李華欣 馬賓 劉曉芬 丁瑩梅 袁梅

(1南華大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2南華大學衡陽醫(yī)學院)

鈣離子鈣信號在生命活動中承擔重要作用，鈣信號既是細胞外信使又是細胞內(nèi)信使，在細胞中影響基因表達、細胞生長、發(fā)育、存活甚至死亡。而鈣調(diào)蛋白(CaM)是真核生物細胞中最主要、最普遍的鈣傳感器〔1〕和換能器，通過與鈣離子結(jié)合調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能從而充分發(fā)揮鈣離子的作用。在腦中，CaM主要與急性腦梗死〔2，3〕、阿爾茨海默病〔4〕、癲癇〔5，6〕和帕金森病〔7〕有關(guān)。前期研究主要集中在CaM與急性腦梗死關(guān)系及其機制〔8，9〕。2015年，本課題組研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者血漿CaM水平與正常對照組相比表達顯著增加〔9〕。而使用鈣調(diào)蛋白拮抗劑〔10，11〕抑制CaM表達可以減輕急性腦梗死后腦損傷。在人體，CaM 由3個非等位基因CALM1、CALM2、CALM3編碼〔12〕，都編碼產(chǎn)生CaM，其中研究最普遍和廣泛的基因是CALM1(小鼠的同源基因是Calm1)。為進一步探索CaM在缺血性腦卒中的作用，本文構(gòu)建了Calm1基因敲除小鼠模型。 蛋白質(zhì)組學作為一種高通量篩選方法，近來在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究〔13，14〕中越來越受到關(guān)注。蛋白質(zhì)是細胞功能的最主要執(zhí)行者，細胞中異常表達的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)修飾改變可能引發(fā)一系列疾病。本研究采用TMT標記的定量蛋白組學技術(shù)，全面檢測野生型(WT)、純和型(HO)、雜合型(HE)小鼠腦組織蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)合生物信息學GO、KEGG和STRING分析來探究差異蛋白涉及的功能及參與的信號通路，以期從宏觀角度上發(fā)現(xiàn)Calm1表達改變涉及的差異蛋白標靶，為探究Calm1表達改變對腦組織功能影響及其作用機制提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 C57BL/6J小鼠由上海南方模式生物科技有限公司提供，為Calm1-eKO1基因敲除小鼠模型，交配后獲得WT(+/+)、HE(+/-)和HO(-/-)小鼠。實驗動物合格證編號：20170010002299。實驗小鼠被飼養(yǎng)于南華大學實驗動物學部進行繁殖育種和實驗，喂食大小鼠維持飼料和繁殖飼料。經(jīng)PCR產(chǎn)物大小方案鑒定小鼠基因型。對實驗動物的處理及動物實驗的開展均符合動物倫理學標準，并經(jīng)南華大學醫(yī)學倫理委員會(編號：2018-02-0002)審查通過。3種基因型小鼠各3只，鼠齡3.0～4.1 w，平均3.5 w，分為WT組、HE組和HO組。PCR實驗采用引物序列為P1：5′-TGAAACCTGGATTGGTAACCCA-3′；P2：5′-CATCACGACACTTAATGGCGC-3′；P3：5′-GACGGCACCATCACAACCAA-3′。

1.2標本采集及運輸 小鼠禁食12 h，自由飲水。經(jīng)5%水合氯醛腹腔注射將小鼠麻醉后固定在橡皮膠墊上，先用眼科剪剪開小鼠胸腔暴露心臟，再使用寬頭無齒鑷子小心夾持固定心臟，最后將1 ml注射器針頭插入左心室，緩慢注射4℃無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，灌至肝臟變成純桃黃色。小鼠斷頭取完整腦組織，4℃無菌PBS輕輕沖洗，濾紙吸干表面水分，置于液氮速凍保存，干冰運輸。所有小鼠腦組織標本在質(zhì)譜檢測前避免反復(fù)凍融。

