李舒文 李殷睿智 董笛 王夢迪 晁躍輝 韓烈保

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083）

MtSAG113基因是在蒺藜苜蓿中被發(fā)現(xiàn)的，該基因?qū)儆赑P2Cc超家族，為葉片發(fā)育和衰老時選擇性啟動基因［7］。在調(diào)控植物葉片衰老方面具有一定的作用［8］。MtSAG113基因在植物抗衰老過程中具有高度的特異表達特性，在植物衰老葉片中可驅(qū)動IPT（isopentenyl transferase）基因的表達，對內(nèi)源分裂素含量進行有效調(diào)控，在不影響植株正常發(fā)育的前提下，達到延緩葉片衰老的目的［9］。實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）具有重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確和反應(yīng)迅速等優(yōu)點，已成為確定基因表達水平的最常用方法［10-11］。

本試驗以煙草和蒺藜苜蓿R108葉片為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法［12］轉(zhuǎn)化煙草，獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株以及檢測蒺藜苜蓿MtSAG113基因在逆境條件和激素誘導(dǎo)下的表達情況，研究MtSAG113基因的特異性表達，并通過亞細胞定位確定該基因位于細胞核內(nèi)，旨為進一步探究MtSAG113基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的煙草和蒺藜苜蓿為實驗室種植，將煙草種植于組培瓶中，于無菌環(huán)境下培養(yǎng)20 d左右，進行MtSAG113基因的轉(zhuǎn)化及亞細胞定位實驗；蒺藜苜蓿R108種植在12 cm的花盆里，放置于人工培養(yǎng)箱中，植株大約培養(yǎng)20 d，然后對蒺藜苜蓿R108葉片進行處理。剩下的植株繼續(xù)培養(yǎng)至葉片發(fā)黃。反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptRTReagent Kit、DNA提取試劑盒（Plant DNA Kit）、RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）購自O(shè)MEGA公司。瓊脂、NaCl、6-BA、IAA、ABA購買于Sigma公司，MtSAG113基因為實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 MtSAG113 基因轉(zhuǎn)化及處理 取長勢健康的煙草葉片，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進行浸染轉(zhuǎn)化。將含有MtSAG113質(zhì)粒的農(nóng)桿菌震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8時低速離心收集沉淀，然后使用MS溶液進行重懸，即可得到侵染液。將煙草葉片剪碎，于侵染液中浸泡10 min，于接種培養(yǎng)基上27℃暗培養(yǎng)3 d，然后將其轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，待系帶培養(yǎng)3次后進行誘芽和誘根培養(yǎng)，期間用草銨膦對轉(zhuǎn)化的葉片進行篩選。取生長至60 d左右的成熟蒺藜苜蓿和葉片變黃的衰老蒺藜苜蓿葉片進行熒光定量，檢測MtSAG113基因在成熟和衰老葉片的表達量。選取生長狀況良好且一致的蒺藜苜蓿R108葉片，分別浸泡于清水、含有15%的聚乙二醇（PEG）溶液、150 mmol/L NaCl營養(yǎng)液、1 μmol/L 6-BA溶液、1 μmol/L IAA溶液、1 μmol/L ABA溶液中，處理時間為 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h。按照DNA和RNA提取試劑盒的方法對所處理的葉片進行DNA和RNA的提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄，最后進行熒光定量PCR檢測。選取長勢良好的煙草，并將攜帶35S-MtSAG113-YFP質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌注射于該煙草中，黑暗培養(yǎng)48 h，在聚焦顯微鏡下觀察YFP信號在細胞中的位置。

對于本論文的探討方案和方法已經(jīng)到此為止了，個人認為最后的結(jié)果還是有些差強人意，畢竟處理設(shè)計與人們的微妙關(guān)系不是那么容易做到的，對于不同的客戶，設(shè)計也有著不同的定向趨勢。相信設(shè)計在滿足其客戶的需求同時，滿足了好設(shè)計的基本概念，就可以在更大程度上滿足更多人的需求。

1.2.2 MtSAG113基因在激素誘導(dǎo)后的表達分析 植物外源激素已被研究證實可以參與植物非生物調(diào)節(jié)，在植物抗逆方面也有良好的調(diào)控作用［13-14］。外源植物激素對植物器官生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收、光合作用以及抗性生理都有一定的影響。同時外源激素對轉(zhuǎn)基因植物的表達量也會產(chǎn)生一定的影響。對蒺藜苜蓿R108葉片進行激素誘導(dǎo)處理，通過熒光定量PCR檢測分析表達量。進一步研究激素誘導(dǎo)對蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達量的影響。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將MtSAG113基因用NCBI網(wǎng)站進行同源蛋白的查找及蛋白結(jié)構(gòu)域的分析。對亞細胞定位預(yù)測通過Cell-PLoc package（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）網(wǎng)站完成。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因植株及鑒定

