鐘錳 王曉嬌 王君 劉暢 朱彬 王鶴 李英夫 何偉明

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 通遼 028007；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

中心體是細(xì)胞中的主要細(xì)胞器之一。一個中心體包括2個中心粒及其周圍的中心粒周圍物質(zhì)，參與有絲分裂過程中紡錘體的組裝及細(xì)胞分裂。研究發(fā)現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性和中心體擴(kuò)增異常是腫瘤細(xì)胞普遍具有的特征，通常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期階段，這為腫瘤早期診斷和治療提供了新途徑〔1～3〕。STIL基因最早發(fā)現(xiàn)于急性T細(xì)胞淋巴白血病基因重排，命名為SIL/STIL〔4〕,STIL與生物體內(nèi)中心體的生成、復(fù)制及細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)。但目前關(guān)于STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)及其分子機(jī)制尚未見報道。本文探討STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)及生物學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1生物信息學(xué)分析 公用數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜(TCGA)在線分析STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平。

1.2臨床樣本 20例神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中男女各10例；年齡46～69歲，平均(57.25±7.58)歲。浸潤周圍腦組織6例，無浸潤14例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期 12例。

1.3細(xì)胞系 分別檢測幾株常用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中STIL中的表達(dá)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44、U87、SWO-38及U251與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系NHA。

1.4STIL蛋白檢測 利用siRNA干擾技術(shù)瞬時敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中STIL的表達(dá)水平，并利用Western印跡檢測STIL蛋白水平。

1.5主要試劑 染色體凝縮蛋白復(fù)合物工的亞基(NCAP)D2抗體購自美國Abcam公司(貨號：ab34338)，免疫組織化學(xué)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、 檸檬酸緩沖液、蘇木素染劑和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液、 胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素均購自美國Gibco公司。

1.6免疫組化染色 將組織芯片從4℃冰箱中取出置于室溫下 30 min后于65℃烤箱烤片1 h，二甲苯、 乙醇梯度脫蠟、水化，將組織芯片置于微波加熱的1%檸檬酸緩沖液中水浴行抗原修復(fù)至室溫；PBS洗滌3次，每次3 min；滴加過氧化氫(H2O2)溶液，室溫溫育20 min；PBS洗滌組織芯片3次，每次3 min；滴加一抗 NCAPD2(稀釋濃度為1∶75)，4℃冰箱溫育過夜；第2天，取出組織芯片，室溫放置30 min，PBS洗滌組織芯片3次，每次3 min；滴加二抗試劑，室溫下溫育30 min；DAB顯色；蘇木素染劑復(fù)染，中性樹脂膠封片。PBS替代一抗作為陰性對照。

1.7四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞按5 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)1、2、3、4 d后，每孔加入0.5%MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入200 μl 二甲基亞砜(DMSO)，室溫下振蕩10 min，使結(jié)晶物全部溶解，以酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處的吸光度(OD值)。

1.8Western印跡 使用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解所收集細(xì)胞；提取細(xì)胞蛋白后采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；使用脫脂牛奶封閉 2 h；于4℃冰箱溫育一抗過夜；采用洗膜緩沖液(TBST)洗膜后溫育二抗2 h；使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光液曝光。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平 SITL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)(4.50±4.21)顯著高于正常組織(0.50±1.00)。檢測的20例神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)STIL在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致(圖1)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示STIL高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者低生存期相關(guān)(圖2)。

圖1 STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中表達(dá)

圖2 STIL表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存期相關(guān)性

2.2STIL在不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá) 與人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA mRNA(1.00±0.08)相比，STIL在細(xì)胞系U251、SHG-44、SWO-38細(xì)胞中均表達(dá)(1.75±0.04、2.15±0.04、2.41±0.20)明顯高，在細(xì)胞系U87細(xì)胞中表達(dá)最高(3.58±0.09)。

2.3構(gòu)建STIL低表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 sh-STIL-1組SHG-44細(xì)胞和SWO-38細(xì)胞STIL蛋白水平(0.68±0.05，0.81±0.08)均顯著低于sh-NC組(1.00±0.05，均P<0.05)。見圖3。

2.4敲低STIL表達(dá)有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力 第2天后，sh-STIL-1組SHG-44細(xì)胞和SWO-38細(xì)胞增殖能力均顯著低于Sh-NC組(P<0.05)。見表1、2。

圖3 Western印跡檢測STIL的敲低效率

2.5敲低STIL表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)基因組不穩(wěn)定性 通過免疫熒光實驗分析發(fā)現(xiàn)敲低STIL的表達(dá)水平后，紫外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO-38內(nèi)產(chǎn)生基因組DNA雙鏈斷裂數(shù)目明顯增多，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的發(fā)生(圖4)。

表1 兩組SHG-44細(xì)胞增殖能力比較

表2 兩組SWO-38細(xì)胞增殖能力比較

圖4 敲低STIL導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因組DNA雙鏈斷裂增多(免疫組化，×40)

2.6敲低STIL的表達(dá)對p27蛋白水平影響 敲低STIL的表達(dá)導(dǎo)致p27蛋白水平上調(diào)(圖5)。

圖5 敲低STIL導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞p27表達(dá)上調(diào)

