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        IQ-Check Salmonella II Kit方法對食品中沙門氏菌檢測的評價

        2022-03-07 07:01:00安琳余文崔生輝
        現(xiàn)代食品科技 2022年2期
        關(guān)鍵詞:檢測方法

        安琳,余文,崔生輝

        (中國食品藥品檢定研究院,北京 100050)

        沙門氏菌屬(Salmonella)是周生鞭毛的革蘭氏陰性腸道桿菌[1],是食源性疾病的主要致病菌之一[2],易造成胃腸炎、敗血癥、傷寒等相關(guān)疾病[3]。所以針對食品原料、產(chǎn)品等進(jìn)行沙門氏菌檢測是我國食品監(jiān)管部門及食品相關(guān)企業(yè)的必檢項(xiàng)目[4]。現(xiàn)有檢測方法主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)方法[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作較復(fù)雜、檢測周期較長,且需要消耗大量培養(yǎng)基[6]。分子生物學(xué)方法中的實(shí)時熒光PCR方法(Real-time fluorescent PCR,RT-PCR)通過特異性擴(kuò)增沙門菌的基因片段,從而高效準(zhǔn)確的對其進(jìn)行檢測,具有用時間短,易操作等優(yōu)點(diǎn),在食品微生物快速檢測中具有良好的應(yīng)用前景[7]。鑒于沙門氏菌檢測在食品安全中的重要地位,不同檢測試劑公司也開發(fā)了一系列針對沙門氏菌的檢測試劑盒[8]。

        BIO-RAD公司開發(fā)的IQ-Check Salmonella II試劑盒方法(以下簡稱試劑盒方法)是利用RT-PCR方法,采用專利設(shè)計(jì)的引物和熒光探針,同時96孔位上機(jī)測定,實(shí)現(xiàn)了食品中沙門氏菌的特異性高通量檢測。該試劑盒檢測預(yù)增菌后食品樣品可實(shí)現(xiàn)12 h內(nèi)報告結(jié)果,與我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》方法(以下簡稱GB方法)所需5~7 d相比極大節(jié)省了檢驗(yàn)時間[9]。但試劑盒方法性能及能否準(zhǔn)確檢測食品中病原菌還有待驗(yàn)證。本研究采用試劑盒方法對50株沙門氏菌和50株非沙門氏菌進(jìn)行檢測,分析該方法對不同菌株的靈敏性和特異性。同時參考ISO 16140[10]方法,對GB方法和試劑盒方法進(jìn)行了比較驗(yàn)證,初步分析和探討了兩種檢測方法的一致性,為試劑盒方法的有效性確認(rèn)及食品中沙門氏菌快速檢測工作提供更加優(yōu)化的解決方案。

        1 材料與方法

        1.1 菌株及食品樣品信息

        本研究采用菌株包括實(shí)驗(yàn)室保存的50株已確認(rèn)血清型沙門氏菌和50株非沙門氏菌(見表1、2)。菌株來源主要為中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC注冊菌株、美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC菌株及中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC菌株。

        表1 沙門氏菌菌株信息Table 1 The information of Salmonella strain

        表2 非沙門氏菌菌株信息Table 2 The information of non-Salmonella strain

        本研究采用的食品樣品包括液體奶、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品3大類,每類樣品各25個,均購自大型購物超市。

        1.2 試劑與儀器

        胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar,TSA)購自美國BD公司;緩沖蛋白胨水、四硫酸磺鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂平板、亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板均購自北京君立康;IQ-Check Salmonella II RT-PCR試劑盒由美國BIO-RAD公司提供。

        PL2002電子天平,梅特勒;MLS-3780高壓滅菌器,日本三洋;ESCO生物安全柜;金屬浴,Eppendorf;MIR262生化培養(yǎng)箱,日本三洋;21R微量離心機(jī),美國Thermo;全自動微生物平皿螺旋加樣系統(tǒng),西班牙IUL;CFX96 Touch Deep Well實(shí)時定量PCR系統(tǒng),美國BIO-RAD。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 IQ-Check試劑盒方法及結(jié)果判讀

        DNA模板制備標(biāo)準(zhǔn)方法:取1 mL增菌液,12000×g轉(zhuǎn)速離心5 min,棄上清,向沉淀中加入200 μL試劑A裂解液,渦旋混勻,97 ℃金屬浴裂解15 min,渦旋混勻后離心,DNA于上清液中備用。