1.3主要試劑與儀器 麻醉藥水合氯醛購于上海麥克林公司；二硫鍵還原劑TCEP〔tris(2-carboxyethyl) phosphine〕、烷基化劑IAA(iodoacetamide)、用于蛋白重溶的100 mmol/L HEPES和SDC(sodium deoxycholate)、用于TMT標記的Hydroxylamine、Anhydrous acetonitrilel均購于美國 Sigma-Aldrich公司；用于配制RIPA裂解液的試劑購于上海生工生物公司、美國Sigma-Aldrich公司；測序級胰蛋白酶購于美國Promega公司；TMT標記試劑TMT10-plex Isobaric Label Reagent Set購于美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑購于上海數(shù)譜生物公司；用于質(zhì)譜分析的試劑購于美國 Sigma-Aldrich公司、美國J.T.Baker公司；其余試劑至少為國產(chǎn)分析純試劑級別。Q Exactive質(zhì)譜儀、1200液相色譜系統(tǒng)、混勻器均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4蛋白提取 取小鼠全腦組織，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿使充分裂解，注意冰上操作。提取蛋白后，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定每份腦組織蛋白濃度。取96孔板，每孔加入標準蛋白或待測樣品20 μl，工作液160 μl，37℃搖床震蕩孵育30 min，酶標儀檢測562 nm波長處的光密度(OD)值。繪制標準蛋白曲線(R2>0.95)并根據(jù)標準曲線計算相應(yīng)樣品的濃度和蛋白總量。聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣20 μg，考馬斯亮藍染色檢測蛋白質(zhì)量。

取上述樣品加用裂解液稀釋至蛋白濃度為1 mg/ml。再加入TCEP在55℃條件下孵育10 min還原二硫鍵。采用IAA避光反應(yīng)15 min，烷基化TCEP還原的二硫鍵。加入4～6 倍體積預(yù)冷的丙酮充分混勻，沉淀蛋白。4℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄上清。加入200 μl預(yù)冷的80%丙酮洗滌沉淀，重復(fù)2次后收集沉淀。按次序先后加入含1% SDC 的100 mmol/L HEPES、再懸浮緩沖液、2 μg trypsin溶液分別反應(yīng)，簡單離心后37℃震蕩孵育過夜使蛋白充分溶解。再高速離心10 min，留取上清至新EP管中。

1.5TMT標記 取出TMT標記試劑平衡至室溫。每管試劑中加入41 μl無水乙腈(ACN)溶解并離心，吸取20 μl TMT 溶液至待測樣品中，混勻后離心，室溫孵育1 h，加入羥氨室溫再孵育15 min終止反應(yīng)。各待測樣品等量混合。加入TFA沉淀SDC，提取共沉淀的多肽，重復(fù)2次，最終得到的上清即為標記的多肽樣品。使用C18脫鹽柱給多肽樣品脫鹽，真空干燥，-80℃ 凍存或加入0.1% FA，H2O，2% CAN配成的緩沖液重溶至濃度為1 μg/μl的多肽溶液。取100 μg多肽樣品，經(jīng)HPLC反向柱層析系統(tǒng)(流動A相：10 mmol/L甲酸銨水溶液，pH=10；流動B相：10 mmol/L甲酸銨，10% H2O，90% ACN，pH=10)梯度洗脫，然后經(jīng)XBridge BEH C18 XP Column(150 mm×2.1 mm)分離，每30 s收集一個組分，收集 120份，隨后合并為12 個組分，再經(jīng)真空干燥后-80℃凍存。

1.6液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析(LC-MS/MS) 每個組分取2 μg多肽經(jīng)nano-UPLC 液相系統(tǒng)EASY-nLC1200 以300 nl/min恒定流速進行分離。分析采用100 μm ID × 15 cm 反相色譜柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 um，Dr.Math)。流動相A 液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為2%)，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為80%)。色譜柱以100%A 液平衡。液相梯度設(shè)置：流動相B：8%～35%持續(xù)70 min，35%～45% 持續(xù)12 min，45%～100% 持續(xù)2 min，100%持續(xù)2 min，2%持續(xù)2 min。

分離后的肽段連用Q-Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan) 在線進行質(zhì)譜分析。分析時長：120 min/sample，正離子檢測模式，母離子掃描范圍350～1 600 m/z。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描(DDA)程序。每次全掃描后采集20個碎片圖譜(MS2 scan，HCD)。MS1在200 m/z時分辨率為70 000，MS2在200 m/z時分辨率為35 000；MS1 AGC為3E+6，MS2 AGC 為1E+5，最大離子注入時間(Max IT)：MS1，50 ms；MS2，45 ms。標準化碰撞能量(NCE) 為32%，隔離窗口為2 m/z，動態(tài)排除時間30 s。

