隆采丹 唐麗珠 徐媛媛 周安邦 黃光京 陳思蓉 吳標(biāo)良

【摘要】 目的 觀察皮膚再生醫(yī)療技術(shù)[濕潤暴露療法（moist exposed burn therapy，MEBT）/濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）]對糖尿病大鼠創(chuàng)面骨形成蛋白（BMP）/Smad信號通路中Smad1表達(dá)的影響，探討MEBT/MEBO促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

方法 將90只Wistar大鼠隨機(jī)分成對照組、模型組和MEBO組三個組，每組30只，對照組建立普通創(chuàng)面模型，模型組和MEBO組建立糖尿病創(chuàng)面模型，模型組和對照組采用生理鹽水紗布濕敷換藥，MEBO組采用MEBO干預(yù)創(chuàng)面，分別于治療第1天、第5天、第11天，對比創(chuàng)面的愈合情況，取創(chuàng)面組織采用qRT-PCR技術(shù)檢測Smad1的表達(dá)水平，免疫組化法檢測大鼠創(chuàng)面中Smad1蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果 （1）治療第5天、第11天，三組大鼠創(chuàng)面愈合率對比，MEBO組>對照組>模型組（P<0.05）;（2）治療第1天、第5天、第11天，模型組Smad1 mRNA表達(dá)均低于對照組，MEBO組Smad1 mRNA表達(dá)高于對照組（P<0.05），三組的Smad1 mRNA表達(dá)在治療第5天降低，治療第11天達(dá)到高峰;（3）免疫組化顯示Smad1蛋白表達(dá)在第5天達(dá)到高峰。

結(jié)論 MEBT/MEBO可促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能是通過調(diào)控Smad1表達(dá)和BMP/Smad信號通路。

【關(guān)鍵詞】 皮膚再生醫(yī)療技術(shù);糖尿病創(chuàng)面;BMP/Smad信號通路;Smad1

中圖分類號：R587.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.01.001

Experimental study on the effect of MEBT/MEBO on wound healing and expression of Smad1 in diabetic wound

LONG Caidan1，2， TANG Lizhu1，2， XU Yuanyuan1，2， ZHOU Anbang1，2， HUANG Guangjing1，2， CHEN Sirong1，2， WU Biaoliang1

（1. Department of Endocrinology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To observe the skin regeneration medical technique （moist exposed burn therapy[MEBT]/moist exposed burn ointment[MEBO]） on the expression of Smad1 in wound bone morphogenetic protein （BMP）/Smad signaling pathway in diabetic rats， so as to explore the mechanism of MEBT/MEBO in promoting diabetic wound healing.

Methods 90 Wistar rats were randomly divided into 3 groups： control group， model group and MEBO group， with 30 rats in each group. Normal wound model was established in the control group， and diabetic wound models were established in the model group and the MEBO group.The model group and the control group were treated with wet dressing with saline gauze， while the MEBO group were treated with MEBO to intervene the wound. And then， the wound healing was compared on the 1st， 5th and 11th day of treatment， respectively. Wound tissues were taken， and the expression level of Smad1 was detected by qRT-PCR， and Smad1 protein expression level was detected by immunohistochemistry.

Results （1） On the 5th and 11th day of treatment，the wound healing rates of the 3 groups were compared， which showed that MEBO group>control group>model group （P<0.05）; （2） On the 1st， 5th and 11th day of treatment， the expression levels of Smad1 and mRNA in the model group were lower than those in the control group， and the expression levels of Smad1 and mRNA in the MEBO group were higher than those in the control group （P<0.05）. The expression levels of Smad1 and mRNA in the three groups decreased on the 5th day of treatment and reached the peak on the 11th day of treatment; （3）Immunohistochemistry showed that the protein expression levels of Smad1 reached the peak on the 5th day of treatment.

Conclusion MEBT/MEBO can promote the healing of chronic wound in diabetes mellitus， and the mechanism may be through regulating Smad1 expression and BMP/Smad signaling pathway.

【Key words】 skin regeneration medical technique; diabetic wound; BMP/Smad signaling pathway; Smad1

糖尿病為常見病、多發(fā)病，截至2019年，全球共有4.63億人罹患糖尿病，并且這個數(shù)值預(yù)計至2030年將增長至5.79億[1]。糖尿病及其并發(fā)癥對人類的健康產(chǎn)生了巨大的影響，其中糖尿病慢性創(chuàng)面是最嚴(yán)重及治療費用最高的并發(fā)癥之一，近年來許多學(xué)者對糖尿病慢性創(chuàng)面的治療進(jìn)行了許多研究。在關(guān)于皮膚再生醫(yī)療技術(shù)[濕潤暴露療法（moist exposed burn therapy，MEBT）/濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）]治療糖尿病慢性創(chuàng)面的研究過程中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MEBT/MEBO扮演著很重要的角色，它可促進(jìn)慢性創(chuàng)面的修復(fù)和再生[2]，但其具體機(jī)制尚未明了。同時有研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號通路在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中舉足輕重[3]。本研究旨在通過觀察MEBT/MEBO在治療糖尿病慢性創(chuàng)面中與骨形成蛋白（BMP）/Smad信號通路中Smad1表達(dá)的影響，進(jìn)而探究其與糖尿病慢性創(chuàng)面愈合修復(fù)的可能機(jī)理。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

