姜柯安 景鵬偉 李道云 陳 霞 向葉舟 童珂雅 陳 科*

1.人類胚胎工程重慶市重點實驗室（重慶 400013）；2.重慶市生殖醫(yī)學(xué)臨床中心（重慶 400013）3.重慶市婦幼保健院，生殖與遺傳研究所（重慶 400013）；4.深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（深圳 518057）

目前， 全世界約有15%的育齡夫婦存在不孕不育問題， 其中由男性因素導(dǎo)致的不育約占50%[1]。 超過50%的男性不育患者存在無精子癥或少精子癥，其中有15%-30%是由遺傳因素造成的[2]。 染色體異常是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一， 正常男性染色體異常的發(fā)生率在0.7%-1.0%， 而無精子癥或少精子癥患者可達到10.6%[3]。 無精子因子 (Azoospermia factor,AZF) 位于Yq11 區(qū)，AZF 可分 為AZFa、AZFb 和AZFc 三個亞區(qū)，該區(qū)域的缺失將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙， 是引起男性不育最常見的遺傳因素[4]。 Y 染色體微缺失在非梗阻性無精癥患者的發(fā)生率約為3%-15%，重度少精癥發(fā)生率約為6%-8%[5]。 本文主要分析研究西南地區(qū)男性不育患者染色體異常的發(fā)生率和類型， 探討染色體異常與男性不育的相關(guān)性， 為男性不育患者的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2017 年8 月至2020 年11 月來我院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性不育患者3657 例，年齡20-57 歲，平均年齡32.8 歲。 根據(jù)患者精液檢查結(jié)果將2664 例精子數(shù)異常患者分為無精子癥組1488 例、 嚴(yán)重少精子癥組724 例(精子濃度＜5×106/ml)和少精子癥組452 例(5×106/ml≤精子濃度＜15×106/ml)，將993 例精子數(shù)正常(精子濃度≥15×106/ml)的患者設(shè)為對照組。 排除經(jīng)男科醫(yī)生檢查診斷為輸精管道梗阻的無精癥患者和輸精管缺如的患者。

二、研究方法

（一）精液常規(guī)分析

患者禁欲2-7d，采用手淫法獲取精液于無菌杯中，精液液化后于Makler 板中顯微鏡下進行精子濃度和活力分析；用改良的巴氏染色法進行精子形態(tài)分析。所有患者均常規(guī)進行至少2 次精液分析檢查， 分析標(biāo)準(zhǔn)參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版進行。

（二）染色體核型分析

采集患者外周血1.5ml， 常規(guī)進行淋巴細胞培養(yǎng)，Giemsa 染色G 顯帶核型分析， 顯微鏡下計數(shù)20 個中期分裂相，分析5 個核型。 按照人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)對核型進行描述。

（三）Y 染色體微缺失檢測

采集患者外周血并進行EDTA 抗凝處理， 用廈門致善生物科技有限公司試劑盒提取基因組DNA。 Y 染色體微缺失采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司試劑盒進行檢測，該試劑盒采用實時熒光PCR 法，檢測歐洲男科協(xié)會(European Academy ofAndrology,EAA)和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控網(wǎng) (European Molecular Genetics Quality Network,EMQN) 推薦的六個序列標(biāo)簽位點，即AZFa 區(qū) 的sY84、sY86，AZFb 區(qū) 的sY127、sY134 和AZFc 區(qū)的sY254、sY255，并選取SRY 和ZFX/ZFY 基因作為內(nèi)對照同時進行檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進行處理，統(tǒng)計分析采用卡方檢驗，P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、染色體異常核型分析

