張楚穹 石娜 歐陽鋼

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一種嚴(yán)重危害中老年女性身心健康的常見病和多發(fā)病[1]，針灸治療有良好的效果，但針灸起效的機(jī)制目前仍未完全明了。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的不斷普及和應(yīng)用，有關(guān)腸道菌群與骨代謝的關(guān)系越來越引起人們的關(guān)注，并成為近年來研究的熱點(diǎn)[2]。已有研究證實(shí)，雌激素的缺乏可通過影響PMOP病人腸道菌群的結(jié)構(gòu)及豐度，進(jìn)而影響骨代謝[3]。我們的前期研究證實(shí)針灸可以通過提高雌激素的水平達(dá)到抗骨質(zhì)疏松癥的目的[4]，為此，我們開展了針刺干預(yù)對PMOP模型大鼠腸道菌群影響的研究，旨在探討針灸治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取3月齡雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，未曾交配，購于南京青龍山動(dòng)物中心 [清潔級，許可證號：SYXX(蘇)2018-0049]。環(huán)境溫度21～25 ℃，相對濕度40%～60%，光照時(shí)間每日12 h，大鼠可自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組(A組)、假手術(shù)組(B組)、模型組(C組)和電針組(D組)，每組8只。造模期間、干預(yù)治療階段大鼠皆自由飲食。本研究通過南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)的認(rèn)證和許可(許可批號:201812A023)，實(shí)驗(yàn)全過程嚴(yán)格遵循2006年9月發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 DNA Marker(北京天根生化科技有限公司，M2202)，PCR預(yù)混合MIX(北京天根生化科技有限公司N2728)，Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit (美國Thermo Fisher Scientific00306196)，SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(大連寶生物科技有限公司A650t-1)，一次性無菌針灸針(無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司0.20 mm×25 mm)，韓氏電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司 HANS-200A)，骨密度檢測儀(法國MEDILINK MEDIX 90)，分析天平(北京塞多利斯科儀器有限公司BSA124S)，精準(zhǔn)電子秤(南京邁博生物科技有限公司MT457A)，Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(英國New England Biolabs)。

1.3 去卵巢(OVX)大鼠模型的建立 取模型組、電針組大鼠，用3%戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，取背側(cè)改良切口，切口位于最下肋下緣一橫指，腰椎旁開一個(gè)半橫指位置，二者交點(diǎn)為切口中心，縱行切開0.8～1 cm，于深部脂肪層中可發(fā)現(xiàn)粉紅色卵巢，子宮角處結(jié)扎后切除卵巢[5]。以手術(shù)后連續(xù)5 d陰道涂片檢查未見成熟脫落上皮細(xì)胞為造模成功指標(biāo)。假手術(shù)組僅切除周圍少量脂肪組織，逐層縫合；空白組不進(jìn)行任何處理。

1.4 電針治療方法 針刺組：造模2周后，不予大鼠麻醉處理，將大鼠裝于自制錐形袋內(nèi)，暴露針刺部位。取穴：(1)關(guān)元、三陰交(雙)；(2)腎俞(雙)、后三里(雙)。每日選取其中一組穴位，兩組穴位交替進(jìn)行，取穴方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]。將針灸針刺入穴位后，接電針儀，刺激強(qiáng)度為2 mA，頻率2 Hz/15 Hz，每次20 min，每日1次，每周連續(xù)治療5 d，間隔2 d，共治療12周?？瞻捉M、假手術(shù)組以及模型組僅常規(guī)飼養(yǎng)，不予特殊處理。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 骨密度檢測：用3 %戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉后，將大鼠腹主動(dòng)脈放血后處死，統(tǒng)一取右側(cè)脛骨、股骨，剔除組織后用PBS沖洗，再用骨密度儀逐一掃描，測出脛骨、股骨的骨密度。

1.5.2 16S rDNA擴(kuò)增子測序：將收集的大鼠糞便進(jìn)行預(yù)處理后，采用SDS方法提取樣本的基因組DNA，并檢測其濃度和純度，然后使用稀釋后的基因組DNA為模板，以細(xì)菌正向引物341F和反向引物805R對細(xì)菌16S rRNA 基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，然后使用illumina平臺(tái)測序(天根生化科技有限公司)，所得序列使用Uclust v1.2.22軟件進(jìn)行聚類得到分類操作單元(Operational Taxonomic Units，OTU)[7]。在菌群OTU水平上計(jì)算Shannon和Simpson指數(shù)來評估菌群的多樣性，同時(shí)對物種豐度進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)及分類注釋。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度比較 12周后，A組與B組比較，骨密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組與A組、B組比較，骨密度值明顯降低(P<0.05)，提示造模成功；D組較C組骨密度值明顯提高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脛骨、股骨的骨密度比較