選擇體重200～250 g范圍內(nèi)的健康雄性Wistar大鼠90只，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供。動物飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，設(shè)定溫度在20℃～26℃范圍，環(huán)境清潔，自由進(jìn)食飲水。大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)7天方能進(jìn)行正式實驗。本實驗符合動物實驗的倫理學(xué)要求，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2018112001）。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自北京華越洋生物科技有限公司，濕潤燒傷膏購自汕頭市美寶制藥有限公司，水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠，Smad1、β-actin引物購自武漢金開端生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及模型的建立

大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組30只、對照組30只、MEBO組30只，模型組及MEBO組大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)1個月，造模前禁食不禁水16 h，一次性將45 mg/kg的STZ（以0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制）腹腔內(nèi)注射，7日后大鼠出現(xiàn)三多一少癥狀，此時于尾尖靜脈處采血，測量實驗大鼠的空腹血糖，如空腹血糖≥16.7 mmol/L，則代表糖尿病模型建立成功，需隔日復(fù)測1次，2次以上達(dá)標(biāo)則為造模成功，如血糖不達(dá)標(biāo)可再次注射STZ;對照組大鼠喂食普通飼料，1個月后取0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，進(jìn)行腹腔內(nèi)注射作為對照。造模成功后第7天，7%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，于大鼠足背部造模區(qū)域切除約2 cm×2 cm深至筋膜層的全層皮膚[4]。

1.3.2 創(chuàng)面及血糖管理

各組模型建立成功后每日換藥2次，首先清潔創(chuàng)面，模型組及對照組使用1/5000呋喃西林液清潔，后于傷口處使用生理鹽水紗布及消毒干紗布各2層包扎固定，MEBO組使用MEBO藥紗及消毒干紗布2層覆蓋包扎于創(chuàng)面處，模型組及MEBO組需使用長效胰島素控制血糖值于16.0 mmol/L左右[5]。

1.3.3 標(biāo)本采集與處理

三組均于創(chuàng)面建立成功后的第1天、第5天、第11天，每個時點各組隨機(jī)選取10只大鼠，腹腔注射水合氯醛（濃度同造模時）麻醉，剪取創(chuàng)面組織，置于去核糖核酸酶的凍存管中，于-80℃冰箱中保存，取標(biāo)本后處死動物。

1.3.4 記錄創(chuàng)面面積、計算愈合率

創(chuàng)面建立成功后的第1天、第5天、第11天，每個時點各組隨機(jī)選取10只大鼠，將刻度尺兩邊放在大鼠的創(chuàng)緣，尺子90°垂直，用數(shù)碼相機(jī)拍攝尺子及創(chuàng)面，將圖片保存，使用Image J軟件對實驗大鼠未愈合的創(chuàng)面面積進(jìn)行測量，并計算愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.5 qRT-PCR技術(shù)檢測Smad1 mRNA表達(dá)水平

將低溫冰箱中的標(biāo)本取出，使用高壓滅菌過的研缽，將標(biāo)本連同液氮一起充分研磨，直至研磨成粉末狀，此時加入組織裂解液，按TAKARA試劑盒說明書提供的實驗步驟進(jìn)行總RNA的提取，實驗需要的反轉(zhuǎn)錄模板選擇A260/280比值范圍在1.8～2.1的總RNA，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的實驗方法合成cDNA，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測。實驗用的引物序列如下，Smad1-F：TATGCGGAGTGCCTCAGTGA，Smda1-R：AGACCGTGGTGGGATGAAAG，β-actin：TGTCACCAACTGGGACGATA，β-actin-R：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗首先對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩個樣本間的比較如均符合正態(tài)分布，選擇配對樣本t檢驗，如均不符合正態(tài)分布或其中一組樣本不符合正態(tài)分布，則選擇配對樣本的秩和檢驗，采用單因素方差分析比較多個樣本。最終數(shù)據(jù)采用實驗軟件SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