在2664 例精子數(shù)異常的患者中共檢測到染色體核型異常242 例(9.08%)，993 例對照組中共檢出染色體核型異常26 例(2.62%)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 在2664 例精子數(shù)異常組中性染色體異常189 例 (7.10%)，993 例對照組中 性染色體異常5 例(0.50%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；其中無精子癥組和嚴(yán)重少精子癥組性染色體異常檢出率顯著高于對照組(P＜0.05)，而少精子癥組中性染色體異常檢出率和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；無精子癥組性染色體異常檢出率顯著高于嚴(yán)重少精癥組(P＜0.05)，見表1。 在2664 例精子數(shù)異常的患者中常染色體異常53 例 (1.99%)，993 例對照組中常染色 體異 常21 例(2.11%)，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 性染色體異常中檢出率最高的類型為47,XXY， 共檢測到145例，占比為74.36%，其中130 例為無精子癥，15 例為嚴(yán)重少精子癥。 檢出性染色體嵌合核型5 例，其中3 例表現(xiàn)為無精子癥，2 例為少精子癥。 常染色體異常中檢出率最高的類型為45,XY,rob(13;14)(q10;q10)，其中嚴(yán)重少精子癥組中檢測到45,XY,rob(13;14)(q10;q10)共14例(1.93%)，對照組檢測到3 例(0.30%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表1 性染色體異常核型分布情況（例）

表2 常染色體異常核型分布情況（例）

二、染色體多態(tài)性核型分析

在2664 例精子數(shù)異常的患者中共檢測到染色體多態(tài)性核型131 例(4.92%)，993 例對照組中共檢測到56 例(5.64%)，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 染色體多態(tài)性核型中檢出率最高的為D/G 組隨體柄變異，共檢測出78 例，占比41.71%；其次為46,XY,inv(9)(p12q13)，共檢測出39 例，占比20.86%；檢測出46,X,Yqh- 共18 例，其中16 例為無精子癥，2 例為嚴(yán)重少精子癥。 染色體多態(tài)性核型分布情況見表3。

表3 染色體多態(tài)性核型分布情況（例）

注：與對照組比較：*P＜0.05

三、Y 染色體微缺失分析

在2664 例精子數(shù)異常的患者中共檢測到Y(jié) 染色體微缺失177 例(6.64%)，993 例對照組中未檢測到Y(jié)染色體微缺失。 在嚴(yán)重少精癥組中Y 染色體微缺失檢出率最高，顯著高于無精子癥組和少精子癥組(P＜0.05)，見表4。在所有微缺失類型中檢出率最高的為AZFc，共檢 出118 例， 占 比66.67%， 其 次 為AZFbc， 占 比15.82%。 AZFa、AZFb、AZFbc 和AZFabc 共檢出55 例，其中51 例(92.73%)為無精子癥，4 例為嚴(yán)重少精子癥。

表4 Y 染色體微缺失類型分布情況（例）

四、Y 染色體微缺失合并染色體核型分析

在177 例Y 染色體微缺失的患者中共檢測到32例(18.08%)合并染色體核型異?；蚨鄳B(tài)性，均涉及性染色體。 主要為染色體多態(tài)性核型46,X,Yqh-， 檢出15例，占比為46.88%；其次為性反轉(zhuǎn)核型檢出7 例，占比為21.88%， 包括6 例46,XX 和1 例46,XX,13pstk+，7例患者均檢測到SRY 基因；另外檢測出5 例涉及Y 染色體長臂部分區(qū)帶缺失的患者，占比為15.63%；檢出標(biāo)記染色體核型5 例， 占比為15.63%， 包括4 例46,X,+mar 和1 例46,X,9qh+,+mar。 11 例AZFabc 缺失患者其核型均異常，28 例AZFbc 缺失患者中有17 例檢出異常核型，118 例AZFc 缺失患者中有4 例檢出異常核型，見表5。

表5 32 例Y 染色體微缺失合并染色體核型異?；蚨鄳B(tài)性情況分析（例）

討 論

染色體數(shù)目異常、 結(jié)構(gòu)異常和多態(tài)性變異是導(dǎo)致男性不育的重要遺傳因素[6]。 本研究中在男性精子數(shù)異常人群中染色體核型異常檢出率為9.08%，染色體多態(tài)性變異檢出率為4.92%， 與國內(nèi)相關(guān)文獻報道類似[7,8]。精子數(shù)異常組中性染色體核型異常檢出率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而常染色體核型異常和多態(tài)性變異與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義， 可見影響男性精子生成的主要因素為性染色體異常。

