翟佳麗，壩玉蓉，甘 雪，徐慧妮

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，昆明 650224)

氮是植物生長和產(chǎn)量的一個重要因素，影響著植物的生物過程[1]。氮的缺乏導致許多植物的光合作用顯著下降，影響植物細胞分裂和生長，從而導致植株矮小，分支分蘗減少，葉片發(fā)黃，葉片早衰，最終導致產(chǎn)量減少[2]。缺氮后恢復供氮，植物生長趨向正常，但表型性狀、干物質質量和根系的恢復程度不同[3]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗復氮后，根系活力有一定的恢復，但仍顯著低于正常處理[3]。冬小麥研究表明，缺氮會導致植物體內谷氨酸濃度下降，恢復供氮后其濃度回升[4]。缺氮脅迫影響了植物的正常代謝活動，除與氮素相關的轉運子及轉錄因子外，與植物代謝調節(jié)相關的基因也常在缺氮脅迫轉錄組中呈現(xiàn)明顯的表達變化[5-6]。研究表明，AP2/ERF、WRKY、NAC 和 MYB 等與植物非生物逆境脅迫相關的轉錄因子也常在缺氮條件下表達量升高[7]。

MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉錄因子是指含有高度保守的DNA結合區(qū)-MYB結構域的一類轉錄因子，是植物中最大的轉錄因子家族之一[8-9]。MYB 轉錄因子在植物整個生長發(fā)育、次生產(chǎn)物代謝、生物和非生物脅迫應答等方面都起著至關重要的作用[10]。依據(jù)MYB基序重復種類和數(shù)目的不同，將整個MYB 轉錄因子家族分為四類：4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB[11]，且R2R3-MYB轉錄因子是植物中數(shù)目最多的一類，具有廣泛的生物活性，參與植物體內的各種生理生化活動[12]。研究表明MYB通過直接靶向結合相關代謝酶基因的啟動子調控其表達，從而實現(xiàn)對類黃酮[13]、木質素[14]、黃酮醇[15]、花青素和原花色素[16]、苯丙酸代謝[17]、纖維素[18]等次生產(chǎn)物代謝的調控。此外，MYB轉錄因子(尤其R2R3型MYB轉錄因子)通過直接或間接調控下游逆境相關基因的表達來增強或減弱植物對逆境的適應性。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMYB20的過表達植株在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的抗性[19]；大豆R2R3-MYB基因GmMYB68的轉基因植株對鹽堿脅迫的抗性增強[20]，其轉錄因子GmMYB101在氮代謝調節(jié)中起重要作用[21]；谷子MYB類轉錄因子SiMYB42基因可以調控下游硝酸鹽轉運基因的表達影響植物低氮脅迫耐性[22]。

番茄R2R3-MYB基因家族中有121個成員，在應答非生物脅迫和信號轉導途徑中發(fā)揮主要作用[23]。SlMYB49可以提高干旱和鹽脅迫的抗性[24]，SlMYB102可以提高轉基因番茄的鹽脅迫抗性[8]，而番茄SlMYB86在缺氮脅迫下功能和作用機制還未見報道。本研究克隆了番茄轉錄因子SlMYB86基因，通過qRT-PCR分析缺氮脅迫下SlMYB86表達，并對其編碼蛋白進行原核表達分析，用Western blot驗證SlMYB86對缺氮脅迫的應答，為后續(xù)生物學功能和分子機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