3.1 三組大鼠創(chuàng)面愈合情況和愈合率的對比

造模成功后，在飲食、睡眠、活動方面，各組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯差異，治療第1天，三組大鼠的創(chuàng)面外觀均晦暗，表面濕潤，有少許出血、滲液及周圍組織水腫。治療第5天，模型組的創(chuàng)面組織水腫仍明顯，有較多滲血、滲液，無明顯肉芽組織形成;對照組創(chuàng)面稍濕潤，有少許出血、滲液，表面可見片狀新生肉芽組織形成;MEBO組的創(chuàng)面較干燥，面積較前縮小，創(chuàng)面被許多新生肉芽組織填充。治療第11天，模型組大鼠的創(chuàng)面較前明顯縮小，表面稍濕潤，可見肉芽組織生成;對照組創(chuàng)面較前縮小，創(chuàng)面被大片肉芽組織覆蓋;MEBO組創(chuàng)面干燥，多數(shù)結(jié)痂，面積明顯縮?。▓D1）。治療第5天、第11天，三組大鼠創(chuàng)面愈合率對比，MEBO組>對照組>模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.2 三組大鼠創(chuàng)面組織中Smad1? mRNA表達(dá)水平對比

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，治療第1天，與對照組對比，MEBO組和模型組的Smad1 mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)意義，MEBO組的Smad1 mRNA表達(dá)量較模型組的高（P<0.05）;治療第5天，與對照組對比，模型組的Smad1 mRNA表達(dá)量較低（P<0.05），MEBO組的Smad1 mRNA表達(dá)量較高（P<0.05），MEBO組的Smad1 mRNA表達(dá)量較模型組的高（P<0.05）;治療第11天，與對照組對比，模型組的Smad1 mRNA表達(dá)量較低（P<0.05），MEBO組的Smad1 mRNA表達(dá)量較高（P<0.05），MEBO組的Smad1 mRNA表達(dá)量較模型組的高（P<0.05）。與治療第1天對比，對照組和模型組治療第5天的Smad1 mRNA表達(dá)量較低（P<0.05），治療第11天與第1天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），治療第5天Smad1 mRNA表達(dá)量低于第11天（P<0.05）;而與治療第1天對比，MEBO組治療第5天的Smad1 mRNA表達(dá)量較低（P<0.05），治療第11天表達(dá)量較高（P<0.05），治療第5天的Smad1 mRNA表達(dá)量較第11天表達(dá)量低（P<0.05）。見表2。

3.3 免疫組化觀察三組大鼠3個時間段Smad1蛋白表達(dá)水平

棕黃色染色代表陽性染色，藍(lán)色染色代表細(xì)胞核。治療第1天，模型組發(fā)現(xiàn)極少量棕黃染色，對照組及MEBO組可見散在棕黃染色，其中，對照組陽性染色大多位于細(xì)胞間質(zhì)，MEBO組陽性染色基本位于細(xì)胞核附近;治療第5天，模型組中可見少量棕黃色，部分位于細(xì)胞間質(zhì)，部分位于細(xì)胞核附近，對照組可見散在棕黃染色較第1天增多，大多數(shù)蛋白在細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)，MEBO組可見散在棕黃染色較第1天增多，大多位于細(xì)胞核附近;治療第11天，模型組僅有少量棕黃染色，大部分位于細(xì)胞間質(zhì)，對照組細(xì)胞較第5天有較多棕黃染色，大部分位于細(xì)胞間質(zhì)，MEBO組僅有少量棕黃染色，明顯少于第5天。見圖2。

3 討? 論

創(chuàng)面愈合主要包括炎癥期、增生期及重塑期，是一個復(fù)雜的過程[6]。既往許多研究發(fā)現(xiàn)，MEBT/MEBO在糖尿病慢性創(chuàng)面的治療上有顯著的效果[7～8]，但其促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制尚未明確。TGF-β在胚胎發(fā)育和成年組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生存、干細(xì)胞自我更新和分化中扮演著重要的角色，TGF-β超家族包括：BMP、生長分化因子（GDF）、抗繆勒式管激素（AMH）、激活素（Activin）、Nodal及TGF-β[9]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，所有家族成員的典型TGF-β信號通路似乎只激活了兩個不同的信號通路，即Smad2/3或Smad1/5/8信號通路[10]，其中，TGF-β受體、激活素和肌生成抑制素（家族的TGF-b分支）通過Smad2和Smad3發(fā)出信號，而BMP通過Smads1/5/8發(fā)出信號[11]。Smad1/5/8的活化可上調(diào)BMP并抑制TGF-β1介導(dǎo)的纖維化基因的表達(dá)[12]。糖原合成酶激酶3β （glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是PI3K/AKT信號通路的下游基因，是一種在進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)控糖原合成酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等[13]，GSK-3β可介導(dǎo)Smad1磷酸化，在爪蟾胚胎中進(jìn)行的體內(nèi)上位性實驗表明，GSK-3β介導(dǎo)的Smad1磷酸化在Wnt信號對原腸期和外胚層細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育的影響中起著關(guān)鍵作用，此實驗還發(fā)現(xiàn)Smad1與造血基因附近的主調(diào)控因子共同占據(jù)位點，以調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的命運[14]。通過PI3K-Akt信號增強(qiáng)Smad1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活可用于BMP誘導(dǎo)的集落刺激因子1 （CSF-1）的表達(dá)[15]。以上的研究顯示，Smad1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、凋亡，促進(jìn)細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育等過程中扮演著重要的作用，其調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞及激活CSF-1的表達(dá)提示其對造血功能的恢復(fù)也有一定的作用。

