張婷婷，劉峰

技術與方法

斑馬魚蛋白酪氨酸硫酸化修飾的檢測方法研究

張婷婷1,2，劉峰2

1. 中國科學技術大學生命科學與醫(yī)學部，合肥 230026 2. 中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室，中國科學院大學，北京 100101

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是一種重要的翻譯后修飾，調(diào)控生命活動中多種生理和病理過程，但由于PTS狀態(tài)不穩(wěn)定且目前缺乏有效的富集方法，因此在生物樣品中難以進行有效地檢測。本研究以模式動物斑馬魚()為研究材料，利用Orbitrap Exploris 480高分辨質(zhì)譜儀檢測了斑馬魚胚胎發(fā)育早期總蛋白的酪氨酸硫酸化修飾水平，通過該方法共計檢測到26種蛋白(包括膜蛋白、分泌蛋白、胞質(zhì)蛋白和核蛋白等)存在潛在的29個酪氨酸硫酸化修飾位點。本研究建立了斑馬魚胚胎發(fā)育早期蛋白酪氨酸硫酸化修飾的檢測方法，為探索生物體蛋白硫酸化修飾的作用機制奠定了技術基礎。

斑馬魚；蛋白酪氨酸硫酸化；高分辨質(zhì)譜

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是真核生物中一種常見的翻譯后修飾，該修飾于1954年在一種源自牛纖維蛋白原的多肽中被首次報道[1]。硫元素主要以無機硫酸鹽的形式存在于生物體中，它需要代謝活化成有機硫酸鹽才能被生物體進一步利用。在這一過程中，無機硫酸鹽與腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)在ATP硫酸化酶的催化下反應形成腺苷-5′-磷酸硫酸鹽(adenosine-5′-phosphosulfate, APS)和焦磷酸鹽；隨后，APS與ATP在APS激酶催化下形成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸鹽(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate, PAPS)和腺嘌呤核苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)；最后，酪氨酸蛋白硫酸轉移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST)將活化的硫酸基團從PAPS轉移到多種蛋白質(zhì)和多肽中的酪氨酸活性基團上[2]。

酪氨酸硫酸化修飾在動植物中均有報道。酪氨酸硫酸化多肽是植物生長發(fā)育的關鍵調(diào)控因子[3]，例如：擬南芥()成熟胚乳釋放硫酸化的凱氏帶完整性因子(casparian strip integrity factors, CIFs)家族的CIF2多肽，以及含酪氨酸硫酸化植物多肽(plant peptides containing sulfated tyro-sine, PSYs)家族的PSY1多肽，共同促進幼苗角質(zhì)層的發(fā)育[4]。近年來，科學家逐漸認識到PTS在動物發(fā)育過程中的作用及其與疾病的聯(lián)系。該修飾可以調(diào)節(jié)細胞外蛋白與蛋白之間的相互作用，進而引發(fā)多種生理和病理反應[5]。在哺乳動物中，趨化因子受體CXCR4、CXCR3和CX3CR1可被酪氨酸硫酸化[6,7]。其中，CXCR4是七次跨膜結構域G蛋白偶聯(lián)受體，其N端硫酸化修飾的第7、12和21位酪氨酸位點可以促進CXCR4與趨化因子CXCL12結合，從而誘導G蛋白激活[8]。P-選擇素糖蛋白配體-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)在細胞表面以二硫鍵連接的二聚體形式表達。PSGL-1包含胞外結構域、跨膜結構域和細胞質(zhì)結構域[9]，當機體發(fā)生炎癥反應時，中性粒細胞上發(fā)生硫酸化修飾后的PSGL-1與內(nèi)皮細胞表達的P-選擇素之間的親和力會加強，進而介導中性粒細胞的黏附及其向炎癥部位的遷移[10]。在動脈粥樣硬化小鼠()模型中，造血祖細胞TPST活性的丟失可顯著減輕小鼠動脈粥樣硬化癥狀，其原因在于硫酸化的PSGL-1和CX3CR1會參與白細胞的募集[11]。

