倪 杰，徐 晶，蔣 濤

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州 213003）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head）是一種骨科常見慢性病，是指股骨頭血供受損或中斷，導(dǎo)致骨髓成分及骨細(xì)胞死亡，隨后發(fā)生修復(fù)，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變，甚至塌陷的一系列病理改變和臨床表現(xiàn)[1]。該疾病致殘率高，給患者帶來極大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著現(xiàn)代手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，股骨頭置換術(shù)以及全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)日益成熟，為一大部分老年股骨頭壞死患者帶來了福音，但由于人工關(guān)節(jié)使用壽命有限，青壯年患者往往需要慎重考慮。目前臨床提倡根據(jù)股骨頭壞死的程度分別施治，早期股骨頭壞死可采取藥物治療的方式，西藥主要是發(fā)揮抗凝、促纖溶、擴(kuò)血管、調(diào)整破骨和成骨速率等作用，代表藥物有磷酸鹽類、低分子肝素等，但長時(shí)間使用存在的副作用不容忽視。中醫(yī)藥療法副作用小，因而有著極好的應(yīng)用前景。股骨頭壞死屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痹”“骨萎”的范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)對股骨頭壞死的辨證分型中，氣滯血瘀證居于首位，因血為氣之母，氣為血之帥，氣滯則血行不暢，久則瘀阻血脈，氣血凝滯不通，不能濡養(yǎng)筋骨，則發(fā)此病，故行氣活血為治本病第一大法。桃紅四物湯首見于《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，是活血化瘀的代表方劑，因其是在四物湯的基礎(chǔ)上加入桃仁、紅花，故名桃紅四物湯。該方既補(bǔ)血養(yǎng)血，又活血行血，是防治氣滯血瘀型股骨頭壞死的首選方[2]。多項(xiàng)研究表明[3-6]，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的療效確切，但具體作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依托網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，使用最新的研究數(shù)據(jù)和成果，從細(xì)胞分子層面對藥物作用于疾病的機(jī)制、過程以及相關(guān)通路進(jìn)行研究的新型學(xué)科?；诖?，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對桃紅四物湯防治早期股骨頭壞死的可能作用機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 研究中使用的數(shù)據(jù)庫及軟件：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、人類基因數(shù)據(jù)庫（The Human Gene Database，GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù) 系 統(tǒng)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、STRING 平臺(tái)、Cytoscape 軟件、R 語言軟件、Perl 軟件。

1.2 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫構(gòu)建 登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫，分別以“桃仁”“紅花”“熟地黃”“當(dāng)歸”“芍藥”“川芎”檢索藥物所含的有效成分，并進(jìn)行初步篩選，條件為：口服生物利用度（OB）＞30%，生物類藥性（DL）＞0.18，構(gòu)建桃紅四物湯的有效成分庫。同時(shí)，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢桃紅四物湯有效成分的作用靶點(diǎn)，并通過Perl 軟件構(gòu)建靶基因庫。

1.3 股骨頭壞死靶基因庫構(gòu)建 以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards及OMIN 數(shù)據(jù)庫，合并所查得的有關(guān)股骨頭壞死的靶基因，篩選并構(gòu)建股骨頭壞死有關(guān)靶基因庫。

1.4 交集基因庫構(gòu)建 使用R 語言軟件及Perl 軟件，獲得桃紅四物湯靶基因與股骨頭壞死靶基因的交集基因，并繪制Veen 圖，篩選桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶點(diǎn)基因。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建及核心靶基因篩選將通過上述步驟得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因輸入“STRING”數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple Proteins Search”，限定物種為“Homo sapiens”，保存下載TSV 格式的分析結(jié)果，繪制PPI 圖，并通過R語言計(jì)算每個(gè)靶點(diǎn)基因的度值（即靶點(diǎn)基因之間的相互連接數(shù)目），取大于平均度值的靶基因?yàn)楹诵陌谢颉?/p>