2.2 大鼠腸道菌群檢測結(jié)果 電針治療12周后，采集4組大鼠糞便樣本，對腸道菌群的16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序。結(jié)果以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類分析。

2.2.1 OTUs分析：據(jù)聚類得到的OTUs分析結(jié)果和研究需求，分析組與組之間、各樣本之間共有以及特有的OTUs，本研究小組數(shù)小于5，將結(jié)果繪制成韋恩圖(Venn Graph)，從圖1中可以看出，D組的OTUs數(shù)目較C組明顯增多。

圖1 4組OTUs分析結(jié)果

2.2.2 菌群分布情況：與A組、B組相比，C組的軟壁菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門豐度增加(P<0.05)，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、 黑水仙菌門豐度降低(P<0.05)。與C組相比，D組的厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、黑水仙菌門豐度增加(P<0.05)，軟壁菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門豐度降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 電針對菌群門分類水平影響柱狀圖

與A組、B組相比，C組擬桿菌屬、乳桿菌屬和腸球菌屬的豐度降低(P<0.05)。與C組相比，D組擬桿菌屬、乳桿菌屬和腸球菌屬的豐度增加。見圖3。

圖3 電針對菌群屬分類水平影響柱狀圖

與A組、B組相比，C組加氏乳酸菌和耐久腸球菌的豐度降低(P<0.05)。與C組相比，D組加氏乳酸菌和耐久腸球菌的豐度增加(P<0.05)。C組羅伊氏乳桿菌豐度較A組呈增加趨勢(P>0.05)，較B組、D組降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 電針對菌群種分類水平影響柱狀圖

3 討論

腸道菌群是寄生于腸道的微生物群體，包括細(xì)菌、古生菌、真菌和病毒，它有人體細(xì)胞數(shù)量的10倍之多，又被稱為人類的“第二基因組”[8]。在已知的眾多種類的微生物中，絕大多數(shù)為厚壁菌、擬桿菌、微藻、放線菌和變形桿菌，這些微生物通過幫助食物消化吸收、分泌代謝產(chǎn)物、保護(hù)黏膜屏障功能，在維持人體健康中發(fā)揮重要作用[9]。近年來，隨著人們對腸道微生物認(rèn)識的不斷加深，腸道微生物與骨代謝的關(guān)系已越來越引起人們的關(guān)注[10]。一項(xiàng)對38例平均年齡為62.9歲的絕經(jīng)后婦女的前臂骨密度與腸道菌群的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，骨密度與腸道菌群關(guān)系密切，低擬桿菌組的骨折發(fā)生率明顯升高，提示擬桿菌屬是調(diào)節(jié)骨代謝非常重要的菌屬之一[11-12]。王飆等[13]觀察了7例原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥病人與7例健康對照者的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)2組腸道菌群種類及數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，芽單胞菌門、綠彎菌門、厭氧繩菌科、優(yōu)桿菌等腸道菌群在骨質(zhì)疏松癥組中所占比例明顯高于健康對照組，且綠彎菌門和酸桿菌門為骨質(zhì)疏松癥組特有。因骨質(zhì)疏松的病因和發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是涉及多個(gè)器官的復(fù)雜病變，提示腸道菌群門、屬、種水平上的差異可能是骨質(zhì)疏松病人因骨代謝引起腸道菌群變化的原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PMOP發(fā)病的主要原因是由于雌激素水平下降影響了腸道菌群與宿主之間的動(dòng)態(tài)平衡，特別是導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度發(fā)生改變而引發(fā)免疫、炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸道的通透性增加[3]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，D組除骨密度較C組大鼠顯著提高外，其大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)也較C組變化明顯，例如，在屬水平上，擬桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬變化明顯，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果基本一致[14]。在種水平上，少數(shù)與骨形成相關(guān)的菌種發(fā)生變化，其中羅伊氏乳桿菌顯著增多，現(xiàn)有的研究證實(shí)羅伊氏乳桿菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、乙醇和羅伊氏乳蛋白等分子具有抗菌活性，能抑制病原微生物的定植、改變宿主體內(nèi)共生菌群的組成，增強(qiáng)腸道屏障的能力，減少微生物從腸腔向組織的遷移[15]，同時(shí)羅伊氏乳桿菌能夠改善OVX大鼠的骨鈣流失，通過免疫調(diào)節(jié)改善骨質(zhì)，減少破骨細(xì)胞的生成[16-17]。以上結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)中變化明顯的擬桿菌群和羅伊氏桿菌群等，可能是針刺干預(yù)下OVX大鼠骨密度增加的主要影響因素。由于本研究僅為針刺對OVX大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的初步研究，暫未涉及詳細(xì)的菌群通過何種機(jī)制影響骨質(zhì)，其確切的機(jī)制有待日后進(jìn)一步研究。