PTS在細胞內(nèi)的豐度很低，因缺乏有效的硫酸化肽段富集方法，在生物樣品中難以檢測。目前，僅在膜蛋白和分泌蛋白中檢測到硫酸化修飾，其中包括人類()和小鼠中的趨化因子受體、PSGL-1以及水蛭()唾液腺分泌的水蛭素等[12,13]。作為脊椎動物模型之一，斑馬魚()在發(fā)育生物學以及疾病研究等方面的應用較為廣泛，但是有關其體內(nèi)的蛋白酪氨酸硫酸化修飾位點的研究卻尚未見有相關報道。

質(zhì)譜技術是一種常用的檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方法，其中有效富集修飾的方法對于PTS的檢測至關重要[14]。本研究首先采用弱陰離子交換柱(weak anion exchange column，WAX column)富集斑馬魚胚胎總蛋白樣品中的硫酸化肽段，隨后利用Orbitrap Exploris 480高分辨質(zhì)譜儀檢測斑馬魚中潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點。本研究共發(fā)現(xiàn)26種蛋白存在潛在的29個酪氨酸硫酸化修飾位點，為今后探究斑馬魚PTS的作用機制提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

研究使用的實驗試劑、實驗儀器以及相關溶液配制的詳細信息見表1～3。

1.2 斑馬魚胚胎總蛋白提取和濃度測定

首先，取約40枚脫膜的受精后5.5天野生型斑馬魚胚胎，吸干水分，放在液氮中速凍后加入240 μL 8 mol/L尿素裂解液，立即進行超聲處理(程序設定：工作30 s，暫停90 s，8個循環(huán))。隨后，將樣品于4℃靜置1 h以上，15,000 r/min離心15 min；取上清液至新的EP管中，再次15,000 r/min離心15 min。取20 μL上清樣品用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定(后續(xù)實驗依據(jù)此濃度進行蛋白定量)。

1.3 考馬斯亮藍染色法檢測蛋白樣品質(zhì)量

取40 μg蛋白樣品(具體體積視蛋白濃度而定)，加入1/5體積的蛋白上樣緩沖液，置金屬浴98℃約10 min。隨后，配置12% SDS-PAGE蛋白凝膠，將蛋白樣品點入膠孔。電泳結束后，切取相應的凝膠，放入適量考馬斯亮藍染液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于側擺搖床上以20 r/min，搖動12 h。次日，倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于側擺搖床上緩慢搖動。期間更換脫色液4～6次，直至藍色背景基本上全部被洗脫，并且蛋白條帶染色效果達到預期。

表1 實驗試劑

表2 實驗儀器

表3 溶液配制

1.4 酶切法制備肽段

采用溶液內(nèi)酶切法(in solution digestion)制備肽段和C18脫鹽柱進行脫鹽[15～17]。

首先，將蛋白樣品溶于8 mol/L尿素中(含50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.0)，加入10 mmol/L DTT (終濃度)，37℃孵育4 h后取出放至室溫。隨后，加入50 mmol/L IAA (終濃度)，室溫避光反應1 h。用50 mmol/L NH4HCO3稀釋至1/8后，加入蛋白質(zhì)量2%的胰酶(溶于50 mmol/L NH4HCO3)，37℃孵育過夜(約18 h)。次日，將酶切的樣品取出，加入1% TFA (終濃度)，終止酶切反應。

終止反應后，采用C18脫鹽柱進行脫鹽。首先，用封口膜將脫鹽柱固定在固相萃取機的孔位上，依次加入100% MeOH、70% ACN，0.1% FA、0.1% FA，活化C18柱。待液體完全流出后，向脫鹽柱中注入全部樣品。隨后，向脫鹽柱中注入0.1% FA，重復3次，用100% MeOH溶液清洗C18柱，收集溶液進行凍干(程序設定：設置溫度30℃，開始濃縮，后期更改為20℃，直至樣品管底部看不到液滴)。凍干后樣品存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 弱陰離子交換柱富集硫酸化肽段