1.6 藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 軟件對STRING 網(wǎng)站得到的結(jié)果與桃紅四物湯有效成分以及共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，構(gòu)建藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)大小及顏色進(jìn)行調(diào)整。

1.7 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析 將所得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶標(biāo)基因輸入提前編寫好的R 語言程序中，進(jìn)行分析計(jì)算，得出GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫 檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫后共得到69 個(gè)有效成分，160 個(gè)對應(yīng)靶點(diǎn)。

2.2 股骨頭壞死相關(guān)基因庫 檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫后共得到245 個(gè)股骨頭壞死相關(guān)靶點(diǎn)基因。

2.3 桃紅四物湯-股骨頭壞死交集基因庫 將上述檢索得到的160 個(gè)中藥靶點(diǎn)基因與股骨頭壞死相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，得到39 個(gè)桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因，見圖1。

圖1 桃紅四物湯靶點(diǎn)基因與股骨頭壞死靶點(diǎn)基因交集Veen 圖

2.4 PPI 網(wǎng)路構(gòu)建及核心靶點(diǎn)基因篩選 將上述得到的39 個(gè)桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置相關(guān)條件后運(yùn)行得到靶基因PPI 圖（圖2），同時(shí)以大于平均度值為條件，篩選得到21 個(gè)核心靶點(diǎn)基因，見圖3。

圖2 桃紅四物湯防治股骨頭壞死靶基因PPI 圖

圖3 蛋白互作核心靶點(diǎn)條圖

2.5 藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape軟件整合分析中藥桃紅四物湯的核心有效成分以及對應(yīng)的藥物作用靶標(biāo)基因與股骨頭壞死疾病共同基因之間的關(guān)系，構(gòu)成桃紅四物湯-靶基因-股骨頭壞死疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

圖4 桃紅四物湯-靶基因-股骨頭壞死疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析 GO功能富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因的GO 功能主要涉及細(xì)胞因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核激素受體結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、激素受體結(jié)合、核受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等，見圖5、圖6。KEGG 通路富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因潛在通路共篩選得到94 條富集通路，主要涉及糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for AGE，RAGE）信號(hào)通路、白介素（interleukin，IL）-17 信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1 信號(hào)通路、松弛肽信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路等，見圖7、圖8。

圖5 GO 基因本體論分析柱狀圖

圖6 GO 基因本體論分析氣泡圖

圖7 KEGG 功能富集分析柱狀圖

圖8 KEGG 功能富集分析氣泡圖

3 討論

桃紅四物湯中含桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、芍藥、川芎六味中藥，其中桃仁、紅花活血化瘀，熟地、當(dāng)歸、芍藥養(yǎng)血補(bǔ)血，川芎活血行氣，六藥合用，共奏補(bǔ)血活血，化瘀通絡(luò)之功效，能夠促進(jìn)肢體氣血循環(huán)，使“瘀去而新生”。本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選，共得到桃紅四物湯有效成分69 個(gè)，靶點(diǎn)基因160 個(gè)；通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，共得到245 個(gè)股骨頭壞死相關(guān)靶點(diǎn)基因，取交集后最終得到39 個(gè)桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在研究中藥作用于疾病機(jī)制過程中是科學(xué)而必要的，其能夠篩選出中藥作用于疾病的可能靶點(diǎn)基因，從而縮小中藥實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)范圍，提高研究效率，同時(shí)也能節(jié)約科研經(jīng)費(fèi)和資源。

