盤振杰,楊敏芬,黃秋萍,張貞發(fā),王 強
(廣西民族師范學院化學與生物工程學院,廣西 崇左 532200)
非瑟酮,又名漆黃素,化學名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮,能溶于酒精、丙酮、醋酸、燒堿溶液[1],有廣泛的藥理作用,具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染等多種活性[2-3]。當代藥理學研究證實,非瑟酮抗腫瘤作用顯著,其主要是通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移與侵襲等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。β-環(huán)糊精(β-CD) 是由7個D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖化合物,分子形狀略呈錐形,錐腔外存在大量基而呈親水性,錐腔內(nèi)呈疏水性[5]。正是β-CD這類疏水的空腔,允許辨別很多含有疏水基團的化合物,并與其形成主客體包合物的特殊結構與性質,在許多領域具有廣泛的應用。藥物通過與環(huán)糊精形成包合物,可以提高其穩(wěn)定性和溶解性,以增強其生物利用度。本實驗用β-CD與順丁烯二酸及N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺制備環(huán)糊精衍生物,并研究其水溶性、結合常數(shù),以及抗氧化活性。
傅立葉紅外變換光譜儀(美國Perkin Elmer公司);UV-8000紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司);AR224CN電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。β-CD(生化試劑,BR級)、順丁烯二酸酐、氯化亞砜、N,N′-雙(3-氨丙基)乙二胺、非瑟酮、氫氧化鈉、丙酮、無水乙醇、三乙胺、DMF,均為分析純。
將 12 gβ-CD、30 mL DMF、3 mL 三乙胺置于三頸燒瓶中,反應溫度 80 ℃。在此溫度下,緩慢滴加 2 g 順丁烯二酸酐 10 mL 溶液,攪拌反應 8 h,反應結束至冷卻。將反應液慢滴到劇烈攪拌的丙酮中清洗,抽濾,最后在 50 ℃ 下干燥得到化合物B。產(chǎn)率約為72%。合成路線如圖1。
圖1 合成路線
將 6 gβ-CD順丁烯二酸單酯粉末,溶于 12 mL DMF中,加入 15 mL 氯化亞砜,反應 2 h。滴加甲醇,除去多余的氯化亞砜,直至沒有氣泡冒出。加入 20 mL N′,N-二(3-氨丙基)乙二胺,在 80 ℃ 下反應 2 h。用丙酮洗滌,抽濾,在 50 ℃ 下干燥 1 d,得到主體C產(chǎn)物。合成路線見圖1。
用 6 mL 蒸餾水溶解 48.54 mg(約 0.035 mmol)的主體,緩慢滴加 20.00 mg(約 0.07 mmol)非瑟酮(用 9 mL 無水乙醇溶解),在 45 ℃ 下密閉反應 4 h。停止反應后冷卻至室溫,在真空干燥箱中 45 ℃ 干燥反應液,得到固體。固體用 2 mL 蒸餾水再次溶解至完全,用 0.45 μm 的纖維素膜過濾,溶液在 45 ℃ 下烘干,得到固體,即為主體-非瑟酮包合物。
測定和計算主體與非瑟酮之間的結合穩(wěn)定常數(shù)采用的是UV法。配制主體乙醇-水(V乙醇∶V水=3∶2)溶液濃度為5.0×10-4mol/L,備用。再配置上述濃度的非瑟酮溶液備用。取10個 5 mL 容量瓶,都加入 200 μL 非瑟酮溶液,每瓶分別加入主體溶液100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μL,得到濃度梯度分別為1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×10-5、4.0×10-5、5.0×10-5、6.0×10-5、7.0×10-5、8.0×10-5、9.0×10-5、10.0×10-5mol/L 的主體-非瑟酮乙醇溶液。然后采用UV測定上述溶液,波長為200~600 nm 范圍,記錄吸光度值(A)。