實驗材料為番茄(SolanumlycopersicumL.)品種‘黃果’自交系，于本實驗室保存。挑選顆粒飽滿的番茄種子，用50 ℃的無菌水浸泡30 min，將種子鋪于濕潤的濾紙上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱催芽48 h左右，待種子大部分露白后播種于蛭石中。待幼苗生長到一片真葉，將表型一致的幼苗移栽到盆中，當幼苗處于三葉期時開始缺氮處理。番茄幼苗于缺氮營養(yǎng)液中處理2 d，之后將番茄幼苗轉移到含有10 mmol/L NO3-正常氮營養(yǎng)液中(CK，含有2.5 mmol/L硝酸鈣和5 mmol/L硝酸鉀)。實驗共設置6個處理：(1)正常處理(CK)；(2)缺氮6 h(-N 6 h)；(3)缺氮24 h(-N 24 h)；(4)缺氮2 d(-N 2 d)；(5)缺氮復氮6 h(-N+N 6 h)；(6)缺氮復氮24 h(-N+N 24 h)，每個處理設置3個重復。將不同處理后番茄幼苗的根、葉立即在液氮中冷凍，并儲存在-80 ℃。實驗在昆明理工大學溫室自然條件下進行，白天氣溫23～28 ℃，夜間13～18 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 番茄SlMYB86的生物信息學分析從Sol Genomics Network、Plant Transcription Factor Database、NCBI 網(wǎng)站下載R2R3-MYB類的番茄(SolanumlycopersicumL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、黃瓜(CucumissativusL.)的蛋白質序列，使用 MEGA 7.0 軟件對MYB蛋白構建系統(tǒng)進化樹，Boot-strap設置1 000 次，使用Jalview 2.9.0.1軟件對蛋白質序列進行比對與分析，使用TBtools 1.09852軟件對SlMYB86轉錄因子的結構進行分析。

1.2.2 qRT-PCR分析使用Trizol試劑(TaKaRa)從番茄葉片及根部提取總RNA。利用Yeasen公司的Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒將RNA反轉錄成cDNA,使用 Hifair?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒進行mRNA表達水平分析。使用CFX96實時PCR機(Bio-Rad，美國)進行qRT-PCR，基因相對表達量計算用2-ΔΔCT法。

1.2.3SlMYB86原核表達載體構建通過Sol Genomics Network 查找SlMYB86的cDNA序列(Solyc02g082040.2.1)，SlMYB86的編碼框大小為975 bp。根據(jù)基因序列設計帶有pET-28a接頭的特異性引物SlMYB86-EcoRⅠ-F(CGCGGATCCGAAT-TCATGGGTCATCACTGCTGC)和SlMYB86-HindⅢ-R(TGCGGCCGCAAGCTTACAATCCCATGCAAGT)，利用Trizol法提取番茄總 RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，用cDNA作為模板，通過PCR擴增得到SlMYB86的編碼區(qū)，通過同源重組的方法，將SlMYB86重組到pET-28a載體中，挑取陽性菌落，進行PCR及測序驗證。

1.2.4 SlMYB86重組蛋白誘導表達使用DNAMAN軟件分析，SlMYB86蛋白相對分子量大約為37.089 kD，pET-28a載體所帶的His標簽加上SlMYB86蛋白后，大小約為41 kD。將測序成功的SlMYB86原核表達載體轉入E.coliBL21表達菌株，接種到含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜活化。將活化菌液再以1∶100比例接種到20 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8。加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，分別于37 ℃、28 ℃條件下進行誘導，取0、2、4、6和8 h后的菌液各2 mL，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1×TBS洗2次，最后菌體沉淀用100 μL的2×蛋白質電泳上樣緩沖液重懸，沸水浴煮10 min，冷卻后進行SDS-PAGE分析，選取最佳誘導條件。

1.2.5 SlMYB86蛋白純化及抗體制備培養(yǎng)pET-28a-SlMYB86菌液，使其OD值在0.5～0.8，誘導蛋白質表達。將1 mL細菌培養(yǎng)物10 000 g離心2 min，棄上清液。將細胞沉淀于-70 ℃冷凍5 min，通過反復凍融使細菌菌株實現(xiàn)最大程度的裂解。使用Promega公司的MagneHisTMProtein Purifi cation System(V8550)進行蛋白純化。將所純化的蛋白1∶1加入2×蛋白質電泳上樣緩沖液(含有β-巰基乙醇)，沸水浴10 min使蛋白變性，冷卻后立即上樣，通過SDS-PAGE分析樣品。用純化得到的融合蛋白為抗原，定期免疫昆明小鼠，通過眼球取血獲得抗血清。