此外，本研究根據(jù)大于平均度值這一條件，篩選出了21 個(gè)核心靶點(diǎn)，主要有白介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A、表皮生長因子受體、基質(zhì)金屬蛋白酶等。IL-6 既是一種炎癥細(xì)胞因子，也是破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。既往研究表明[7]，IL-6 作為炎癥細(xì)胞因子，其可在人體發(fā)生感染與損傷時(shí)升高，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而作為破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，其可通過OPG/RANKL/RANK 經(jīng)典通路與HIF-1 通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收。多項(xiàng)研究表明[8，9]，IL-6 在股骨頭壞死患者發(fā)病機(jī)制及病情變化中可能起到最重要的作用。而抗IL-6 治療可以減少髖關(guān)節(jié)滑膜炎和骨吸收，刺激血管重建及新骨生成，增加股骨頭缺血性壞死后的骨形成[10，11]。血管內(nèi)皮生長因子是一種具有重要促血管生成活性的生長因子，同時(shí)也是炎癥細(xì)胞因子和成骨細(xì)胞因子。血管內(nèi)皮生長因子A 是不同類型血管內(nèi)皮生長因子中促血管生成能力最強(qiáng)的一種，其在血管生成和新生血管生成中發(fā)揮重要作用，可引起細(xì)胞增殖、抑制凋亡、血管通透性增加、血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞聚集到損傷部位等[12]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，使用血管內(nèi)皮生長因子治療股骨頭壞死可促進(jìn)骨組織重塑和骨壞死部位新骨形成。表皮生長因子是一種多功能生長因子，因其在體內(nèi)具有增加骨吸收、刺激骨形成的特點(diǎn)[16]，故在調(diào)控骨代謝方面具有重要作用。有研究指出[17]，表皮生長因子與其表皮生長因子受體結(jié)合后能通過增加破骨細(xì)胞前體的增殖來刺激骨吸收，導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量的增加，而抑制表皮生長因子受體則可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[18]。Basal O 等[19]對股骨頭髓芯減壓術(shù)聯(lián)合骨內(nèi)注射人重組表皮生長因子治療早期股骨頭壞死進(jìn)行研究，結(jié)果表明表皮生長因子能夠促進(jìn)骨形成和微血管化?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類結(jié)構(gòu)相近、功能復(fù)雜的鋅、鈣依賴性蛋白水解酶家族，參與形態(tài)發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)和重建等過程[20]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9是一種細(xì)胞外基質(zhì)代謝酶，在骨重塑中起重要作用，成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均可分泌。研究指出[21-23]，基質(zhì)金屬蛋白酶-9 與股骨頭壞死具有密切聯(lián)系，其作為明膠酶，可能通過直接參與破骨細(xì)胞的骨吸收過程，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化而調(diào)節(jié)骨代謝。本研究通過分析以上核心靶點(diǎn)，預(yù)測桃紅四物湯是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子及表皮生長因子的表達(dá)，而促進(jìn)局部血管生成，增加骨生成，并通過抑制IL-6 及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)降低破骨細(xì)胞活性，減少骨吸收，提升骨質(zhì)量及骨密度，減少軟骨下骨塌陷。