克氏(Klinefelter)綜合征(47,XXY)，是導(dǎo)致男性不育常見的遺傳因素， 臨床特征主要表現(xiàn)為睪丸發(fā)育障礙、不育、體征呈女性化傾向和性腺機能減退；其發(fā)生機制主要是配子形成時減數(shù)分裂中的性染色體不分離或受精卵卵裂時X 染色體不分離所致[9]。在本研究中檢出47,XXY 共145 例，主要表現(xiàn)為無精癥和嚴(yán)重少精子癥，特別是在無精子癥組其檢出率高達8.74%。 在本研究中檢出7 例男性性反轉(zhuǎn)核型，均為無精子癥；該類患者一般外生殖器正常，成年后因不育而就診，其典型特征為46,XX 核型、正常男性表型、小睪丸、無精子癥和性腺功能減退。 絕大多數(shù)患者能檢測到SRY 基因的存在， 其機制為減數(shù)分裂時靠近Y 染色體擬常染色體區(qū)域的SRY 基因在交叉互換時轉(zhuǎn)移到了X 染色體上[10]。本研究中檢出4 例涉及X 染色體和常染色體間的平衡易位攜帶者，臨床均表現(xiàn)為無精子癥；X 染色體和常染色體間的平衡易位會導(dǎo)致減數(shù)分裂中X 染色體和Y染色體配對失敗， 幾乎所有的X 染色體和常染色體間的平衡易位攜帶者都因減數(shù)分裂中性染色體聯(lián)會時形成的性泡(Sex Vesicle)破壞使精子發(fā)生停滯而不育；而精子發(fā)生需要正常的性泡形成， 對其任何干擾都會影響精子的發(fā)生過程[11]。

羅伯遜易位是最常見的平衡性染色體重排， 人群發(fā)病率約為千分之一[12]，羅伯遜易位的攜帶者通常表型正常，但可產(chǎn)生不平衡的配子。 有文獻報道在男性不育人群中羅伯遜易位攜帶者3.8%表現(xiàn)為無精子癥，84.6%為少精子癥[13]，其攜帶45,XY,rob(13;14)(q10;q10)的頻率大約是新生兒的10 倍[14]。 本文研究結(jié)果表明精子數(shù)異常組常染色體異常檢出率和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 但在嚴(yán)重少精子癥患者中檢出14 例45,XY,rob(13;14)(q10;q10)，和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在無精子癥組和少精子癥組各檢測出2 例45,XY,rob(13;14)(q10;q10)。 另外檢測出其他羅伯遜易位核型5例，3 例為嚴(yán)重少精子癥，2 例為少精子癥。 有研究認為羅伯遜易位可能導(dǎo)致減數(shù)分裂中聯(lián)會異常， 不能形成配子，也可能由于減數(shù)分裂檢驗點的干預(yù)，使細胞不能進入減數(shù)分裂第二次分裂而發(fā)生凋亡， 從而影響精子的發(fā)生導(dǎo)致不育[15]。本研究在常染色體異常中檢出涉及1 號染色體的平衡易位攜帶者5 例和倒位攜帶者4 例，其中2 例為無精子癥，5 例為嚴(yán)重少精子癥，2 例為少精子癥。 有文獻報道表明易位或倒位斷點涉及1 號染色體p13、p36、q12、q21、q24、q25 和q32 區(qū)域時可能影響精子發(fā)生，導(dǎo)致無精癥或少精癥，本研究檢測出的1號染色體上易位和倒位斷點區(qū)域與文獻報道類似；其發(fā)生機制可能為影響了染色體的配對、聯(lián)會；也有研究認為1 號染色體可能帶有影響男性生育的重要染色體結(jié)構(gòu)域，其破壞可導(dǎo)致不育；也可能是易位或倒位在染色體上的斷點破壞了精子發(fā)生的關(guān)鍵基因[16,17,18]。