1.7MaxQuant搜庫和TMT定量 LC-MS/MS原始數(shù)據(jù)使用MaxQuant 1.6.1.0進行搜庫和定量分析。蛋白數(shù)據(jù)庫為：uniprot-mouse-20200526.fasta；定量方式為二級報告子定量，16標TMT，標記位點為多肽N末端和Lys(K)，PIF設(shè)為0.75。特異性酶為trypsin/P，最大漏切數(shù)2；可變修飾有Oxidation(M)，Acetyl(protein N-term)，固定修飾 Carbamidomethyl(C)；最小多肽長度為7，最大多肽分子量4 600 Da；多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01；用于定量的多肽包括Unique，可變修飾的多肽不用于定量；同時進行iBAQ非標定量。

隨后對9個樣品進行標準化：性質(zhì)相似的生物樣品中絕大部分蛋白表達水平應(yīng)該是不變的，只有少數(shù)蛋白會出現(xiàn)差異表達；根據(jù)這個原理，將各組樣品標準化，使各組樣品總蛋白或中位數(shù)一致。

1.8統(tǒng)計檢驗和生物信息學分析 隨后對標準化后的定量結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，得到對應(yīng)的差異表達蛋白。本實驗含3個生物學重復(fù)，將差異倍數(shù)(FC)>1.2或FC<1/1.2，P<0.05，單肽≥2的蛋白定義為差異顯著，并進行后續(xù)GO、KEGG通路、蛋白相互作用分析和展示。

2 結(jié) 果

2.1小鼠基因型鑒定 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示：WT小鼠擴增出DNA片段約為818 bp；Calm1基因敲除HO小鼠擴增出DNA片段約為979 bp；Calm1基因敲除HE小鼠擴增出DNA片段約為979 bp+818 bp，見圖1。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖像

2.2總蛋白及DEPs鑒定和篩選 本實驗多肽和蛋白水平錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)均控制在0.01，多肽總數(shù)22 387個，蛋白質(zhì)總數(shù)4 595個，可定量蛋白數(shù)4 529個。C-A組中，顯著上調(diào)蛋白23個，顯著下調(diào)蛋白31個，共54個差異蛋白質(zhì)(DEPs)；C-B組中，顯著上調(diào)蛋白19個，顯著下調(diào)蛋白16個，共35個DEPs；C-A組、C-B組取交集，只有一個交集蛋白質(zhì)：Sorbs3；C-A組DEPs火山圖上調(diào)最顯著的5個蛋白質(zhì)是Ctif、Gpr17、Hsph1、Ttn、Ugt8a，下調(diào)最顯著的為 S100a5、Cirbp、Nqo1、Gng10、Ass1。C-B組上調(diào)最顯著的5個蛋白質(zhì)是Ahnak2、Sorbs3、Fam81a、Timm9、Col1a1，下調(diào)最顯著的為 Cox7a2、Cox5a、Cox6c、Cox6b1、Cdk13。見圖2。

2.3KEGG 通路分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，C-A組54個DEPs富集在11條通路中，C-A組上調(diào)的23個DEPs富集在20條通路中，C-A組下調(diào)的31個DEPs富集在16條通路中。

C-B組的35個DEPs富集在18條通路中，C-B組上調(diào)的19個DEPs富集2條通路中，C-B組下調(diào)的16個DEPs富集在16條通路中，見圖3。

圖2 DEPs火山圖

圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4GO富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，C-A組54個DEPs富集在生物學過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)分別有32、22、27條，其中，C-A組上調(diào)的23個DEPs富集在BP、CC、MF分別為12、7、39條，C-A組下調(diào)的31個DEPs富集在BP、CC、MF有37、29、39條。

C-B組35個DEPs富集在BP、CC、MF分別有134、86、47條，其中，C-B組上調(diào)的19個DEPs富集在BP、CC、MF分別有175、52、32條，C-B組下調(diào)的16個DEPs富集在BP、CC、MF各共有104、56、43條，見圖4。

