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        中藥蘇木抑制胃癌活性組分鑒定及抑制效果研究

        2022-03-08 09:20:44賀俊飛楊喜花陳麗霞趙莉莉梁永琴張生萬
        山西大學學報(自然科學版) 2022年1期
        關鍵詞:胃癌小鼠劑量

        賀俊飛,楊喜花,,陳麗霞,趙莉莉,梁永琴,張生萬*

        (1.山西大學 生命科學學院,山西 太原 030006;2.山西省腫瘤研究所 實驗動物中心,山西 太原 030013)

        0 引言

        2019年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)表明,中國每年新發(fā)惡性腫瘤人次約380萬,其中男性新發(fā)胃癌約47.8萬,女性約12萬。我國每年胃癌發(fā)病率以及死亡率,約占全世界的1/2,并呈上升趨勢。雖然化療技術有了很大的進步,但耐藥性使得胃癌的預后效果仍然較差[1]。近年來從中藥提取物中尋找新的抗腫瘤成分已成為癌癥治療的另一途徑[2]。

        據(jù)《中國藥典》記載,蘇木味辛性平,歸心肝脾經(jīng),是豆科灌木或小喬木蘇木的心材,中醫(yī)上常用于治療淤痛諸證[3]。最新研究發(fā)現(xiàn),蘇木(及其提取物)還具有降血糖、抗補體、抗炎[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]以及免疫抑制作用等新的藥理活性[8]。已有研究證實蘇木提取物對肝癌細胞株HepG2和Bel?7402的增殖抑制作用呈明顯的劑量依賴性[9];田甜等人研究發(fā)現(xiàn)蘇木及蘇木聯(lián)合化療可以抑制Lewis肺癌的生長,并可以抑制小鼠瘤細胞CD44、血清P?選擇素等黏附因子的表達[10]。趙莉莉研究發(fā)現(xiàn)蘇木提取物(巴西蘇木素含量>50%)能有效抑制荷T24膀胱癌裸鼠移植瘤的生長,延長荷瘤動物生存期,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性[11]。

        目前氟尿嘧啶注射(5?Fu)液為胃癌臨床治療常用化療藥,但其往往會對患者身體造成不同程度的損害,使得大多數(shù)患者不能按期完成化療,從而影響治療效果[12-13]。相比而言,中藥蘇木具有來源廣泛、毒副作用小、價格低和抗腫瘤作用顯著等優(yōu)勢[14-15],但人們關于蘇木發(fā)揮抗癌作用的活性組分及其具體抗癌效果等尚未報道。因此,本研究通過改變提取條件制備10個各組分含量各不相同的樣品,通過考察各組分含量變化與細胞殺傷率的相關性,篩選其抗胃癌活性成分,并探究其對體內(nèi)外腫瘤細胞的抑制作用。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 細胞株與動物

        BGC?823細胞株由山西省腫瘤研究所實驗動物中心提供。

        34只雄性BALB/c?nu裸小鼠,日齡35 d~40 d,體質量16 g~18 g,購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019?0010。動物的飼養(yǎng)及實驗操作均在山西省腫瘤醫(yī)院實驗動物中心進行,實驗動物使用許可證號為:SYXK(晉)2019?0003。實驗期間動物自由飲水、進食。

        1.1.2 試劑

        RPMI?1640培養(yǎng)基,美國 Gibco公司;胎牛血清,美國Gibco公司;胰蛋白酶,Solarbio公司;甲醇:色譜純,TEDIA;噻唑藍(MTT),Solarbio公司;蘇木(中藥飲片),安徽盛海棠中藥飲片有限公司。

        1.1.3 儀器

        Waters 1525高效液相色譜儀(配有2996 PDA檢測器和Empower色譜工作站),美國Wa?ters公司;HR?40 II A2型生物安全柜,青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司;SUNRISE酶標儀,奧地利Tecan公司。