采用弱陰離子交換柱(WAX column)富集硫酸化肽段[14]和StageTips式脫鹽處理[18]，對用于檢測PTS的酶切樣品進行質(zhì)譜上機前處理。首先，用50 mmol/L NH4Cl溶液預處理弱陰離子交換柱(WAX column)，將用50 mmol/L NH4Cl重懸的酶切產(chǎn)物溶液過柱。隨后，梯度NH4Cl溶液(200 mmol/L, 400 mmol/L, 600 mmol/L, 800 mmol/L, 1 mol/L, 2 mol/L, 4 mol/L)依次過柱，收集7次過柱溶液進行凍干。

凍干樣品采用Empore固相萃取膜片制作的StageTips進行脫鹽。首先，截取合適體積的柱體，用100% MeOH洗柱，保持柱子濕潤，依次用Buffer B (80% ACN，0.5% AcOH)和Buffer A (0.5% AcOH)洗柱。隨后，將用100% MeOH重懸的樣品過柱，用Buffer A洗柱后，用Buffer B洗柱2次，收集過柱液。凍干后，向凍干粉中加入0.1% FA，使蛋白濃度約為0.5 μg/μL。最后，將樣品轉移至30 μm孔徑的過濾柱中，14,000 r/min 離心10 min，離心結束后，取8 μL轉移至樣品管，用Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀進行檢測。

1.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜采集到的數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer (ver. 1.4.0.288, Thermo Fisher)軟件進行分析比對，比對數(shù)據(jù)庫中斑馬魚Fasta格式蛋白質(zhì)序列下載于UniProt網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)。分析參數(shù)設定：(1)固定修飾：Carbamidomethyl (C)；(2)可變修飾：Sulfo(Y)，Oxidation(M)和N端deamidated；(3) MS tolerance為10 mg/L，MS/MS tolerance為0.6 Da； (4)可信蛋白質(zhì)的篩選條件：unique peptide≥1， FDR≤0.01。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚胚胎蛋白的酪氨酸硫酸化修飾檢測

斑馬魚胚胎蛋白的酪氨酸硫酸化修飾檢測流程如圖1A所示。首先，用尿素裂解液提取斑馬魚胚胎期總蛋白，并利用考馬斯亮藍染色法檢測蛋白豐度(圖1B)。隨后，通過酶切制備總蛋白的肽段，并對肽段進行質(zhì)譜檢測，經(jīng)分析比對后，共鑒定出2861種蛋白，酶切肽段的質(zhì)量準確度分布圖顯示理論值和實際值之間的誤差落在±10 mg/L區(qū)間內(nèi)(圖1C)。為了進一步富集硫酸化肽段，本研究用弱陰離子交換柱(WAX column)對酶切肽段進行處理，并依次收集7次過柱溶液。最后，本研究采用Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀檢測富集后的肽段，通過Proteome Dis-coverer軟件比對，鑒定出斑馬魚胚胎期總蛋白中26種蛋白潛在的29個酪氨酸硫酸化修飾位點(表4)。

圖1 斑馬魚胚胎期總蛋白酶切肽段質(zhì)量控制

A：斑馬魚胚胎期總蛋白酪氨酸硫酸化修飾檢測流程圖；B：考馬斯亮藍染色法檢測蛋白樣品的條帶豐度，兩條Urea lane是技術重復；C：酶切肽段的質(zhì)量準確度分布圖，顯示測量誤差分布在±10 mg/L以內(nèi)。

2.2 蛋白酪氨酸硫酸化修飾位點的分析

基于斑馬魚ZFIN數(shù)據(jù)庫(https://zfin.org/)和UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)的信息，以及相關文獻報道。在26種存在潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點的蛋白中，CD44a[19]、Lancl1和Adgrf3b[20]定位于細胞質(zhì)膜；Myof、Mao、Ptprfa、Si:ch211- 264f5.6、Pgrmc1[21]、Ap1m1、Calua和Rasgrf2參與膜的組成；Serpine1和Serpinc1為分泌蛋白；Ybx1[22]、Mybpc3[23]、Ifit17c、Ttll10、Ttn.1、Si:dkey-15f17.8和Si:ch211-278p9.2定位于細胞質(zhì)；Nucks1a[24]、Nfatc1和Cnot1定位于細胞質(zhì)或細胞核；P2rx1、Spen和Rprd1b定位于細胞核。