經(jīng)葉盤法對煙草進行轉(zhuǎn)化，提取再生煙草植株的DNA進行PCR檢測。以再生植株的DNA為模板進行PCR擴增，取PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）表明，檢測的7株再生煙草植株中，有5株的DNA片段符合預(yù)期大小，未轉(zhuǎn)化成功的和野生型的煙草條帶大小則小于預(yù)期條帶。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測Fig.1 PCR detection of transgenic plants

提取再生植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以再生植株的cDNA為模板進行RT-PCR檢測，取RTPCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果（圖2）顯示，所獲得的目的片段符合預(yù)期大小，表明MtSAG113基因在煙草中成功表達。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR detection of transgenic tobacco

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草表型

將轉(zhuǎn)基因煙草苗與野生型煙草苗同時放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約1個月，觀察其表型。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比植株明顯矮小且葉片出現(xiàn)早衰現(xiàn)象（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草表型Fig.3 Phenotype of transgenic tobacco

2.3 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿葉片中的表達分析

對蒺藜苜蓿成熟葉片和衰老葉片進行熒光定量分析，檢測MtSAG113基因在調(diào)控葉片衰老進程的作用。結(jié)果（圖4，圖5）表明，MtSAG113基因在衰老葉片中表達水平遠遠高于未衰老葉片中的表達水平；衰老葉片的基因表達量是未衰老葉片的4.94倍。

圖4 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿葉片中的表達分析Fig.4 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula leaves

圖5 蒺藜苜蓿成熟衰老葉片對比Fig.5 Comparison of mature and senescent leaves of Medicago truncatula

2.4 MtSAG113基因未處理條件下的表達分析

清水處理0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、48 h后，熒光定量PCR檢測分析結(jié)果（圖6）顯示，0 h的MtSAG113基因表達量最高，處理4 h時達到最低，是0 h樣品的13倍，隨著清水處理的時間延長，MtSAG113基因表達量有逐漸增加的趨勢，但仍然低于0 h。

圖6 蒺藜苜蓿MtSAG113基因未處理條件下的表達分析Fig.6 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under untreated conditions

2.5 MtSAG113基因干旱脅迫表達分析

通過PEG模擬干旱脅迫環(huán)境，在脅迫處理的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進行熒光定量分析，檢測MtSAG113基因在模擬干旱脅迫的表達情況。結(jié)果（圖7）顯示，脅迫2 h蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達水平有所提高，為未處理的3.18倍；脅迫處理4 h后，MtSAG113基因的表達量大大提高，為對照樣品的95.96倍；在脅迫8 h時略有下降，但仍為對照樣品的62.41倍；隨著時間的延長表達量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，并在24 h達到最大值，與對照處理相比增加了276.48倍。

圖7 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的干旱脅迫表達Fig.7 Drought-stress expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula

2.6 MtSAG113基因鹽脅迫表達分析

作為一種重要的脅迫條件，高鹽對于很多基因的表達具有調(diào)節(jié)作用。通過熒光定量分析MtSAG113基因在鹽脅迫處理表達情況，結(jié)果（圖8）顯示經(jīng)NaCl處理后，MtSAG113基因的表達量與對照相比整體呈現(xiàn)增加的趨勢。在2 h后表達量逐漸增加，并在12 h達到高峰，是對照處理的49.96倍。隨著時間的延長，表達水平逐漸降低，48 h表達水平有所回落，但與對照相比仍增加了54.4%。

圖8 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的鹽脅迫表達Fig.8 Expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under salt stress

2.7 細胞分裂素對MtSAG113影響

經(jīng)6-BA處理后，MtSAG113表達量呈現(xiàn)不同程度的增加，在誘導(dǎo)2 h時，出現(xiàn)緩慢的提高，與未處理樣品相比，增加了50.44%；在4 h時表達量達到峰值，是對照樣品的917.46倍；在8 h時，略有下降，但與對照相比增加了5.72倍；48 h時表達量為對照的6.47倍（圖9）。

圖9 6-BA誘導(dǎo)對蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達影響Fig.9 Effects of 6-BA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.8 生長素對MtSAG113影響

IAA處理后，MtSAG113基因的表達量與對照相比呈增加的趨勢，但增加量的趨勢呈現(xiàn)出先升高后降低。如圖4所示，2 h后，MtSAG113基因的表達增加量逐漸升高，并在12 h達到高峰，與對照相比增加了15.52倍；24 h后增加量出現(xiàn)了迅速的下降，隨著時間的延長，表達水平回落至對照組水平（圖 10）。

圖10 IAA誘導(dǎo)對蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達影響Fig.10 Effects of IAA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.9 ABA對MtSAG113影響

外源施加ABA對植物葉片衰老有促進作用，MtSAG113基因在ABA處理2 h時表達水平稍稍降低，但與對照組相比并不顯著；隨著誘導(dǎo)時間的推移，表達量逐漸增加，并在8 h達到最大值，是對照組的13.02倍；24和48 h雖然表達量出現(xiàn)下降，但與對照相比，表達量仍分別提高了41.84%和116.41%（圖 11）。