        1.2 方法

        1.2.1 蘇木提取物樣品的制備

        制備1-10號蘇木提取物4號:將蘇木飲片剪至長度約1 cm~2 cm,稱取400 g,以料液比=1∶8加入3 200 mL蒸餾水于室溫下浸泡1 h,加熱電壓為220 V,加熱回流1.5 h(整個過程保持溫度恒定),濾出提取液。按前述方法繼續(xù)加蒸餾水提取4次,將5次提取液合并,充分混勻,減壓濃縮到400 mL,于低溫下(≤4℃)密封、避光保存24 h,過濾得濾液。用濾液2倍量的石油醚∶乙酸乙酯=2∶1混合液對濾液脫脂,同時充分攪拌(300 r/min,30 min),于分液漏斗中靜置45 min后收集水相。使用水相體積2倍量的乙酸乙酯對水相進行萃取除雜2次,充分攪拌,于分液漏斗中靜置45 min后合并有機相,用無水硫酸鈉除去水分,在壓力為0.08 MPa,溫度不高于60℃的條件下旋蒸至無溶劑蒸出時得到蘇木粗提粉[16-17]。取粗提粉加入粗提粉3倍量的蒸餾水溶解,負壓抽濾,濾液處理同上述萃取除雜操作,負壓旋蒸得到蘇木精提粉。在其他條件相同的情況下,通過改變料液比、加熱回流時間、加熱回流次數(shù)、提取溶劑種類及其濃度等條件,制備得到10個蘇木提取物樣品。具體提取條件見表1。

        1.2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定蘇木提取物中各組分含量

        色譜條件:色譜柱:Agela Venusil XBP?C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相A、B分別為甲醇和0.2%的甲酸水溶液;流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL;梯度洗脫程序[18]:0 min~30 min:18%A,等度洗脫,30 min~50 min:18%~50%A,線性變化洗脫,50 min~55 min:50%A,等度洗脫;檢測波長:285 nm。

        1.2.3 蘇木提取物體外對胃癌細胞BGC?823生長的影響

        BGC?823細胞用常規(guī)培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng)[19-21],選取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞(2~3代)用于實驗。以每孔1×104個細胞接種至正常對照組和藥物組各孔,空白對照組不加細胞。細胞培養(yǎng)過夜貼壁后,于超凈工作臺內(nèi)輕輕吸棄培養(yǎng)基,給藥組每組依次加入終濃度為25 μg/mL的10個蘇木提取物樣品溶液,對照組不加藥。加藥24 h或48 h后,將所有孔中的液體吸出,每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL),放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h,輕輕托起培養(yǎng)板,小心除去各孔上清,避光加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL,于酶標儀中振蕩10 min,使結晶充分溶解,在570 nm處測定各孔OD值。計算細胞生長抑制率。計算公式:

        選擇對細胞抑制作用最強即抗癌活性成分含量最高的蘇木提取物作為后續(xù)實驗的樣品,將其分別配制成終濃度為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的藥物,干預胃癌細胞24 h,檢測其對胃癌細胞增殖的抑制情況(MTT法),并計算其對胃癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。IC50的計算公式為:

        其中,Xm為lg最大劑量;I為lg(最大劑量/相鄰劑量);P為陽性反應率之和;Pm為最大陽性反應率;Pn為最小陽性反應率。

        以上述蘇木提取物對胃癌細胞的IC50為實驗濃度,配制其濃度并分別干預細胞3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,每個時間段干預結束后,通過細胞增殖情況(MTT法)的變化評價該濃度的蘇木提取物在不同作用時間下對胃癌細胞的抑制效果。

        1.2.4 蘇木提取物對荷BGC?823胃癌裸鼠瘤體生長的抑制作用

        選取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞(2~3代),經(jīng)消化稀釋后接種至裸鼠右腋皮下(1.2×107個/mL,0.1 mL),建模成功(接種部位出現(xiàn)長徑約5 mm~7 mm的皮下結節(jié))后進行后續(xù)實驗[22-23]。