圖4 GO富集分析結(jié)果

2.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)采用STRING數(shù)據(jù)庫進行構(gòu)建，隱藏無連接節(jié)點的基因進行展示。然后將STRING 產(chǎn)生的蛋白相互作用參數(shù)導入Cytoscape(版本：3.8.2；https：//cytoscape.org/)，利用CytoHuabba插件，再采用最大集團中心度(MCC) 算法篩選排名前10的關(guān)鍵基因。C-A組27個DEPs相互作用如圖5A所示，前10的關(guān)鍵基因按中心度依次排列為Hsp90ab1、Hsp90aa1、Nqo1、Ephx1、Gstm5、Gstm1、Tomm34、Hsph1、Calm1和Acss2，顯示如圖5B。C-B組20個DEPs相互作用如圖6A所示，前10的關(guān)鍵基因按中心度依次排列為Cox4i1、Cox7a2、Cox5b(Gm11273)、Cox6b1、Cox5a、Cox6c、Cox7c、Sod1、Nefh和Nefl，顯示如圖6B。

A：隱藏無連接節(jié)點后，27個DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作圖軟件中CytoHubba插件按中心度篩選出來的10個關(guān)鍵基因；紅色表示連接度高，黃色表示連接度低；橢圓節(jié)點表示上調(diào)，菱形節(jié)點表示下調(diào)圖5 C-A組DEPs相互作用分析

A：隱藏無連接節(jié)點后，20個DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作圖軟件中CytoHubba插件按中心度篩選出來的10個關(guān)鍵基因；紅色表示連接度高，黃色表示連接度低；橢圓節(jié)點表示上調(diào)，菱形節(jié)點表示下調(diào)圖6 C-B組DEPs相互作用分析

2.6重要DEPs的表達量聚類分析 根據(jù)C-A、C-B兩組上調(diào)、下調(diào)最顯著的10個DEPs，C-A、C-B兩組連接度最高的10個關(guān)鍵蛋白質(zhì)。對C-A、C-B兩組篩選出來的上述DEPs聚類后制作熱圖，見圖7。

圖7 差異蛋白質(zhì)聚類分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，Calm1敲除后，涉及的DEPs主要在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了作用。C-A、C-B兩組中涉及的通路主要包括多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse，Calm1/Gng10/Th，下調(diào))、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下調(diào))、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，下調(diào))、帕金森病(Parkinson disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下調(diào))、亨廷頓病(Huntington disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下調(diào))、多種神經(jīng)退行性疾病(Pathways of neurodegeneration-multiple diseases，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，上調(diào)下調(diào)均有)、朊病毒病(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下調(diào))。朊病毒病是一種具有高度傳染性的神經(jīng)退行性疾病，能夠通過引起特定蛋白質(zhì)的錯誤折疊、聚集和沉淀，從而引起肌萎縮性側(cè)索硬化癥的漸進性加重〔15，16〕。上述通路中DEPs主要包括細胞色素C氧化酶多種亞基(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1)，與阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、帕金森病和亨廷頓病通路均有關(guān)聯(lián)；包括神經(jīng)絲輕、中、重多肽(Nefl/Nefm/Nefh)，其中，Nefh與軸突成熟有關(guān)且通常用作神經(jīng)元損傷的生物標志物，與肌萎縮側(cè)索硬化有關(guān)；包括超氧化物歧化酶〔Cu-Zn〕(Sod1)，該基因的突變被認為是肌萎縮側(cè)索硬化的原因〔17，18〕，還與亨廷頓病有關(guān)。