本研究中KEGG 通路富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因潛在通路共篩選得到94 條富集通路，主要涉及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、松弛肽信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等。IL-17 及其家族在宿主抵御微生物和炎癥性疾病的發(fā)展中起到重要作用，經(jīng)典IL-17 信號(hào)通路通過Act-1、TRAF6 與IL-17RA/IL-17RC 異質(zhì)二聚體結(jié)合，激活多種下游通路，如TAK1、NF-κB、絲裂原激活的蛋白激酶等[24]。研究表明[25-27]，IL-17 能夠刺激小鼠成骨細(xì)胞分化、礦化和增殖，還能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，使骨質(zhì)單向沉積，促進(jìn)骨形成，并且對脂肪形成有抑制作用，能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，從而促進(jìn)骨再生和骨重塑。HIF-1 是細(xì)胞低氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)細(xì)胞功能及穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在HIF-1 家族中，HIF-1α 和HIF-1β 在人體內(nèi)的表達(dá)最為廣泛，二者組成異二聚體。研究表明[28]，血管內(nèi)皮生長因子是HIF-1 通路下游的主要目標(biāo)基因之一，HIF-1α能通過刺激血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)促進(jìn)血管生成，進(jìn)而影響骨形成。Wu J 等[29]通過給新西蘭兔注射馬血清和甲基強(qiáng)的松龍的基礎(chǔ)上行桃紅四物湯灌胃，8 周后發(fā)現(xiàn)兔股骨頭組織中HIF-1α 和血管內(nèi)皮生長因子明顯提升。除此之外，HIF-1α 還可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移。Zou D 等[30]通過慢病毒使HIF-1α 過表達(dá)，觀察其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨影響，結(jié)果表明HIF-1α 可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)成血管基因及成骨基因。Cheng MS等[31]通過對HIF-1α 過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合蛋白支架修復(fù)骨軟骨缺損的作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對照組，觀察組治療13 周后缺損區(qū)的軟骨質(zhì)量更好，軟骨下骨硬化程度更小，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率更高。松弛肽是胰島素超家族中的一種多肽激素，在抗纖維化、血管舒張、血管生成、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[32]，其可通過與G 蛋白耦聯(lián)受體松弛肽家族受體1 結(jié)合激活多種下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[33]。G 蛋白耦聯(lián)受體松弛肽家族受體1 不僅存在于生殖組織中，也存在于骨組織中，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞[34]。Moon JS 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，松弛肽可通過G 蛋白耦聯(lián)受體松弛肽家族受體1，增強(qiáng)和維持骨形成蛋白-2誘導(dǎo)的Smad 和p38 的磷酸化，協(xié)同骨形成蛋白-2增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和骨形成。PI3K/Akt 信號(hào)通路在多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移[36]。研究表明[37]，PI3K/Akt 信號(hào)通路參與破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的分化、增殖等過程，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路。Ma J 等[38]研究表明，Trpv6 通過降低IGF-PI3K-Akt 信號(hào)通路中磷蛋白/總蛋白的比值來抑制破骨細(xì)胞形成，阻斷IGF-PI3K-Akt 信號(hào)通路可明顯減輕Trpv6 對破骨細(xì)胞形成的抑制作用。Zhai Y 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過PI3K/Akt 信號(hào)通路激活下游相關(guān)目標(biāo)，如GSK3β/β 環(huán)蛋白及Nrf-2/HO-1 等，補(bǔ)骨脂素能抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化，有效增強(qiáng)成骨分化。AGE-RAGE 信號(hào)通路參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，包括糖尿病性骨病。隨著血糖水平升高，AGE 在包括骨在內(nèi)的人體組織中積累，可與其受體RAGE 結(jié)合，并通過上調(diào)NF-κB受體活化因子配體mRNA 的表達(dá)來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，還可通過抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、下調(diào)分化來影響成骨細(xì)胞，從而影響骨礦化[40]。Ding KH等[41]研究發(fā)現(xiàn)，RAGE 基因敲除小鼠的血清IL-6 及骨吸收降低，破骨細(xì)胞數(shù)減少，骨量及骨密度明顯升高。Lee EJ 等[42]研究表明，香豆素能通過抑制AGE-RAGE的相互作用，改善糖尿病患者的骨轉(zhuǎn)換和骨重建?？傊壹t四物湯防治股骨頭壞死有著廣泛的作用對象和途徑，主要是通過激活HIF-1 信號(hào)通路，促進(jìn)HIF-1α 以及VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化，表達(dá)成骨及成血管基因，達(dá)到增加局部血管生成，改善股骨頭局部血運(yùn)，影響骨生成，還可通過PI3K/Akt 通路，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，協(xié)同增強(qiáng)成骨分化，同時(shí)激活松弛肽信號(hào)通路，抑制IL-17 及AGE-RAGE 信號(hào)通路，促進(jìn)骨細(xì)胞分化和骨形成。

綜上所述，多通路、多靶點(diǎn)共同作用是桃紅四物湯防治股骨頭壞死的一大特點(diǎn)。但本研究僅基于大數(shù)據(jù)預(yù)測了桃紅四物湯防治股骨頭壞死的主要分子機(jī)制，未來仍需要通過大量嚴(yán)密設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)證明其作用靶點(diǎn)及機(jī)制。