邢廣旭，趙東，孫雪峰，溫留丁，張穎碩，張改平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450003）

司帕沙星（SPFX）是第三代氟喹諾酮類抗菌劑，因其對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、支原體、衣原體、分枝桿菌等具有良好的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)傳染病的治療和預(yù)防。它能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV和DNA旋轉(zhuǎn)酶的功能，導(dǎo)致微生物DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的失敗，具有強(qiáng)烈而廣泛的殺菌作用。

近年來，司帕沙星（SPFX）不僅用于細(xì)菌感染的預(yù)防和治療，而且作為一種促進(jìn)生長的工具。由于SPFX的濫用，其殘留和對該抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌的出現(xiàn)已成為主要的公共衛(wèi)生問題[1-3]。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，氟喹諾酮類藥物的毒副作用包括食欲減退、嘔吐、光毒性、遺傳毒性等。

盡管SPFX的急性毒性在食品安全領(lǐng)域尚未見報道，但考慮到未知的潛在生態(tài)風(fēng)險，低水平SPFX的食品監(jiān)測是必不可少的。越來越多的國家正在制定最大殘留量（MRL）和氟喹諾酮類原料藥的停藥時間。根據(jù)食品和藥品的不同來源，氟喹諾酮類原料藥的最大殘留限量設(shè)定在30～1500 μg/kg[4]。我國農(nóng)業(yè)部已制定了氟喹諾酮類原料藥的動物種類、劑量、用法和停藥期限（No.278，2003.5.22）。為了監(jiān)測動物性食品中SPFX的殘留量，有必要建立簡便、快速的分析方法。

目前，動物性食品中氟喹諾酮類藥物的分析方法有生物測定法、高效液相色譜法、熒光分析法、分光光度法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法。但是當(dāng)涉及到多類生物樣品時，這些方法已經(jīng)顯示出檢測SPFX的一些缺點(diǎn)，例如耗時、昂貴、低吞吐量、高背景或需要昂貴的設(shè)備。因此，有必要建立一種簡便、靈敏、低成本的SPFX分析方法。

在以往的研究中，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已廣泛應(yīng)用于食品和動物組織（肌肉、血清、肝、腎、蛋和乳）中包括氟喹諾酮類藥物在內(nèi)的獸藥殘留的篩選[5-8]。一些氟喹諾酮類藥物，如諾氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、馬波沙星、環(huán)丙沙星和達(dá)諾氟沙星，已被研究用于發(fā)展免疫分析[8-12]。根據(jù)目前報道，ELISA法測定動物性食品和食品中SPFX的報道還很少。

本研究的主要目的是建立一種免疫單克隆抗體ELISA檢測限度。在檢測豬肉中SPFX殘留時，具有特異性高，背景低和無需樣品預(yù)處理的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑

司帕沙星、氟羅沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、萊克多巴胺、特布他林、慶大霉素、沙布他莫和克倫特羅由國家藥品生物制品檢定所（中國北京）提供。N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma-Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯）。卵清蛋白和牛血清白蛋白購自上海上寶生物科技有限公司（中國上海）。吐溫-20和N，N-二甲基甲酰胺購自中國廣東省廣州市東宏化工公司。3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺購自Amresco（Solon，OH）。山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物購自軍事醫(yī)學(xué)研究所（中國北京）。

1.2 儀器

ELISA在聚苯乙烯96孔微量滴定板（Bio-Basic公司）中完成。紫外數(shù)據(jù)是從日立公司的 U-4100分光光度計收集。微孔板閱讀器 450/550來自 Bio-Rad（加利福尼亞州里士滿）。超純水由milipore（Bedford，MA）獲得。

1.3 緩沖液和溶液

在免疫分析過程中，所有試劑和緩沖液的制備均采用超純?nèi)ルx子水。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）由147 mmol/L KH2PO4、136.9 mmol/L NaCl、268.3 mmol/L KCl和 809.7 mmol/L Na2HPO4·12H2O 組成。洗滌緩沖液（PBST）為含有0.05%吐溫-20的PBS緩沖液（0.01 mmol/L，pH 7.4）。使用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（由 17.5 mmol/L NaHCO3和 7.5 mmol/L Na2CO3組成，pH 9.6）制備包衣緩沖液。底物緩沖液為0.1 mol/L醋酸鈉/檸檬酸鹽緩沖液（pH 5.0）。含有0.05%豬血清的洗滌緩沖液為阻斷緩沖液。為制備基質(zhì)溶液，將 1.27 mg 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺溶解于 0.5 mL甲醇中并添加0.5 mL甘油。