本研究中Y 染色體微缺失在精子數(shù)異?；颊咧袡z出率為6.64%，和Elfateh F 等[19]報道的中國東北地區(qū)Y染色體微缺失檢出率12.95%相比要低， 可能是不同地區(qū)遺傳背景、 研究的樣本人群和檢測位點不同等因素導(dǎo)致的。 在嚴(yán)重少精子癥組Y 染色體微缺失檢出率最高，達10.91%，和其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 在所有缺失類型中檢出率最高的為AZFc 缺失， 占比為66.67%，與文獻報道類似[19]。Y 染色體特異性部分(male specific region,MSY)中發(fā)現(xiàn)有大量的回文序列，回文序列基因?qū)χg有高度的同源性， 每個基因在回文結(jié)構(gòu)中均存在兩份拷貝[20]；有研究認為AZFc 區(qū)的缺失是該區(qū)域同源序列重組導(dǎo)致的[21]。研究資料表明，AZFa 區(qū)域的完全缺失會導(dǎo)致患者生精組織病理類型為唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，AZFb 區(qū)域的全缺失會影響精母細胞減數(shù)分裂， 使生殖細胞成熟停滯，而AZFc 區(qū)的全缺失臨床表現(xiàn)為無精子癥或嚴(yán)重少弱精子癥[22]。 本研究中檢測出1 例部分AZFa 缺失(sY84 缺失) 為少精子癥，2 例AZFb 為嚴(yán)重少精子癥，其余AZFa 和AZFb 缺失均表現(xiàn)為無精子癥；AZFc 缺失中32.20%為無精子癥，63.56%為嚴(yán)重少精子癥，4.24%為少精子癥；而涉及更大片段缺失的AZFbc 和AZFabc缺失均表現(xiàn)為無精子癥。 目前認為AZFa 和AZFb 缺失的無精子癥患者很難通過睪丸取精術(shù)(testicular sperm extraction,TESE) 獲得精子， 而AZFc 缺失患者通過TESE 獲得精子的幾率較高[23]；有研究報道AZFc 缺失患者通過顯微睪丸取精術(shù)(microscopic TESE,mTESE)成功獲得精子的幾率為70.4%[24]。

本研究中共檢出32 例Y 染色體微缺失合并性染色體核型異常或多態(tài)性的患者， 其主要為涉及大片段缺失類型的AZFabc 和AZFbc 缺失，11 例AZFabc 缺失患者其核型均異常，28 例AZFbc 缺失患者中有17 例(60.71%)核型異常。 有文獻報道認為AZF 區(qū)域的微缺失不僅與精子發(fā)生有關(guān)，還會影響Y 染色體的穩(wěn)定性，可能引起Y 染色體易位、缺失或丟失[25]。 Y 染色體長度的變異包括Yqh-(小Y，Y≤21 號染色體)和Yqh+(大Y，Y≥18 號染色體)，其通常被認為是人類染色體多態(tài)性的一種，但越來越多研究表明Yqh- 和男性不育有很大關(guān)系；其機制可能為Yqh- 的異染色質(zhì)部分或者完全丟失，引起常染色質(zhì)排列疏松，造成基因功能喪失和精子生成異常； 或是小Y 染色體染色質(zhì)排列過度緊密影響其功能的發(fā)揮；也可能為Yqh-中有很高幾率的Y 染色體微缺失存在導(dǎo)致生精障礙[26,27]。本研究檢測出的18例Yqh-全部精液異常，且15 例(83.33%)合并有Y 染色體微缺失， 可見Y 染色體微缺失是導(dǎo)致其生精障礙的主要原因。 這提示我們在臨床上遇到男性不育患者出現(xiàn)Yqh-時，應(yīng)建議其進行Y 染色體微缺失檢測。

本研究在2664 例精子數(shù)異常的男性不育患者中檢出染色體核型異?；?和)Y 染色體微缺失異常387例(14.53%)，可見染色體核型異常和Y 染色體微缺失是導(dǎo)致男性生精障礙的主要遺傳原因。 染色體平衡易位或羅伯遜易位攜帶者不僅和男性不育相關(guān)， 還可在減數(shù)分裂中形成不平衡性配子導(dǎo)致胎兒畸形和流產(chǎn)；而AZFc 缺失的患者大多可通過卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)獲得后代，但同時也可將遺傳缺陷傳給男性胎兒。 鑒于此，針對由遺傳因素導(dǎo)致不育的男性患者， 在進行輔助生殖時進行胚胎植入前基因檢測 (preimplantation genetic testing,PGT)顯得非常重要。 在本中心就診的患者主要來自于重慶、四川和貴州等西南地區(qū)，通過本文的分析研究顯示遺傳因素是導(dǎo)致該地區(qū)男性不育的重要原因， 可見對男性不育癥患者進行常規(guī)染色體核型分析和Y 染色體微缺失檢查， 對疾病的診斷和治療方案的選擇是非常有必要的。