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其發(fā)病率約占所有顱內(nèi)原發(fā)性腦腫瘤的50%以上〔5〕。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類，分級越高，惡性程度越高，預(yù)后越差〔6〕。目前，臨床上存在的高分級膠質(zhì)瘤患者，如間變性星形膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等，盡管存在手術(shù)、化療及放療等治療手段〔7〕，但由于膠質(zhì)瘤具有局部侵襲性生長且生長迅速、易復(fù)發(fā)、手術(shù)易殘留具有強(qiáng)浸潤性的腫瘤細(xì)胞、無法完全切除、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的累積1年生存率低于30%，高級別膠質(zhì)瘤患者的中位生存期僅不足12個月〔8,9〕。此外，與其他部位的腫瘤相比，膠質(zhì)瘤對常規(guī)化療、放療反應(yīng)不敏感。由于血腦屏障存在，化療藥物及抗腫瘤藥物的療效也受到限制。因此，如何控制疾病的復(fù)發(fā)、篩選有效的診斷和治療靶點(diǎn)一直是神經(jīng)外科的焦點(diǎn)。

近年來隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究逐漸深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病涉及一系列相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的改變，包括癌基因的活化及抑癌基因的抑制。癌癥基因組圖譜計劃通過對206例神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床樣本大規(guī)模遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中眾多基因發(fā)生突變，主要涉及3條信號通路：酪氨酸激酶受體RTK/RAS/PI3K通路、p53通路及RB信號通路。其中，p53通路通過以p53為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控DNA損傷，募集損傷蛋白以維持基因組的完整性，P53的失活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔10〕。此外，隨著非編碼RNA領(lǐng)域的研究不斷深入，有報道發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA、miRNAs也參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程〔11，12〕。然而，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究取得了一些進(jìn)展，但目前仍未全面揭示其發(fā)病的具體機(jī)制，臨床也無有效的腫瘤標(biāo)志物。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，尋找新型特異性腫瘤標(biāo)志物對于預(yù)測膠質(zhì)瘤的預(yù)后和復(fù)發(fā)至關(guān)重要。

STIL具有保守的蛋白相互作用區(qū)域，其中CR2(氨基酸385-499)是富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，含有保守的PPXXPXP基序，能與中心體P4.1相關(guān)蛋白CPAP/CENPJ相關(guān)作用。而超螺旋結(jié)構(gòu)域(氨基酸721～748)對polo樣激酶(PLK)4及細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)1/細(xì)胞周期蛋白B2，3至關(guān)重要〔13〕。此外，STAN結(jié)構(gòu)域(氨基酸1 052～1 148)介導(dǎo)中心體蛋白(SAS)-62的結(jié)合〔14〕。STIL羧基端的KEN盒參與APC/C介導(dǎo)的STIL5降解，也能與Hedgehog 信號通路中的保守分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑(SUFU)6及家族鋅指蛋白(GLI)17相互作用〔15,16〕。

研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂過程中，STIL與其結(jié)合蛋白相互作用，確保中心體復(fù)制的保真性以減少染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生〔17〕。中心體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常能影響細(xì)胞分裂過程，而STIL在維持增殖細(xì)胞中心體完整性方面至關(guān)重要。研究表明在多種預(yù)后不良的腫瘤中STIL存在異常表達(dá)，包括肺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等〔18～20〕。STIL的表達(dá)水平與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)〔20〕。STIL發(fā)揮著原癌基因的作用，通過促進(jìn)紡錘體缺陷引發(fā)染色體不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔21〕。另外，大量文獻(xiàn)報道STIL參與調(diào)控音猬因子(SHH)信號通路也可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔22〕。在胰腺癌中過表達(dá)STIL可抑制SUFU介導(dǎo)的GLI1蛋白表達(dá)，而敲低STIL可逆轉(zhuǎn)上述表型。STIL過表達(dá)促進(jìn)GLI1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，而GLI1的表達(dá)水平上調(diào)能促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖、細(xì)胞死亡抗性、血管生成及基因組不穩(wěn)定性。因此，有研究推測STIL的過表達(dá)通過調(diào)控GLI1的功能引發(fā)癌變〔23〕。作為癌基因，STIL為預(yù)后做出更準(zhǔn)確的評估及進(jìn)行分子靶向治療提供了可能。有報道指出通過抑制STIL能有效增強(qiáng)DNA損傷化療藥物在治療卵巢癌中的功效〔19〕。Patwardhan等〔24〕檢測了多種腫瘤組織芯片發(fā)現(xiàn)STIL在肺癌組織中顯著高表達(dá)，其表達(dá)與著絲點(diǎn)基因的表達(dá)及有絲分裂相關(guān)。

截至目前，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不清楚，STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報道，而尋找有效的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)極為迫切。本研究證實了敲低STIL表達(dá)能有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中STIL呈高表達(dá)，與臨床分期呈正相關(guān)，并參與細(xì)胞周期及 DNA修復(fù)等過程，有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療的新分子靶標(biāo)。