        DNA模板制備簡單方法:100 μL待測菌懸液加入100 μL裂解液試劑A,渦旋混勻,97 ℃金屬浴裂解15 min,渦旋混勻后離心,DNA于上清液中備用。

        取45 μL PCR反應(yīng)液和5 μL DNA模板于八連排PCR管中,短暫離心后上機(jī)。采用試劑盒配套 CFX MIDE 2.1軟件,選擇Salmonella程序開始檢驗(yàn),直至結(jié)束后收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min預(yù)變性,以95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s作為一個循環(huán),共50個循環(huán)。熒光通道選擇FAM和HEX(內(nèi)部質(zhì)控)。

        當(dāng)FAM信號檢出Ct值≥10,測試結(jié)果報告陽性;當(dāng)FAM信號未檢出,HEX信號檢出Ct值≥28,測試結(jié)果報告陰性。樣品平行測試結(jié)果均為陽性,即判定樣品為陽性。樣品平行測試如出現(xiàn) 1個陰性,即判定樣品陰性。

        1.3.2 方法靈敏性評價

        將50株經(jīng)過鑒定的沙門氏菌新鮮二代培養(yǎng)物用無菌生理鹽水調(diào)成1.5 MCF菌懸液,梯度稀釋至104、103、102CFU/mL,使用簡單方法進(jìn)行 DNA模板制備及RT-PCR檢測,設(shè)置三平行測試,同時進(jìn)行E50螺旋涂布菌落計(jì)數(shù),檢測結(jié)果報告陽性的最低細(xì)菌濃度為試劑盒方法檢出限。

        1.3.3 方法特異性評價

        將50株經(jīng)過鑒定的非沙門氏菌新鮮培養(yǎng)物用無菌生理鹽水調(diào)成1.0 MCF菌懸液(108CFU/mL),使用簡單方法進(jìn)行DNA模板制備及RT-PCR檢測,以沙門氏菌作為陽性對照,考察試劑盒方法特異性,設(shè)置雙平行測試。

        1.3.4 方法一致性評價

        分別按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016[9]和BIO-RAD公司所提供的IQ-Check試劑盒操作方法進(jìn)行檢驗(yàn)。取液體乳、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品25 g加入于225 mL BPW混勻,采用人工污染腸炎沙門氏菌CICC21482制備污染水平為0、10-1、100、101CFU/25 g樣品,經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h預(yù)增菌后,增菌液采用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA模板制備及RT-PCR檢測,設(shè)置三平行測試。同時參照GB方法進(jìn)行TTB和SC肉湯增菌后,劃線XLD和BS平板進(jìn)行分離培養(yǎng)及沙門氏菌鑒定試驗(yàn)。

        參考ISO 16140[10]中的原則,計(jì)算試劑盒方法(替代方法)與GB方法(參照方法)的相對準(zhǔn)確性(AC)、相對特異性(SP)和相對靈敏度(SE)并按照ISO 16140附件F的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法評價兩方法的一致性。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 方法靈敏性評價

        采用試劑盒方法測定50株沙門氏菌的檢出限見表3。當(dāng)沙門氏菌濃度在103CFU/mL及以上時,RT-PCR對所有菌株檢測結(jié)果均為陽性。當(dāng)沙門氏菌濃度稀釋至102CFU/mL,仍有36株沙門氏菌能夠檢出。通過計(jì)算可知試劑盒方法對50株沙門氏菌檢出限的平均值為6.98×102CFU/mL,說明該方法具有良好的靈敏性。

        表3 試劑盒方法對于50株沙門氏菌的檢出限Table 3 Detection limit of 50 Salmonella strains by kit method

        2.2 方法特異性評價

        采用試劑盒方法對50株非沙門氏菌進(jìn)行檢測,除陽性對照外所有菌株的檢測結(jié)果均為陰性,見圖1。說明試劑盒方法有很好的特異性,與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)。

        2.3 方法一致性評價

        以液體奶(n=100)、嬰幼兒配方乳粉(n=100)、肉及肉類制品(n=100)3類食品作為樣品基質(zhì),采用試劑盒方法和 GB方法對沙門氏菌人工染菌樣品的檢測結(jié)果如表4所示。不添加污染菌的空白對照結(jié)果均為陰性,101CFU/25 g染菌濃度三類食品樣品的兩方法檢測結(jié)果均為陽性(75/75);100CFU/25 g染菌濃度的液體奶樣品兩方法檢出結(jié)果一致(21/21);10-1CFU/25 g染菌濃度的10#、17#液體奶樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性,9#、18#液體奶樣品 GB方法檢測陽性試劑盒方法檢測陰性。試劑盒方法對100CFU/25 g染菌濃度的嬰幼兒配方乳粉樣品檢出數(shù)高于GB方法(18/17),23#樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性;10-1CFU/25 g染菌濃度的嬰幼兒配方乳粉樣品兩方法檢出結(jié)果一致(4/4);試劑盒方法對100CFU/25 g和10-1CFU/25 g染菌濃度的肉及肉類制品檢出數(shù)均高于GB方法(23/22和13/11),16#和17#、19#樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性。結(jié)果分析可知試劑盒方法與 GB方法的陽性檢出率為98.77%(161/163)和96.32%(157/163)。