在干燥的實驗環(huán)境里,將烘干的KBr粉末分別與非瑟酮、主體及主體與非瑟酮的包合物混合均勻,并壓成半透明的薄片,然后采用IR法在500~4000 cm-1內(nèi)對非瑟酮、主體及包合物進行表征。
采用DPPH自由基清除法測定包合物的抗氧化活性。稱取 3.9 mg DPPH自由基,用無水乙醇溶解,定容在 50 mL 容量瓶,得到濃度為2×10-4mol/L 的DPPH醇溶液,備用。稱取 83.78 mg 包合物藥品,用V無水乙醇∶V水=3∶2的混合溶劑溶解,定容在 50 mL 容量瓶,得到濃度為1.0×10-3mol/L 的包合物乙醇溶液。取5支 10 mL 容量瓶,配制一系列質量濃度梯度分別0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL 的包合物乙醇溶液。在測定吸光度之前,先用無水乙醇校正,并于λ=517 nm 處,測量A樣品。隨后,分別加入 2.5 mL 濃度為2×10-4mol/L 的DPPH自由基醇溶液,并盡量混合均勻,在黑暗條件放置 0.5 h。于λ=517 nm 處,測量A空白。最后把樣品換為DPPH溶液,于λ=517 nm 處,測量A對照。重復上述從操作。
根據(jù)公式:K=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100%,可計算出DPPH的自由基清除率。
查閱文獻可知,非瑟酮在λ=300~500 nm 范圍里有紫外吸收,而主體在這波長范圍里幾乎無紫外吸收,因此該實驗通過選擇不改變非瑟酮的濃度而唯獨改變主體的濃度來測量吸光度值(A)。如圖2所示,隨著主體濃度的增加,吸收峰強也隨著增大,可能主體與非瑟酮發(fā)生反應,形成包合物。接著取λ=365 nm 處的吸光度值(A)建立工作曲線。由圖2可知,曲線的線性關系良好。
圖2 主體與非瑟酮結合穩(wěn)定常數(shù)
由于主體與非瑟酮的包合比例是1∶1,所以主體與非瑟酮的反應過程滿足下列計算公式:
式中:C1為主體的初始濃度;C2為客體非瑟酮的初始濃度,α為紫外可見光譜的敏感因子,ΔA為加入客體非瑟酮前后的相對吸強度。取橫坐標為C1,縱坐標為C2C1/ΔA,繪制出線性擬合曲線。由圖1可得知主體與客體非瑟酮的包合過程呈現(xiàn)出的線性關系不錯。
最后依據(jù)擬合曲線的斜率與截距能夠計算出主體與非瑟酮之間的結合穩(wěn)定常數(shù)是:KS=2.1308×105。
圖3為非瑟酮(a),主體(b),主體與非瑟酮包合物(c)的紅外吸收光譜圖。在3圖中可見,a在 3487 cm-1有羥基伸縮振動、在 1649 cm-1有雙鍵伸縮振動、在 1617 cm-1有羰基伸縮振動等;b在 2937 cm-1、2754 cm-1有氨基中等雙峰的伸縮振動。根據(jù)圖3可見,1645 cm-1左右的吸收峰加強,可能是包合物所形成的。同時,觀察到主體與非瑟酮的包合物(c)的特征吸收峰與非瑟酮和主體的特征吸收峰大致相同,因此可得知包合物中和了非瑟酮和主體的吸收峰。正因為這三者所處的環(huán)境、吸收強度均不同,所以峰的強度有所不同。說明了非瑟酮和主體形成了包合物。
圖3 紅外光譜圖
研究清除自由基最常用的方法就是DPPH分析法。自由基DPPH穩(wěn)定存在有機物溶液里,且于λ=517 nm 下具有較好的吸收強度。包合物的孤對電子可以與能夠清除自由基的物質配對,這就導致在該波長下的吸收被削弱乃至消失。它的吸光度值的變化程度能夠作為自由基清除率能力強弱的依據(jù)。如圖4顯示,該包合物的DPPH自由基的清除效果于0.25~1.25 mg/mL 范圍內(nèi)里隨著質量濃度的增加而增大。由此看出該包合物具有較好的抗氧化能力。
圖4 包合物的DPPH自由基清除活性
本文通過水溶液法合成β-CD順丁烯二酸單酯,再與氯化亞砜和N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺反應,從而制得N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺修飾β-CD(主體),然后用飽和水溶液法制備主體與非瑟酮(客體)的包合物。采用UV、IR等表征,并測定主體與客體的結合穩(wěn)定常數(shù)為KS=2.1308×105。采用DPPH法測定包合物的抗氧化活性,結果表明,包合物對DPPH自由基具有較好的清除能力。