        將建模成功、精神狀態(tài)良好的30只裸小鼠隨機分為模型組、陽性對照組(5?氟尿嘧啶注射液,125 mg/kg)、蘇木提取物高、中、低劑量組(400、300、200 mg/kg)5組,每組6只動物。各組裸鼠均為瘤周皮下注射給藥,其中蘇木提取物組共給藥8次(1次/2 d),模型組同時給予生理鹽水(0.05 mL/10 g);陽性藥因其毒副作用大故每周給藥1次,連續(xù)給兩周,每次操作完成后均正常喂養(yǎng)。自接種日起,每天早晚各觀察動物的精神、飲食、活動及大小便等一般情況1次;每隔1 d對裸鼠移植瘤瘤體長、短徑(a、b)測量并詳細記錄1次,同時計算瘤體體積(TV)。計算公式:

        實驗結束后,取各實驗組小鼠腫瘤組織(稱重后快速于固定液中固定),計算腫瘤抑制率。計算公式:

        1.3 統(tǒng)計分析

        統(tǒng)計分析軟件采用SPSS22.0,實驗結果以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較時若方差齊時用LSD檢驗,若方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗。非正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗。

        2 結果

        2.1 蘇木提取物中抗胃癌有效成分篩選結果

        蘇木提取樣典型的液相色譜圖如圖1所示。將10個樣品中均含有、且含量較高的7個組分進行相對含量分析,其結果見表2。

        圖1 蘇木提取樣典型的液相色譜圖Fig.1 A typical liquid chromatogram of a sample extract from Sappan L.

        表2 液相色譜測定各樣品中主要組分相對含量結果Table 2 Results of relative content of main components in each sample determined by HPLC

        由圖2可見,提取樣品中各種組分含量的變化與其對細胞殺傷率呈正相關者為保留時間14 min的組分(r=0.948,P<0.01)。該組分與圖3巴西蘇木素標準對照品出峰時間一致,可確定為巴西蘇木素。

        圖2 蘇木提取物各組分含量變化與細胞抑制率的相關圖Fig.2 Correlation graph between the contents of each component and the cell inhibition rate of the extract from Sappan L.

        圖3 巴西蘇木素對照品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of the Brazilin reference

        2.2 蘇木提取物體外對胃癌細胞BGC?823生長的影響

        10份蘇木提取物樣品中巴西蘇木素含量最高達55.74%,實驗以該提取樣品為研究對象(以下統(tǒng)稱為蘇木提取物)。由表3可見,各藥物組細胞的生長均受到不同程度的抑制,且隨著藥物濃度的增加,細胞抑制率逐漸增加。當蘇木提取物濃度為 12.5、25、50、100 μg/mL 時,細胞生長受到明顯抑制(P<0.05),經(jīng)計算得該提取物對胃癌細胞BGC?823的IC50為15 μg/mL。由圖4可見,當蘇木提取物對胃癌細胞的作用時間逐漸延長時,與正常對照組比較,細胞抑制率顯著升高(P<0.05)。

        圖4 15 μg/mL的蘇木提取物在不同作用時間下對細胞增殖的影響Fig.4 Effects of 15 μg/mL extracts from Sappan L.with different action time on cell proliferation

        表3 蘇木提取物不同作用濃度對細胞增殖的影響Table 3 Effects of extracts from Sappan L.of different con?centrations on cell proliferation

        2.3 蘇木提取物對荷BGC?823胃癌裸鼠皮下移植瘤體積和抑瘤率的影響

        隨著觀察時間的延長,與空白對照組、陽性對照組和蘇木提取物組小鼠相比,模型組小鼠活動逐漸減少,精神逐漸變差,飲水飲食逐漸減少;與蘇木提取物組相比,陽性對照組小鼠飲水飲食減少,體重明顯減輕,且身體呈弓背狀,實驗結束時有1只小鼠死亡。由表4可見,與模型組小鼠相比,蘇木提取物組移植瘤生長速度均較慢,從小鼠接種后的第20天開始,高劑量組小鼠腫瘤平均體積顯著減?。≒<0.05),且兩個組小鼠在實驗末時的腫瘤抑制率分別為48.05%和63.92%。由表5可見,在實驗末時,蘇木提取物中、高劑量組小鼠瘤體平均重量顯著低于模型組小鼠(P<0.05),且兩個組小鼠抑瘤率分別為48.55%和60.86%。由此可知,蘇木提取物可顯著減小荷瘤小鼠移植瘤的體積和重量,并具有劑量依賴性,其中以大劑量效果最好。

        表4 蘇木提取物對裸鼠皮下移植瘤體積的影響(V/mm3,±s)Table 4 Effects of extract from Sappan L.on tumor volume of subcutaneous transplantation in nude mice(V/mm3,±s)

        表4 蘇木提取物對裸鼠皮下移植瘤體積的影響(V/mm3,±s)Table 4 Effects of extract from Sappan L.on tumor volume of subcutaneous transplantation in nude mice(V/mm3,±s)

        注:*表示與模型組比較P<0.05。Note:*represents comparison with model group(P<0.05).