1.2.6 Western blot分析SDS-PAGE后，將蛋白膠于轉膜緩沖液中浸泡平衡15 min，裁取8.5 cm × 5.0 cm的 PVDF膜，置于轉膜緩沖液中平衡15 min。按照自上而下濾紙-凝膠-膜-濾紙的順序平鋪于轉膜儀上，30V，200 mA，轉膜 1.5 h。轉膜結束后，用20 mL TBST洗10 min，隨后將膜放置于封閉緩沖液(含 5% 脫脂牛奶的 TBST)中室溫孵育封閉2 h。用20 mL TBST 洗3次，每次10 min。按1∶5 000 的比例加入一抗，4 ℃ 過夜孵育。用20 mL TBST洗3次后按1∶5 000的比例加入山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h后用 TBST洗 3 次，使用蛋白顯影液檢測。

2 結果與分析

2.1 番茄SlMYB86生物信息學分析

番茄SlMYB86和其他物種MYB轉錄因子聚類分析結果表明，番茄SlMYB86與番茄SlMYB26在進化樹上屬于同一分支，親緣關系較近(圖1，A)。番茄MYB保守域序列比對發(fā)現(xiàn)，番茄R2R3-MYB類轉錄因子含有2個MYB基序，R2保守域中有3個保守的色氨酸殘基，R3保守域中第一個色氨酸殘基被苯丙氨酸所替代且含有2個色氨酸殘基(圖1，B)。對SlMYB86轉錄因子的結構分析發(fā)現(xiàn)，目的基因N端含有2個Myb_DNA-binding保守結構域，與R2R3-MYB類轉錄因子特征一致，表明SlMYB86轉錄因子屬于R2R3-MYB型轉錄因子(圖1，C)。

2.2 缺氮脅迫下番茄幼苗SlMYB86基因的表達

圖2結果表明，與對照組相比，隨著缺氮時間的增加，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達量逐漸增加，在缺氮2 d時，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達量約為對照組的12.6和16.5倍。在缺氮處理后對番茄幼苗進行了復氮處理，復氮處理6 h時，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達量開始下降，與缺氧 2 d相比分別下降了25.2%和38.9%。以上結果表明，與對照組相比，缺氮條件下番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達量顯著增加，SlMYB86基因在缺氮條件下被強烈誘導，說明SlMYB86基因參與了缺氮脅迫應答。

2.3 pET-28a-SlMYB86原核表達載體構建

通過RT-PCR擴增SlMYB86基因編碼框，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，擴增產(chǎn)物大小約為975 bp(圖3，A)，與預期大小相符，且無雜帶，特異性強，將目的片段回收純化。通過同源重組的方法，將目的片段連接到EcoRⅠ和Hind Ⅲ 酶切回收后的原核表達載體pET-28a上，并轉化E.coliDH5a，獲得pET-28a-SlMYB86原核表達載體。挑取單菌落進行PCR驗證，擴增產(chǎn)物大小約為975 bp(圖3，B)，與預期大小相符。將陽性克隆測序，測序結果與序列一致，表明原核表達載體構建成功，命名為pET-28a-SlMYB86。

2.4 pET-28a-SlMYB86的誘導和表達

pET-28a-SlMYB86使用0.5 mmol/L的IPTG，分別于28和 37 ℃條件下進行誘導表達，進行SDS-PAGE檢測。結果(圖4)發(fā)現(xiàn)，SlMYB86蛋白在28 和37 ℃條件下，隨著誘導時間增加蛋白表達量也增加，且37 ℃下蛋白表達量明顯高于28 ℃。綜上，SlMYB86重組蛋白在大腸桿菌E.coliBL21菌株中的最佳誘導條件為：IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導溫度為37 ℃，誘導時間為 8 h。

2.5 SlMYB86蛋白純化及Western blot分析

在最佳誘導條件下對SlMYB86蛋白進行誘導純化，并對上清液進行SDS-PAGE檢測(圖5，A)，在細胞裂解液、流穿液中沒有得到純化蛋白，在洗脫液中成功檢測到目的條帶，且條帶單一，蛋白大小約為41 kD，與預期大小相符，表明在洗脫液中成功獲得了SlMYB86蛋白。SDS-PAGE后，將蛋白轉移到PVDF膜上，用His抗體進行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)在約 41 kD 位置出現(xiàn)一條明顯的蛋白純化條帶(圖5，B)，表明獲得了較高純度的SlMYB86原核蛋白，純化蛋白將用于后續(xù)實驗。