1.4 免疫原和包被抗原的制備

免疫原通過使用NHS酯法[11]（圖1）將SPFX與BSA結(jié)合來合成。首先，將半抗原（1.5 mg）溶解于DMF（1 mL）中。向溶液中加入NHS（1.80 mg）和DCC（3.20 mg），在無光和室溫下混合12 h。然后，將BSA（5.10 mg，溶于2 mL PBS）緩慢地添加到劇烈攪拌的活性NHS溶液中，然后在室溫下攪拌4 h。最后，將半抗原-BSA結(jié)合物在4 ℃透析72 h。將獲得的SPFX-BSA免疫原凍干并在-20 ℃儲存。包被抗原SPFX-OVA的設(shè)計方法相同。用紫外吸收光譜對偶聯(lián)物進(jìn)行了表征。

1.5 單克隆抗體產(chǎn)生

3只雌性BALB/C小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心（實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SYXK(E)2021-0003）。小鼠在光暗循環(huán)12 h，室溫24±2 ℃和有飲用水條件下飼養(yǎng)。用免疫原BSA-SPFX多部位皮下免疫小鼠。初始接種為皮下注射0.15 mg結(jié)合物，加入0.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）和0.5 mL不完全佐劑。其余3次強(qiáng)化免疫均以 0.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）和 0.5 mL iFA注射0.25 mg SPFX-BSA，間隔20 d。從第三次免疫開始，使用ELISA法測定血清滴度。用抗血清分離材料中的顆粒，將血液凝塊放在4 ℃過夜。

通過ELISA法測定血清效價，讓血液凝塊在4 ℃過夜分離帶有抗血清的顆粒物。部分細(xì)胞融合程序和亞克隆條件在此僅作簡要描述。

NS0骨髓瘤細(xì)胞在添加有 100單位/mL、10%FBS、青霉素鏈霉素100 μg/mL的RPMI-1640中維持在指數(shù)生長階段。取對SPFX競爭最強(qiáng)、效價最高的小鼠脾臟，與骨髓瘤細(xì)胞以10:1的比例與PEG 1500融合。融合細(xì)胞分布于96孔培養(yǎng)板中，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備與選擇性HAT培養(yǎng)基結(jié)合前一天。擴(kuò)展孔培養(yǎng)顯示SPFX識別活性，以有限稀釋進(jìn)行亞克隆3次。菌落在含有冷凍液氮和10%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基中冷凍，然后解凍3次以選擇產(chǎn)生的克隆抗體的穩(wěn)定性。成熟雌性BALB/c小鼠腹腔注射（ip）0.5 mL石蠟10 d前接受IP進(jìn)入陽性雜交瘤細(xì)胞，注射后10 d收集腹水。小鼠用10%水合氯醛1～2 mL腹內(nèi)注射，然后根據(jù)改變的辛酸硫酸銨沉淀（CAASP）測定確定mAb的純化。mAb在這項(xiàng)工作中表現(xiàn)出最高的滴度和靈敏度。所有實(shí)驗(yàn)程序均按照鄭州大學(xué)動物護(hù)理意向標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動物使用委員會的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.6 間接競爭ELISA

將 50 μL SPFX-OVA 溶液（在包被緩沖液中為5000 μg/L）包被在每個孔中。37 ℃孵育2 h，用洗滌緩沖液洗滌5次。然后，將封閉緩沖液（250 μL）加入到每個板中，4 ℃孵化過夜。再次用洗滌緩沖液洗滌4次后，每孔加入50 μL適當(dāng)稀釋的抗SPFX抗體和50 μL樣品，37 ℃孵育30 min。再次洗板四次，羊抗鼠 IgG-HRP（50 μL/孔，1:1000）37 ℃孵育 30 min。2.5 mL緩沖液和2.5 mL底物溶液緩慢混合至顯色。將混合物（50 μL/孔）加入樣品中，并將板在室溫下溫育10 min。每孔50 μL終止液終止反應(yīng)。通過酶標(biāo)儀在450 nm處測定與板結(jié)合的酶活性。免疫前提取的血清作為陰性對照。

1.7 檢測的靈敏度和特異性

測定B/B0比值為0.5時的抑制劑濃度（IC50值）和交叉反應(yīng)性（CR），以評價該方法的特異性和敏感性。用四種相關(guān)化合物進(jìn)行競爭性免疫測定，包括氟甲喹、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星和其他幾種化合物。這四個化合物的選擇基本上是因?yàn)樗鼈冊诮Y(jié)構(gòu)上與SPFX有關(guān)。測試氟喹諾酮API部署到icELISA程序中，如上所述用于SPFX。CR值計算如下：