CaM通過直接參與β淀粉樣蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成及調(diào)控下游的CaM結(jié)合蛋白與阿爾茨海默病有密切聯(lián)系〔4〕；CaM調(diào)控多種鈣離子通道，參與維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，CaM的高表達或活性增強也可能導致CaM結(jié)合蛋白的過度激活而對細胞產(chǎn)生毒害作用，有實驗表明抑制CaM結(jié)合蛋白的表達在帕金森病動物模型和患者中都帶來了有益影響〔7〕；2016年，研究人員采用蛋白質(zhì)組學分析方法探究肌萎縮側(cè)索硬化患者的發(fā)病機制，也發(fā)現(xiàn)患者脊髓組織神經(jīng)元胞體和樹突中CaM的表達普遍降低〔19〕，這可能是破壞了鈣穩(wěn)態(tài)；CaM與亨廷頓病〔20，21〕有關(guān)聯(lián)，CaM片段的表達(由CaM的76～121位氨基酸組成)降低了CaM與突變的亨廷頓蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾的亨廷頓蛋白的結(jié)合及與突變體亨廷頓蛋白相關(guān)的細胞毒性和標準化的細胞內(nèi)鈣釋放，CaM片段的表達改善了亨廷頓病R6/2小鼠模型的運動功能；細胞色素C氧化酶相關(guān)蛋白參與構(gòu)成線粒體有氧呼吸復(fù)合體Ⅳ，與線粒體功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)；已有證據(jù)表明線粒體特別是突觸前神經(jīng)元中的線粒體功能障礙是神經(jīng)退行性疾病的重要原因〔22，23〕，敲除Calm1，CaM表達降低可能通過下調(diào)細胞色素C氧化酶相關(guān)蛋白的表達從而引起Calm1敲除小鼠的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展，具體是否有關(guān)聯(lián)還有待進一步驗證。CaM表達水平增高或活性增強，敲除Calm1使得CaM表達減低都有可能引起神經(jīng)退行性疾病，但總的來說，抑制CaM的表達能夠一定程度改善神經(jīng)退行性疾病患者的預(yù)后，但其明確的抑制程度也有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，敲除Calm1，CaM表達降低，除與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)外，還可能通過調(diào)控乙醚脂質(zhì)代謝通路(Ether lipid metabolism，Pld3/Ugt8a，上調(diào))從而參與癌癥〔24〕。通過壞死性凋亡通路(Necroptosis，Hsp90ab1/Hsp90aa1，上調(diào))從而參與神經(jīng)發(fā)育〔25〕，參與阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，還參與癌癥〔26〕。既往文獻對Calm基因突變(CaM表達降低)的研究主要與臨床上危及生命的惡性心律失常有關(guān)〔27，28〕，包括兒茶酚胺能多形性室性心動過速〔29〕、長QT綜合征(LQTs)〔30〕、特發(fā)性心室顫動(IVF)〔31〕；此外，研究人員于2019年還發(fā)現(xiàn)Calm基因突變(CaM表達降低)與神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)〔28〕，包括癲癇發(fā)作、神經(jīng)發(fā)育遲緩、運動和(或)認知功能障礙，但并未描述引起神經(jīng)系統(tǒng)病變的相關(guān)機制。2018年，研究人員通過CRISPR Cas9技術(shù)置換Calm1中77處的甲硫氨酸編碼堿基，發(fā)現(xiàn)這種基因編輯的小鼠純合子在包括莫里斯水迷宮和聯(lián)想學習的學習測試中的表現(xiàn)與WT小鼠相比，并沒有統(tǒng)計學意義上的改變〔32〕。這些發(fā)現(xiàn)說明，CaM不僅在神經(jīng)系統(tǒng)研究中很有意義，在惡性心律失常、許多癌癥的防治中也有重要意義，還需更深入的聯(lián)合研究。

既往Calm基因相關(guān)研究對象多為患者血清樣本或已發(fā)表文獻，采用全外顯子組測序(WES)、靶向二代測序(NGS)或Sanger測序方法研究基因之間的相互關(guān)系及對生物體的影響〔27，28〕。本研究應(yīng)用最新的TMT標記定量蛋白組學方法，方法上較基因組學篩查方法在基因的功能及其調(diào)控機制研究上更為全面和可靠。同時，研究對象為基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建和培育的Calm1穩(wěn)定敲除HO、HE和WT小鼠，在模型上具有原始創(chuàng)新性。本研究首次揭示了Calm1敲除后小鼠腦組織的蛋白組學變化特征，初步提示了DEPs涉及的生物學功能及信號通路。Calm1敲除后顯著改變腦組織中蛋白質(zhì)表達特征并影響多條與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切的信號通路，表明CaM異常表達在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病中起到重要作用。