2.6 缺氮及復氮條件下番茄幼苗SlMYB86蛋白的表達量

利用SlMYB86抗體進行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，SlMYB86蛋白隨著缺氮時間的延長表達量增加(圖6，A)；在缺氮2 d時，與CK組相比SlMYB86蛋白表達量達到最大。與缺氮2 d相比，復氮6 和24 h條件下，SlMYB86蛋白表達量有所減少(圖6，B)，Western blot檢測結果與qRT-PCR檢測結果規(guī)律保持一致。結果表明，SlMYB86參與了缺氮脅迫應答，且SlMYB86蛋白在缺氮脅迫后表達量顯著增加。

3 討 論

在擬南芥、煙草、小麥、蕎麥、水稻和玉米等[25-28]植物中分離并克隆得到很多MYB 基因。1996年，Lin等[29]首次在番茄上克隆獲得14個MYB相關基因片段。2003年，蔡新忠等[30]以煙草MYBl中MYB保守區(qū)域編碼序列中的2個特異性序列為引物，在番茄中擴增兩個長度為215 bp的MYB基因片段LeMYB1和LeMYB2，在植物過敏性反應和抗病性產(chǎn)生中起重要調節(jié)作用。2011年，張欣等[31]從番茄中分離得到一個MYB類新基因SlCMYB1，為典型的R2R3-MYB類轉錄因子，定位在細胞核中，在高溫、干旱、鹽和脫落酸脅迫的誘導下，該基因的表達量有明顯的變化，將其轉入水稻中可顯著提高水稻對低溫脅迫的耐受能力。說明MYB轉錄因子在抗逆過程中起到重要的調控作用。

原核表達系統(tǒng)是目前最為成熟的蛋白表達系統(tǒng)，其優(yōu)點在于成本低廉，能夠在較短的時間內獲得目的基因高效表達蛋白。這項技術的主要方法是將目的基因 DNA 片段，與原核表達載體進行連接，構建重組表達載體，轉化大腸桿菌，通過使用不同濃度的IPTG在不同時間及溫度下誘導并純化，獲得所需的目的蛋白[32]。有研究表明，0.1～1 mmol/L的 IPTG有利于重組蛋白的誘導表達[33]，而低濃度的IPTG可以減少化學物質對細胞的損傷[34]。為深入研究番茄SlMYB86在番茄中生物學功能，本研究構建了SlMYB86基因原核表達載體pET-28a-SlMYB86，并成功在大腸桿菌E.coliBL21菌株中大量表達。通過融合蛋白攜帶的His標簽進行純化蛋白，免疫小白鼠制備了多克隆抗體。用Western blot證明成功獲得了SlMYB86重組蛋白。為進一步研究SlMYB86基因的功能奠定了基礎。

研究表明，MYB轉錄因子在應答缺氮脅迫中具有重要的作用。單細胞紅藻 MYB 轉錄因子CmMYB1 可以調節(jié)植物的氮素利用[35]。海棠花MYB 轉錄因子MsMYB10通過改變花青苷等類黃酮化合物的積累量來應答低氮脅迫，最大程度保護機體不受損害[36]。MYB61受GRF4調控，促進水稻氮素利用和生物量生產(chǎn)[37]。OsMYB305過表達抑制了低氮條件下纖維素的生物合成，從而釋放了碳水化合物用于硝酸鹽的吸收和同化，促進了水稻的生長[38]。在MYB 4個亞家族中，主要是R2R3-MYB 亞族成員參與調控氮代謝吸收相關的基因的表達調控[39]。本實驗中克隆的SlMYB86 轉錄因子也屬于R2R3-MYB 亞家族，qRT-PCR和Western blot分析表明缺氮脅迫下SlMYB86表達顯著增加，該基因參與了缺氮脅迫應答。這為今后進一步研究番茄MYB86在抗逆性中的功能研究提供基礎。