和玉鳳,張關(guān)能**,劉恩芬,付玲凡,和春龍
(1.云南聯(lián)大科技產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司,云南 昆明 650500;2.云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司,云南 昆明 650106)
三七(Panaxnotoginseng),又名人參三七、田七、文州三七、參三七,味甘,微苦,無毒,是中國享譽海內(nèi)外的傳統(tǒng)名貴中藥材,其根和葉都可以做藥,具有“散瘀止血、消腫定痛、益氣活血”等效果[1]?,F(xiàn)代藥理藥效研究[2-5]發(fā)現(xiàn),三七對心腦血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病防治都有顯著的療效,有享“參中之王”“金不換”“南國神草”等美譽。
三七的成分構(gòu)成十分復(fù)雜,其中含有多糖、黃酮、三七皂苷、多種微量元素、多肽類化合物[6]等化學(xué)物質(zhì),這些成分是三七吸水性較強的主要因素。因此,在三七的生產(chǎn)、加工、包裝、運輸、存儲等過程中,即使已經(jīng)加強注意,但三七還是容易出現(xiàn)發(fā)霉、變質(zhì)等現(xiàn)象[7]。云南作為三七的主產(chǎn)區(qū),全國95%以上的三七都來自云南。據(jù)行業(yè)協(xié)會統(tǒng)計,云南省在2015年,三七種植面積就達到6.72萬hm2(100.8萬畝),三七交易收入高達103億元人民幣,三七的年產(chǎn)量為4.9萬噸[8]。隨著國家的技術(shù)支持,三七種植貯藏規(guī)模也越來越大,出現(xiàn)的霉變情況也隨著增多,造成的損失也越來越大。宋美芳等[9]從自然儲藏后霉變的三七中分離到擬青霉屬、青霉素和鐮刀菌屬真菌,其中淡紫擬青霉和桔青霉為優(yōu)勢菌,同時分離到三七致病菌尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌。王炳艷等[10]采用發(fā)霉三七挑選出菌絲進行培養(yǎng)和純化,分離到了米曲霉舒展變種、塔賓曲霉、日本曲霉原變種、炭黑曲霉、粒落曲霉、寄生曲霉、聚多曲霉、毒曲霉、合陽曲霉、多育曲霉、溜曲霉、兩形頭曲霉、肇慶曲霉和黃曲霉柱頭變種等14種曲霉。
本研究從霉變的三七粉中分離出了赭綠青霉(P.ochrochloron)、橘青霉(P.citrinum)、黃曲霉(A.flavus)、拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)、草酸青霉菌(P.oxalicum)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和土曲霉(A.terreus)等7種霉變真菌,并鑒定出了橘青霉和黃曲霉兩種,結(jié)果表明霉變?nèi)咧幸呀?jīng)含有霉菌毒素,建議人們不要食用已霉變?nèi)?,也為三七存儲提供一些參考依?jù)。
三七粉:采購于文山三七國際交易市場。
PDA培養(yǎng)基:用天平稱取馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂粉 20 g(液體培養(yǎng)基不加),自然pH。配制的方法為:將土豆去皮后稱重,切成小塊或絲狀,保持沸騰狀態(tài)15~20 min,期間不斷攪拌,防止鍋底的淀粉沉淀煮糊,采用雙層紗布進行過濾,然后加入葡萄糖,用水定容至 1 L,進行分裝并封口,后于 121 ℃ 高溫滅菌鍋中滅菌 30 min。
1.2.1 真菌菌株的分離和純化
用天平秤取 10 g 三七粉裝入 250 mL 錐形瓶,再用量筒量取 100 mL 無菌水加入錐形瓶,此時相當(dāng)于稀釋了10倍,放入 28 ℃、160 r/min 的條件下振蕩 30 min,靜置 5 min,在超凈工作臺中取上清液梯度稀釋為100倍、 1000倍,分別取各濃度稀釋液 0.2 mL,加到直徑為 9 cm 的培養(yǎng)皿中,進行涂板。使用已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基,加熱融化,待冷卻至 50 ℃ 左右加入氯霉素(使氯霉素質(zhì)量濃度為 10 μg/mL)后倒板,放置 30 min 左右冷卻凝固后即可以涂板,每個梯度的涂4皿,同時用無菌水涂4個板作為對照,涂板完成后用封口膠封口,置于 28 ℃ 的培養(yǎng)箱中,黑暗培養(yǎng) 4 d。取出培養(yǎng)基,數(shù)清菌落數(shù)。用接種針挑選出含真菌單菌落的樣本,轉(zhuǎn)移到其他新的培養(yǎng)基上,得到單一真菌,如果得到的不是單菌落再重復(fù)上一步。
1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定
用接種針挑取出單一真菌,接種于PDA培養(yǎng)基上,觀察菌落形態(tài)相同的視為同一菌株,篩選到9個菌株,分別標(biāo)記為37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6和37-7、37-8和37-9。
根據(jù)霉變菌落、分生孢子形態(tài)及分生孢子梗的觀察結(jié)果,參考《常見與常用真菌》[9]《真菌鑒定手冊》[10]進行霉變菌的形態(tài)鑒定。
1.2.3 真菌的rDNA-ITS分子鑒定
按真菌rDNA-ITS分子鑒定法提取DNA,通過參考曹永軍等[11]的步驟進行擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送到昆明擎科生物科技有限公司測序。
1.2.4 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
根據(jù)測序結(jié)果并在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中比對找出同源序列,利用分子進化遺傳分析軟件(MEGA5.1)通過鄰接法構(gòu)建各菌株相關(guān)基因標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹,綜合形態(tài)鑒定結(jié)果,進一步鑒定個菌株所屬的種屬分類地位。
分離后根據(jù)細(xì)菌、真菌和放線菌菌落形態(tài)的不同進行初步篩選,篩選結(jié)果見表1。
表1 初步分離菌落數(shù)
從結(jié)果看,分離時出現(xiàn)了大量的細(xì)菌菌落,經(jīng)形態(tài)觀察,大致分為6種,其中5種表面干燥,應(yīng)該為革蘭氏陽性菌;同時有一皿出現(xiàn)5個放線菌菌落,這些菌落在PDA培養(yǎng)基菌落致密,菌落呈放射狀,表明干燥,菌落為白色,5個菌落形態(tài)大致相同,可能是同一種放線菌。根據(jù)霉菌形態(tài)大致相同的并為1種,分離到9株真菌。