表4 斑馬魚胚胎中26種蛋白潛在的29個酪氨酸硫酸化修飾位點

以蛋白CD44a和Mybpc3為例，本研究檢測到CD44a蛋白的AGELCQSLG-Y(SO3)-R肽段序列的第10位酪氨酸硫酸化位點可能發(fā)生硫酸化修飾 (圖2A，附圖1A)，該位點位于CD44a蛋白的第59位氨基酸，且處于CD44a蛋白的Xlink功能區(qū)域(33～122位氨基酸)中。功能上，CD44a介導PI3K-Akt信號通路的激活對斑馬魚幼體的存活至關重要[25]。肌球蛋白結合蛋白C3(myosin binding protein C3，Mybpc3)的QLEV-Y(SO3)-QSIADLTVK肽段序列的第5位酪氨酸硫酸化位點可能發(fā)生硫酸化修飾(圖2B，附圖1B)，該位點位于Mybpc3蛋白的第558位氨基酸，且處于Mybpc3蛋白的I-set功能區(qū)域(555～637位氨基酸)中。有研究報道，Mybpc3缺失會導致斑馬魚心肌肥厚和舒張功能障礙，再現(xiàn)了人類心肌肥厚和舒張性心力衰竭的形態(tài)學、機械和電生理表型[26]。此外，本研究鑒定出的其他潛在酪氨酸硫酸化修飾位點，為之后探究其生物學功能提供了線索。

圖2 CD44a和Mybpc3蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點

A：CD44a蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點；B：Mybpc3蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點。

3 討論

PTS作為一種翻譯后修飾，在動植物發(fā)育等生理條件和病理條件下發(fā)揮著重要的作用。除了通過生物信息學分析預測酪氨酸硫酸化修飾潛在的位點外，硫酸化修飾檢測方法還包括放射性法[27]，比色法[28]，熒光法[29]以及質(zhì)譜法[30]。放射性法的靈敏度高，但操作步驟繁瑣；比色法通量高，但靈敏度低；熒光法實時快速，但低水平熒光不易檢測；質(zhì)譜法的靈敏度高，通量高，更加精確。所以，質(zhì)譜分析是鑒定生物樣品中蛋白酪氨酸硫酸化修飾常用的方法。然而，生物體蛋白酪氨酸硫酸化修飾基團的相對分子質(zhì)量(約為79.956815)和蛋白酪氨酸磷酸化修飾基團的相對分子質(zhì)量(約為79.966331)十分接近，兩者之間的相對分子質(zhì)量僅相差0.009516，硫酸化修飾豐度遠低于磷酸化修飾的特點，導致質(zhì)譜法鑒定蛋白酪氨酸硫酸化修飾面臨很多困難[31]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的26種蛋白是否真的存在硫酸化修飾還需要進行重復檢測工作及進一步實驗驗證。此外，蛋白酪氨酸硫酸化修飾基團在質(zhì)譜實驗中易分解發(fā)生中性丟失現(xiàn)象，也可能導致假陰性結果[32]。