圖11 ABA誘導(dǎo)對蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達影響Fig.11 Effects of ABA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.10 生物信息學(xué)分析 MtSAG113基因共852個堿基，編碼 284個氨基酸。對MtSAG113保守結(jié)構(gòu)域進行分析可知該基因?qū)儆赑P2Cc超家族。該超家族的磷酸酶的蛋白結(jié)構(gòu)和推導(dǎo)的催化機理與Ser/Thr磷酸酶的PP1、PP2A、PP2B家族相似，與PP2C沒有序列相似性。

2.11 亞細胞定位分析 將含有35S-MtSAG113-YFP質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌注射于煙草中，黑暗培養(yǎng)48 h，在聚焦顯微鏡下觀察YFP信號在細胞中的位置（圖12）。圖中紅色熒光為細胞核自發(fā)熒光，黃色熒光為YFP蛋白所發(fā)熒光，亞細胞定位結(jié)果表明MtSAG113基因定位于細胞核內(nèi)，與前期預(yù)測結(jié)果相同。

圖12 亞細胞定位結(jié)果Fig.12 Results of subcellular localization

3 討論

衰老是植物生命活動過程中比較重要的生理生化過程，在植物合成代謝的過程中，葉細胞總RNA下降［15］。有研究表明，即使在適宜的外界環(huán)境下，葉片衰老仍然會自發(fā)的進行，直到葉片細胞凋亡［16-17］。未處理條件下的葉片隨著時間的推移，MtSAG113基因呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，表明MtSAG113基因可能對葉片衰老具有積極作用。張?zhí)m等［18］曾發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過外源激素ABA誘導(dǎo)，編碼葉綠素酶的PpCHL1的基因在草地早熟禾葉片中表達活躍加速了葉綠素的降解。在外源施加6-BA、IAA、ABA后基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在48 h達到較低的水平，但都明顯高于對照組，比較發(fā)現(xiàn)MtSAG113基因的表達量受外源激素的誘導(dǎo)。SAG基因在葉片衰老進程中起重要作用，該基因是衰老過程中表達水平上調(diào)的基因，Singh等［19］在研究中發(fā)現(xiàn)Os SAG12-2在誘導(dǎo)衰老葉片中表達量明顯上升，可負調(diào)控誘導(dǎo)細胞死亡，促進水稻衰老。該研究中轉(zhuǎn)MtSAG113基因煙草與野生型相比出現(xiàn)矮小及葉片早衰現(xiàn)象，說明MtSAG113基因?qū)χ仓甑乃ダ暇哂幸欢ǖ拇龠M作用。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫后，鈣調(diào)蛋白基因SPCAM可誘導(dǎo)甘薯葉片衰老，說明逆境脅迫可誘導(dǎo)某些基因的表達。該研究結(jié)果顯示干旱脅迫和高鹽脅迫處理下的蒺藜苜蓿葉片表達量都高于對照組，而且干旱脅迫下呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢。表明逆境脅迫下能夠誘導(dǎo)MtSAG113基因的表達。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，SAG113基因在擬南芥中的表達量隨葉齡的延長而增加，而在突變體中，由于ABA合成代謝受阻，在葉片中的表達變得消極。本研究中外源激素及逆境脅迫對MtSAG113基因的誘導(dǎo)具有積極的作用，對此基因的誘導(dǎo)如何影響葉片發(fā)育和衰老，還需要進一步的研究。

該基因在擬南芥中研究較多，在苜蓿中鮮有研究，該基因的功能在蒺藜苜蓿中尚未得到證實。因此，本研究以煙草和蒺藜苜蓿R108葉片為材料，通過葉盤法對煙草進行轉(zhuǎn)化獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，熒光定量PCR檢測MtSAG113基因在逆境脅迫條件以及外源激素誘導(dǎo)處理下的基因表達量。為后續(xù)鑒定MtSAG113基因在蒺藜苜蓿中的功能提供研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。研究結(jié)果表明，PCR檢測成功獲得5株轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因成功的植株進行RT-PCR檢測，檢測證明MtSAG113基因在煙草中能夠成功表達。轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株相比表現(xiàn)出矮小及葉片早衰的表型；MtSAG113基因在衰老葉片中表達水平遠遠高于未衰老葉片中的表達水平；未處理葉片中的表達水平隨著時間的增加有增加的趨勢；干旱脅迫和高鹽脅迫處理下的蒺藜苜蓿葉片表達量都高于對照組，而且干旱脅迫下呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，在施加6-BA、IAA、ABA外源激素后發(fā)現(xiàn)，MtSAG113基因表達量也高于對照。說明逆境脅迫和外源激素可誘導(dǎo)MtSAG113基因在植物葉片中的表達。

4 結(jié)論

在逆境條件和外源激素處理下植物葉片中的MtSAG113基因可被誘導(dǎo)表達。這一結(jié)果為MtSAG113 基因在功能鑒定及蒺藜苜蓿中的應(yīng)用提供了新的思路；另一方面，從分子水平上為通過外部常規(guī)手段控制植物衰老提供了旁證，同時也為研究豆科植物提供了理論依據(jù)。