        第30 d 1 429±82 1 023±267*1 222±202 738±139*518±111*模型組陽性對照組蘇木提取物低劑量組蘇木提取物中劑量組蘇木提取物高劑量組第10 d 102±8 93±17 98±29 83±24 61±17第15 d 345±104 204±14 236±41 222±10 81±12第20 d 774±143 393±61*712±16 387±60*111±57*第25 d 1 243±207 604±165*951±87 401±72*223±23*

        表5 蘇木提取物對裸鼠皮下移植瘤重量及腫瘤抑制率的影響(±s)Table 5 Effects of extract from Sappan L.on tumor weight and tumor inhibition rate of subcutaneous transplantation in nude mice(±s)

        表5 蘇木提取物對裸鼠皮下移植瘤重量及腫瘤抑制率的影響(±s)Table 5 Effects of extract from Sappan L.on tumor weight and tumor inhibition rate of subcutaneous transplantation in nude mice(±s)

        注:*表示與模型組比較P<0.05。Note:Note :*represents comparison with model group(P<0.05).

        動物數(shù)開始 結束組別模型組陽性對照組蘇木提取物低劑量組蘇木提取物中劑量組蘇木提取物高劑量組66666 65666平均瘤重/g 1.235±0.352 0.904±0.423 1.131±0.361 0.636±0.173*0.483±0.077*腫瘤抑制率/%—26.77 8.40 48.55 60.86

        3 討論

        惡性腫瘤在尋求高效治療方法時,應盡可能規(guī)避各種致病因素(環(huán)境因素和遺傳因素)。研究發(fā)現(xiàn),高劑量、更長持續(xù)時間的吸煙會使胃癌的患病風險增加更為明顯[24-25],長期不良的飲食、作息習慣和過度飲酒也會使胃癌的患病風險增加?;谀壳暗尼t(yī)療手段,胃癌治療仍以手術切除治療為主,化學治療為輔,但該治療方法存在著一定的弊端,如化療藥物對癌細胞殺傷缺乏靶向性,治療后患者復發(fā)率高,以及毒副作用大。中藥(含有抗癌活性物質)由于具有藥性溫和、毒副作用小、能增強機體免疫力、降低化療副作用、減少復發(fā)及提高生存率的特點而備受關注[26]。中藥蘇木對體外腫瘤細胞的研究最早始于20世紀70年代的日本學者,隨后國內(nèi)也有其相關抑癌方面的報道。已有研究證實蘇木醇提物對人肺癌A549細胞有明顯的抑制作用,并呈濃度依賴性[16];蘇木水提取物對人卵巢癌SKOV3細胞株和荷SKOV3卵巢癌裸鼠有明顯的生長抑制作用,且隨藥物作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性[17];蘇木提取液對人胃癌細胞株SGC?7901有明顯的生長抑制及誘導凋亡的作用[27],但關于蘇木提取物中具體的抗胃癌活性成分及其體內(nèi)抗胃癌效果的研究未見報道。鑒于山西省腫瘤研究所實驗動物中心以蘇木為主要原料研制的“蘇復寧洗液”已成功用于膀胱癌的術后治療,且臨床效果良好。因此,開展中藥蘇木的抗胃癌作用研究,并將其開發(fā)為抗胃癌的臨床用藥具有重要的意義。

        本實驗研究表明,一定劑量的蘇木提取物對體內(nèi)外胃癌細胞均具有顯著的抑制作用,其中起抑制作用的有效成分為巴西蘇木素,為蘇木提取物在臨床胃癌化療中的合理應用提供了實驗理論基礎。

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