把2.1中分離到的9株真菌,按37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7、37-8和37-9標(biāo)識,并觀察真菌菌落形態(tài),如圖1所示。對曲霉和青霉的分生孢子和菌絲進行觀察,如圖2所示。
圖1 霉菌菌落形態(tài)(37-1到37-9)
圖2 曲霉和青霉分生孢子和菌絲
結(jié)合分子鑒定結(jié)果可知,37-1、37-4和37-7都可能是拜賴青霉;同時,通過菌株孢子的觀察,37-5、37-6、37-9分生孢子梗末端為具有頂囊,頂囊表面四周或上半部著生一層或兩層呈輻射狀排列的小梗,應(yīng)該為曲霉。37-2、37-3和37-8等幾個菌株的分生孢子梗頂端多次分枝成掃帚狀、分枝頂端著生小梗,符合青霉分生孢子形態(tài)[12]。
2.3.1 擴增產(chǎn)物rDNA測序條
對擴增產(chǎn)物用測序儀進行分析測定,通過NCBI分子鑒定比對結(jié)果:37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%;37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%;37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%;37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%;37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%;37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%;37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%;37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%;37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%。
2.3.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
因為菌株較多,本文選取一個青霉(37-1),一個曲霉(37-5)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
通過NCBI分子鑒定比對結(jié)果,用系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別菌株親緣關(guān)系,再結(jié)合形態(tài)鑒定可得:37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%,為拜賴青霉;37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%,為草酸青霉菌;37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%,為赭綠青霉;37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%,為拜賴青霉;37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%,為煙曲霉;37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%,為土曲霉;37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%,為拜賴青霉;37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%,為橘青霉;37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%,為黃曲霉。
在實驗過程中發(fā)現(xiàn),分離時細(xì)菌菌落數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌落數(shù)量,考慮其中一些菌落中,存在一些具有抑制真菌生長的細(xì)菌。為了驗證這個猜想,又進行了一系列實驗。
初步篩采用菌落對峙試驗,用接種針挑取黃曲霉接種于PDA平板中央, 3 cm直徑外用接種環(huán)接種6個菌株(Z-1到Z-6)菌液,28 ℃ 培養(yǎng)7 d, 觀察生長狀況及抗菌表型。結(jié)果Z-1到Z-4都有抑菌作用,Z-1效果最好,結(jié)果見圖3。另外,三個較差,所以淘汰掉效果不好和沒有效果的菌株,只留下Z-1。
圖3 Z-1對黃曲霉的抑制作用
因為Z-1效果很好,所以對該菌株進行了生理生化鑒定和分子鑒定。菌株的生理生化特征結(jié)果見表2。
表2 菌株Z-1的主要生理生化特征
生理生化鑒定參考,分子鑒定參考。NCBI對比結(jié)果顯示Z-1與Bacillusvelezensisstrain CD91相似度達到100%,結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果,可以鑒定Z-1為絲狀芽孢桿菌(Bacillusvelezensi)。霉菌廣泛分布于自然界,不少霉菌都會產(chǎn)生對人畜有害的霉菌毒素。因此霉菌與霉菌毒素對食品的污染越來越受到人們的重視。中藥材受到真菌污染的情況很常見,各種藥材受到真菌污染程度不同,污染真菌種類也不同。國外,Wongwiwat Tassaneeyakul 檢測了泰國28種中藥產(chǎn)品,受到黃曲霉毒素污染中藥產(chǎn)品有18%[17]。M.Halt對62份藥用植物和11份藥茶用品進行檢測,赭曲霉毒素和黃曲霉毒素為主要污染毒素[18]。國內(nèi),陳微對18種中藥材表面真菌及真菌毒素污染研究發(fā)現(xiàn)12種優(yōu)勢真菌中10種以可以產(chǎn)毒,產(chǎn)生的毒素包括黃曲霉毒素[19]。宋美芳等對云南草果表面真菌進行分離鑒定表明草果污染菌中的優(yōu)勢菌為淡紫擬青霉和黃曲霉[20]。Z-1菌株對黃曲霉抑制效果極為顯著,具有極高的生防潛力。
實驗從霉變?nèi)叻壑蟹蛛x得到9個菌株,其中有3個曲霉和6個青霉,有3個青霉為同一種,即分離得到2屬7種霉菌,其中的桔青霉,煙曲霉和黃曲霉都會產(chǎn)生霉菌毒素。表明霉變的三七粉受到霉菌毒素污染的威脅。三七粉的價格相對較高,在日常生活中,往往會由于存貯不當(dāng)或者存放時間太長等一些情況導(dǎo)致三七粉發(fā)生霉變現(xiàn)象,有些肉眼看到的霉變情況不太嚴(yán)重,直接丟棄比較浪費。三七粉具有藥用價值,僅考慮可能降低了藥效,但是往往忽略了霉變產(chǎn)生的霉菌毒素的攝入可能對身體帶來更大的危害,有些毒素含量達到一定的濃度,甚至可能致死。