1 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度的變化

如圖2所示，120 V、110 V試驗組的GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活力隨時間增加而下降，100 V試驗組的血清GPT 活力則呈先下降后上升的趨勢。

圖2 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度的變化

試驗0 h時，100 V、110 V、120 V試驗組均與對照組差異顯著；試驗72 h時，110 V試驗組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力下降至185.78 U/L，與對照組差異不顯著。此時，100 V試驗組 GPT 活力試驗全程低于對照組，且差異顯著。

如圖3，各試驗組的LDH(乳酸脫氫酶)活力隨時間變化呈先下降后平穩(wěn)變化的趨勢，并且表現(xiàn)出電壓越高，LDH活力越高的特點。0 h時，3個試驗組均與對照組差異顯著，且三者之間，兩兩對比差異顯著；試驗4 h時，100 V試驗組LDH活力開始降低并達到對照組水平以下；試驗12 h時，110 V試驗組LDH活力降低至72.96 U/L，低于對照組水平；試驗48 h時，120 V試驗LDH活力仍顯著高于對照組，110 V試驗組LDH活力低于對照組且差異不顯著，100 V試驗組LDH活力低于對照組且差異顯著。

圖3 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血液中乳酸脫氫酶濃度的變化

2.3 不同電壓麻醉對珍珠龍石斑魚能量代謝的影響

如圖4所示，電麻醉后的珍珠龍膽石斑魚的血糖呈先上升后下降的趨勢，并在12 h后趨于平穩(wěn)。電麻醉后4 h試驗組達到血糖最大值。其中，120 V試驗組血糖值最高，達到1.95 mol/L；100 V試驗組血糖最低，為0.69 mol/L，與對照組無顯著性差異。試驗12 h時，110 V試驗組血糖值與對照組無顯著性差異。

圖4 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血糖的變化

電麻醉后血液中的乳酸含量變化趨勢與血糖變化相類似(圖5)。試驗4 h時，試驗組乳酸水平達到最大值，其中120 V試驗組乳酸水平遠高于其他組，為1.69 mol/L。隨著時間的增加，各試驗組乳酸含量逐漸與對照組接近。試驗12 h，3個試驗組乳酸水平全部低于對照組，且兩兩差異顯著；在麻醉后的48 h，各試驗組與對照組均沒有顯著性差異。

圖5 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血液中乳酸的變化

2.4 不同電壓麻醉對珍珠龍石斑魚皮質(zhì)醇的影響

如圖6所示， 電麻醉后血液中皮質(zhì)醇含量與電擊電壓呈正相關(guān)，電壓越大，皮質(zhì)醇含量越高。麻醉后4 h時，皮質(zhì)醇含量達到最大值，然后逐漸與對照組接近。其中，120 V、110 V試驗組皮質(zhì)醇水平在試驗全程均高于對照且差異顯著；100 V試驗組在試驗進行的4 h后與對照組沒有顯著性差異。

圖6 不同電壓麻醉珍珠龍膽石斑魚血液中皮質(zhì)醇的變化

3 討論

3.1 電麻醉對珍珠龍膽石斑魚行為學(xué)與存活率的影響

通過對珍珠龍膽石斑魚的電麻醉試驗發(fā)現(xiàn)，試驗魚在遭受電擊時表現(xiàn)出明顯的電刺激(快速游動)、電緊張(肌肉收縮)與電麻醉(肌肉放松)[10]。在其他條件一定時，電擊電壓越高，試驗魚的麻醉率越高、休眠時間越長。當電壓小于100 V時，電擊對珍珠龍膽石斑魚的脅迫效應(yīng)大于麻醉效應(yīng)，導(dǎo)致石斑魚在通電時快速竄動、劇烈掙扎，不能進入完全麻醉狀態(tài)，或者休眠時間極短，甚至斷電即蘇醒，馮廣朋等[13]對西伯利亞鱘魚(Acipenserbaerii)也有相似的研究結(jié)果；而當電壓大于120 V，除了可能出現(xiàn)的臟器損傷、脊椎損傷與出血[11]，還會造成魚復(fù)蘇后的生理紊亂[5]，影響試驗魚的存活率。電擊后復(fù)蘇的試驗魚對脅迫仍會表現(xiàn)出一定遲緩，且這種行為持續(xù)12～24 h，這與Bowzer等[14]對草魚電麻醉后得到的結(jié)果相類似。

3.2 電麻醉對珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的影響

3.2.1 電麻醉對珍珠龍膽石斑魚血清酶類的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶主要富集在肝臟細胞中，當肝臟細胞功能正常時，血液中的兩種轉(zhuǎn)氨酶活性較低且較穩(wěn)定[15]。因此，經(jīng)常通過對谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力大小判斷肝損傷情況。不同電壓電擊石斑魚至麻醉均會導(dǎo)致谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高，但麻醉12 h后，各試驗組轉(zhuǎn)氨酶活性逐漸接近對照組，100 V試驗組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在試驗全程始終低于對照組，其他試驗組在0 h時谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著性高于對照組，并在隨后逐漸下降，表明過高的電壓電擊麻醉對魚體肝臟造成一定影響。適宜的麻醉對魚類保活過程中的心臟、肝臟損傷有減緩作用[16]，對比對照組，100 V的標準脈沖直流電電擊使試驗魚在麻醉狀態(tài)下進行采血操作，對魚體的肝臟有一定保護功能，隨著麻醉狀態(tài)的消失，100 V試驗組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在8 h后隨時間推移逐漸上升也證明了這一點。