        表4 試劑盒方法和GB方法對沙門氏菌人工染菌食品樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of artificially contaminated food samples with Salmonella by kit method and GB method

        試劑盒方法對三類食品基質(zhì)中沙門氏菌加標(biāo)樣品的相對準(zhǔn)確度(AC)、相對靈敏度(SE)和相對特異性(SP)結(jié)果如表5所示。對液體奶、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品加標(biāo)樣品檢測相對準(zhǔn)確度為:96%、99%、97%,總體準(zhǔn)確度為97.33%;檢測靈敏度為:96.22%、100%、100%,總體靈敏度為 98.73%;檢測特異性結(jié)果為:95.74%、98.15%、92.86%,總體特異性為95.80%。根據(jù)ISO 16140:2003附錄F計(jì)算出兩種方法的一致性,結(jié)果如下:PD=6,ND=2;Y=PD+ND=8;6≤Y≤8,M=0,m>M。故得出結(jié)論:兩種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著性差異。

        表5 試劑盒法的相對準(zhǔn)確度(AC)、相對靈敏度(SE)和相對特異性(SP)結(jié)果Table 5 Relative accuracy (AC), relative sensitivity (SE) and relative specificity (SP) of the kit method

        IQ-Check試劑盒方法是基于實(shí)時熒光PCR原理的檢測方法,該類方法對目標(biāo)物通常具有較低的檢出限[11]。謝雨龍等[12]建立的實(shí)時熒光PCR法對模擬污染的預(yù)包裝柳州螺螄粉模經(jīng)過一步增菌18 h后最低檢測出4 CFU/25 g沙門氏菌。麻麗丹等[13]建立的Taqman MGB實(shí)時熒光PCR法對江瑤貝和蜆子肉中添加腸炎沙門氏菌的最低檢測低限為130 CFU/mL。本研究數(shù)據(jù)表明試劑盒方法對 50株不同血清型沙門氏菌的檢出限為102~103CFU/mL,與相關(guān)研究結(jié)果基本一致。當(dāng)菌濃度達(dá)到103CFU/mL及以上時,50株沙門氏菌檢測結(jié)果均為陽性。然而由于該方法靈敏性高,為避免陽性樣本的交叉污染,需要對實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、設(shè)備和器具規(guī)范使用、人員操作和環(huán)境等提出更嚴(yán)格要求[14]。本研究采用50株包含多屬種的高濃度(108CFU/mL)非沙門細(xì)菌以驗(yàn)證試劑盒法的特異性,結(jié)果表明試劑盒與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng),該結(jié)果具有比較充分的代表性。

        本研究采集75份不同品牌液體奶、嬰配乳粉、肉及肉制品食品樣品并選擇101、100、10-1CFU/25 g三個較低的染菌濃度條件,考察試劑盒方法與GB方法的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與GB方法相比,試劑盒方法對不同樣品中人工污染的沙門氏菌的檢測呈現(xiàn)較好的一致性和準(zhǔn)確度(總體準(zhǔn)確度97.33%),且兩方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異。實(shí)驗(yàn)中只有個別樣品檢測結(jié)果存在差異,其中國標(biāo)方法檢出陽性試劑盒方法未檢出的 2份染菌濃度為10-1CFU/25 g液體奶樣本,可能是由于染菌濃度過低而出現(xiàn)的隨機(jī)性結(jié)果,4份國標(biāo)方法未檢出而試劑盒方法檢出陽性的10-1CFU/25 g液體奶和肉類樣品,可能是試劑盒方法更為靈敏的體現(xiàn)。此外采用試劑盒方法進(jìn)行食品樣品檢測僅需要2 d,該方法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法在處理一些突發(fā)食品安全事件中,由于檢測時效慢而不能滿足快速檢測的需求。

        3 結(jié)論

        綜上表明,IQ-Check試劑盒方法對沙門氏菌檢驗(yàn)具有良好的靈敏性和特異性,在液體奶、嬰配奶粉和肉及肉類制品樣品中,該方法與國標(biāo)法相比呈現(xiàn)了良好的一致性和準(zhǔn)確度。鑒于該方法具有操作簡單、耗時短的特點(diǎn),因此該方法適用于公司企業(yè)進(jìn)行沙門氏菌的快速檢測,具有較好的可推廣性。

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