本研究中，通過酶切處理后，在斑馬魚胚胎期總蛋白溶液中檢測到2861種蛋白。隨后，僅發(fā)現(xiàn)26種蛋白潛在的29個酪氨酸硫酸化修飾位點。無論是總蛋白數(shù)量還是有潛在的修飾位點的蛋白數(shù)目都偏低。經(jīng)分析可能的原因如下：(1)蛋白提取不充分；(2)某些蛋白豐度很低；(3)硫酸化修飾不穩(wěn)定；(4)溶液內(nèi)酶切提取難溶蛋白效率低。針對上述問題，第一，可進一步優(yōu)化蛋白提取方法，包括蛋白裂解液的選擇、超聲處理時間等。第二，對于一些豐度比較低的蛋白，可以先采用過表達等方式增加蛋白豐度，再采用SDS-PAGE蛋白膠內(nèi)酶切的方法，對某一特定條帶蛋白進行質(zhì)譜樣品上機前處理[33]。第三，酪氨酸硫酸化修飾容易在蛋白樣品處理過程中丟失，尤其是在酸性條件下，所以，在實驗過程中要盡可能避免酸性環(huán)境或減少蛋白樣品處于酸性環(huán)境中的時間。第四，可以嘗試用SDS蛋白裂解液提取蛋白，之后采用基于超濾輔助的樣品制備處理(filter-aided sample preparation, FASP)法進行酶切處理，F(xiàn)ASP法可以在一定程度上避免溶液內(nèi)酶切對一些難溶蛋白提取不充分的問題[34,35]。此外，本研究鑒定出的斑馬魚26種蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾的肽段序列在人和小鼠中只有部分是保守的。以Pgrmc1蛋白的LLKPGEEPTE-Y(SO3)-TDDEEVKDK肽段序列和CD44a蛋白的AGELCQSLG-Y(SO3)-R肽段序列為例，在UniProt中通過Blast比對出人和小鼠中這兩種蛋白對應的肽段序列，其中，斑馬魚Pgrmc1蛋白的酪氨酸位點在人和小鼠中保守，暗示人和小鼠中該位點也可能發(fā)生硫酸化修飾；但是CD44a蛋白的酪氨酸位點在人和小鼠中不保守，這可能是因為斑馬魚基因有多個拷貝，在人和小鼠中沒有相對應的序列。

本研究建立了基于高分辨質(zhì)譜檢測斑馬魚蛋白酪氨酸硫酸化修飾的方法，豐富了蛋白硫酸化修飾的檢測手段。此外，本研究發(fā)現(xiàn)的26種蛋白中潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點可能在斑馬魚胚胎早期發(fā)育中有著十分重要的功能，為后續(xù)蛋白功能及分子機制探索提供了參考?；谀壳暗牡鞍琢蛩峄揎棛z測流程，還需要進一步優(yōu)化蛋白提取條件、酶切方式等，以便檢測到更豐富的蛋白種類，發(fā)現(xiàn)更多的蛋白酪氨酸硫酸化修飾位點。

感謝本實驗室馬東媛博士對文章的閱讀和修改。

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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附圖1 CD44a和Mybpc3蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點

Supplementary Fig. 1 The potential tyrosine sulfation modification sites of CD44a and Mybpc3

A：圖2A的整個質(zhì)譜峰圖，虛線框內(nèi)顯示CD44a蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點；B：圖2B的整個質(zhì)譜峰圖，虛線框內(nèi)顯示Mybpc3蛋白潛在的酪氨酸硫酸化修飾位點。

Study on a detection method of protein tyrosine sulfation modification in zebrafish

Tingting Zhang1,2, Feng Liu2

Protein tyrosine sulfation (PTS) is an important post-translational modification that regulates a variety of physiological and pathological processes. However, PTS is unstable and lacks effective enrichment methods, which make it difficult to be detected in biological samples. In this study, we detected the tyrosine sulfation modification level of total proteins in developing zebrafish embryos by using high-resolution mass spectrometer, Orbitrap Exploris 480. A total of 26 proteins with tyrosine sulfation were detected, including membrane proteins, secreted proteins, cytoplasmic proteins and nucleoproteins. This study established a methodology in detecting protein tyrosine sulfation modification in embryonic zebrafish, which paved the way for evaluating the biological function of PTS.

zebrafish; protein tyrosine sulfation; high resolution mass spectrometry

2022-01-23;

2022-02-02;

2022-02-09

國家重點研發(fā)計劃(編號：2018YFA0800200，2018YFA0801000)、國家自然科學基金委重點項目(編號：32030032，31830061)和中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項(編號：XDA16010207)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (Nos. 2018YFA0800200, 2018YFA0801000), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 32030032, 31830061), and the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, China (No. XDA16010207)]

張婷婷，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物工程。E-mail: zhangtingting@ioz.ac.cn

劉峰，博士，研究員，研究方向：血液與心血管發(fā)育生物學。E-mail: liuf@ioz.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-018

(責任編委: 孫永華)