本研究結(jié)果顯示，采用MEBO/MEBT干預(yù)的MEBO組創(chuàng)面愈合率高于模型組，表明了MEBO/MEBT對糖尿病慢性創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用;RT-PCR顯示MEBO組及對照組的Smad1 mRNA的表達(dá)高于模型組，免疫熒光結(jié)果提示創(chuàng)面中有Smad1蛋白的表達(dá)，在治療的第5天及第11天的表達(dá)較第1天高，表明了MEBO/MEBT對Smad1的調(diào)控作用，而上述既往研究表明Smad1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化方面具有重要作用，因此，MEBO/MEBT對Smad1的調(diào)控可能是MEBO/MEBT促糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一。

綜上所述，MEBT/MEBO可顯著提高糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合率，其機(jī)制可能是調(diào)控Smad1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了BMP/Smad信號通路變化。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] ?SAEEDI P，PETERSOHN I，SALPEA P，et al.Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045：results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas，9th edition[J].Diabetes Res Clin Pract，2019，157：107843.

[2] ?HUANG C，SHEN S，MA Q，et al.Blockade of KCa3.1 ameliorates renal fibrosis through the TGF-β1/Smad pathway in diabetic mice[J].Diabetes，2013，62（8）：2923-2934.

[3] ?唐強(qiáng)，黃志群，陸鋼，等.再生醫(yī)療技術(shù)對深Ⅱ度燒傷患者的炎癥因子水平及創(chuàng)面愈合的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（4）：94-97.

[4] ?董方，蔡黔，劉毅.糖尿病足潰瘍大鼠模型的建立[J].山東醫(yī)藥，2010，50（14）：34-35.

[5] ?宋紫輝，張慧霞，項宗尚，等.甘精胰島素注射液對1型糖尿病模型大鼠的降血糖作用[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，37（5）：646-650.

[6] LOU Z，ZHANG C，GONG T，et al.Wound-healing effects of 635-nm low-level laser therapy on primary human vocal fold epithelial cells：an in vitro study[J].Lasers Med Sci，2019，34（3）：547-554.

[7] ?李杰輝，唐乾利.MEBT/MEBO在慢性難愈合創(chuàng)面治療中的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展[J].中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2021，33（2）：77-81.

[8] ?ZHENG A，MA H，LIU X，et al.Effects of moist exposed burn therapy and ointment （MEBT/MEBO） on the autophagy mTOR signalling pathway in diabetic ulcer wounds[J].Pharm Biol，2020，58（1）：124-130.

[9] ?BORENA B M，MARTENS A，BROECKX S Y，et al.Regenerative skin wound healing in mammals：state-of-the-art on growth factor and stem cell based treatments[J].Cell Physiol Biochem，2015，36（1）：1-23.

[10] ?NICKEL J，MUELLER T D.Specification of BMP signaling[J].Cells，2019，8（12）：1579.

[11] ?MACIAS M J，MARTIN-MALPARTIDA P，MASSAGU J.Structural determinants of Smad function in TGF-β signaling[J].Trends Biochem Sci，2015，40（6）：296-308.

[12] ?LECHLEIDER R J，RYAN J L，GARRETT L，et al.Targeted mutagenesis of Smad1 reveals an essential role in chorioallantoic fusion[J].Dev Biol，2001，240（1）：157-167.

[13] ?劉謙，唐圓圓，張國海，等.糖原合成激酶-3β及其天然藥物抑制劑研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：223-229.

[14] ?TROMPOUKI E， BOWMAN T V， LAWTON L N， et al.Lineage regulators direct BMP and Wnt pathways to cell-specific programs during differentiation and regeneration[J].Cell，2011， 147（3）： 577-589.

[15] ?MANDAL C C， GHOSH CHOUDHURY G， GHOSH-CHOUDHURY N.Phosphatidylinositol 3 Kinase/Akt signal relay cooperates with Smad in bone morphogenetic protein-2-induced colony stimulating factor-1 （CSF-1） expression and osteoclast differentiation[J].Endocrinology，2009，150（11）：4989-4998.

（收稿日期：2021-07-05 修回日期：2021-11-13）

（編輯：潘明志）