乳酸脫氫酶是糖代謝途徑中不可或缺的一種酶，廣泛存在于各個器官內(nèi)，當魚體受到外界環(huán)境刺激或組織器官發(fā)生病變、損傷時，其相對應(yīng)的機體內(nèi)環(huán)境、組織器官中的 LDH 就會發(fā)生變化[17]，無氧呼吸、心肌損傷等均會引起體內(nèi)乳酸脫氫酶活力升高[16]。本研究中，0 h時各試驗組LDH活性的升高也可能與電擊激活試驗魚體內(nèi)糖的無氧酵解過程，導(dǎo)致參與代謝的LDH大量增多并被釋放至血液中有關(guān)。與直接捕撈采血的對照組相比較，隨著時間推移，除120 V試驗組外，其他試驗組的LDH活力均逐漸低于對照組，且100 V試驗組顯著性低于其他試驗組，這可能表明電麻醉對珍珠龍膽石斑魚心肌的脅迫較小，且是可逆的。在對史氏鱘魚[18]與圓口銅魚幼魚[12]的電麻醉試驗中也認為適當?shù)碾姄魧π募缀鯖]有損傷。

3.2.2 電麻醉對珍珠龍膽石斑魚能量代謝的影響

血液中的葡萄糖為魚的各種生命活動供應(yīng)能量[19]。在應(yīng)激條件下，魚體能量消耗增加，糖原加速分解，皮質(zhì)醇等激素加大肝臟進行糖異生反應(yīng)，使得血糖進一步提高，這種現(xiàn)象稱為“應(yīng)激性高血糖癥”，廣泛地出現(xiàn)在各種魚類中[11,20-22]。Barcellos等[23]認為應(yīng)激性高血糖反應(yīng)較為靈敏且一般在出現(xiàn)后的24 h左右消失，因此可以利用血糖濃度輔助判斷魚類的應(yīng)激大小。本研究中，110 V、120 V試驗組在電擊后血糖升高，與對照組差異顯著，不適宜作為珍珠龍膽石斑魚的麻醉電壓。

機體血液中乳酸與血糖有著相應(yīng)的關(guān)系[24]。乳酸主要在機體供氧不足時，細胞供能轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒猱a(chǎn)生，血液中乳酸的濃度可以用來判斷無氧呼吸的強度[25]。本試驗中，環(huán)境溶氧充足的情況下，試驗組珍珠龍膽石斑魚血液中的乳酸可能來自受到電擊產(chǎn)生的掙扎、肌肉緊張等短時劇烈的物理活動以及電擊后，石斑魚處于麻醉狀態(tài)，緩慢微弱的呼吸。對照組試驗魚體內(nèi)的乳酸則受到捕撈采血時的應(yīng)激性物理活動影響。隨著電麻醉效應(yīng)的消失，試驗組血液中乳酸水平逐漸接近對照組，這與Trushenski等[26]對鱸魚電擊后得到的血液中乳酸濃度水平變化趨勢相類似。通過對試驗魚血糖水平、皮質(zhì)醇含量分析，100 V電擊麻醉對試驗魚的脅迫不大于對照組，同時，電擊使試驗魚迅速進入完全麻醉狀態(tài)，減少了試驗魚在隨后人工操作時的掙扎應(yīng)激，在乳酸水平上表現(xiàn)出較對照組的顯著性優(yōu)勢。在針對羅非魚(Oreochromisniloticus)[27]的電麻醉試驗中也出現(xiàn)類似情況，即在合適的電麻參數(shù)下，羅非魚體內(nèi)乳酸濃度低于直接捕撈采血的對照組。

3.2.3 電麻醉對珍珠龍膽石斑魚血液中皮質(zhì)醇水平的影響

皮質(zhì)醇被認為是魚類應(yīng)激最敏感的激素指標，在應(yīng)激后的0.5～24 h內(nèi)，皮質(zhì)醇水平可以提升至應(yīng)激前的10～100倍[28-29]。本研究中，不同實驗條件獲得的皮質(zhì)醇濃度變化曲線相類似，均在4 h時達到最高峰，隨后開始下降，類似的變化也出現(xiàn)在鱸魚幼魚[30]的電麻醉實驗中；100 V試驗組皮質(zhì)醇濃度0 h低于對照組，4 h時略高于對照組，之后與對照組水平相當，且變化平緩，表明100 V的脈沖標準直流電電擊麻醉對試驗魚的脅迫略高于直接捕撈采血，但差異不顯著，更適于珍珠龍膽石斑魚的電麻醉。

4 結(jié)論

電麻醉用時短，休眠時間長，有利于人工操作與提升運輸?；钸^程中的品質(zhì)與效率。但國內(nèi)外對電麻醉的研究仍不夠深入?？紤]到不同個體對電麻醉的敏感度不同，目前，國內(nèi)僅針對少數(shù)幾種魚進行試驗，且麻醉休眠時間較短，大部分處于“斷電即活”狀態(tài)，沒有真正進入休眠狀態(tài)；美國史密斯公司研發(fā)的電麻醉設(shè)備，但未給出電麻醉具體參數(shù)，需要用戶根據(jù)經(jīng)驗摸索，造成主觀影響。本研究針對高價值海洋魚類珍珠龍膽石斑魚進行電麻醉，發(fā)現(xiàn)合理設(shè)置電麻醉的各項參數(shù)可以有效地減少電麻醉對魚體的傷害，并同時延長休眠時間，有利于珍珠龍膽石斑魚在養(yǎng)殖運輸過程中的各項人工操作的開展，減少損耗。關(guān)于珍珠龍膽石斑魚的相關(guān)電麻醉技術(shù)還需進一步研究，后續(xù)將深入開展環(huán)境溫度等因素的研究試驗工作，為提高珍珠龍膽石斑魚保活流通過程的品質(zhì)與效率提供參考。

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