1.8 豬肉提取物的制備及HPLC分析

豬肉樣品在鄭州市場購買并由鄭州農(nóng)業(yè)部監(jiān)督檢驗(yàn)中心采用高效液相色譜法（HPLC）檢測。將不含SPFX的豬肉末樣品（5 g）用5 mL均質(zhì)提取溶劑1:5（V/V）甲醇和PBS均質(zhì)化，以調(diào)節(jié)pH值為7.4和6N鹽酸。勻漿在1 min渦旋混合器中混合，劇烈振蕩35 min，然后以12000 r/min離心1.5 h。將上清液用測定緩沖液稀釋十倍，然后將其應(yīng)用于微量滴定板。ELISA和HPLC分析方法對同一樣品進(jìn)行定量比較兩種方法的一致性。高效液相色譜分析在安捷倫 1200系統(tǒng)上進(jìn)行。安捷倫Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm粒徑），25 ℃下流速為1 mL/min；保持以下條件：洗脫液：乙腈30.05 mol磷酸鹽緩沖液（pH 2.4）（15:85，V/V）；進(jìn)樣量：20 mL。在這種情況下，SPFX保留時間為13 min。豬肉樣品的含量分別為50、225、622 μg/L，分別代表低、中和高水平的殘留。

1.9 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被表示為幾個實(shí)驗(yàn)的 x±S。使用 SPSS 15.0軟件對方差進(jìn)行單向ANOVA分析，評估了統(tǒng)計學(xué)意義α。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原結(jié)合

為了制備高質(zhì)量的抗體，發(fā)展高靈敏度、特異性的免疫分析方法是非常有必要的。SPFX（分子量：392.41）作為一個小分子，必須對目標(biāo)分析物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?。由于SPFX分子羧基的第3位為陽性，使最常用的蛋白質(zhì)（BSA和 OVA）直接與其結(jié)合。

2.2 抗體特性

間接 ELISA法測定的單克隆抗體效價是以一個吸光度值相互稀釋兩次的結(jié)果，對抗體與SPFX和其他氟喹諾酮類藥物的結(jié)合能力進(jìn)行了評價。恩諾沙星、氟羅沙星、氟甲喹、環(huán)丙沙星、萊克多巴胺、慶大霉素、沙丁胺醇、特布他林和克倫特羅的代表性ELISA曲線如表1所示，從該試驗(yàn)獲得的IC50值如圖2所示。它顯示出與IC50值幾乎相等的相對親和力。

表1 SPFX單抗與競爭化合物的CRTable 1 The CR of SPFX mAb with compete compounds

2.3 ICESIA的優(yōu)化

使用棋盤法測試包衣抗原 SPFX-OVA、抗體和GaRIgG HRP的濃度[13]。包被抗原的SPFX-OVA濃度為 2000 μg/L；單克隆抗體效價為 1:1.6×105；GaRIgG-HRP的稀釋度為1:1000。

在不同孵育條件下（4 ℃過夜、60 min過夜、37 ℃過夜120 min）檢測包被抗原。在4 ℃下涂覆過夜或在37 ℃下涂覆120 min，孵育效果無顯著差異。結(jié)果表明，在37 ℃保溫60 min時，其IC50值較高（＞20 μg/L），最終在37 ℃保溫120 min。免疫反應(yīng)時間分別為30 min、60 min和120 min。結(jié)果表明，免疫反應(yīng)60 min效果最好，IC50最低。

還應(yīng)仔細(xì)選擇封閉緩沖液，因?yàn)樗糜诜乐狗翘囟ㄎ舛萚14]。用2000 μg/L OVA-SPFX在37 ℃下包覆2 h，洗凈后用5%豬血清、5%脫脂奶粉或0.5% BSA每孔200 μL分別在37 ℃下封閉30 min、1 h和2 h。以1/1.6×105稀釋SPFX mAb作為陽性對照。以產(chǎn)生最大P/N值的阻斷液和阻斷時間為最優(yōu)。三種阻斷劑阻斷1 h和2 h的P/N值無顯著性差異。所有這些條件都表明培養(yǎng)板完全被封閉，因此在37 ℃下與5%豬血清孵育1 h，所以在本研究中被選為阻斷緩沖液。室溫下孵育10 min，P/N值最大，孵育時間越長，P/N值越低；因此，以10 min為最佳。

2.4 方法性能

IC50值是評價ELISA敏感性的重要指標(biāo)，IC50值越低，檢測靈敏度越高。在本研究中，IC20～I(xiàn)C80值范圍為3.87至248.12 μg/L，R2=0.9827（圖3）。IC50平均值為31 μg/L，表明已建立的icELISA具有高度靈敏。

從表1可以看出，含有四種結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物的抗體的CR值為0.31%～11.99%；抗體與其它化合物的識別率很低（CR＜0.31%）。CR值可以清楚地表明本研究中獲得的單克隆抗體對目標(biāo)分析物SPFX表現(xiàn)出非常高的特異性。對所開發(fā)的測定方法在豬肉中 SPFX殘留量測定中的適用性進(jìn)行了測試，結(jié)果如表2所示。在本研究中，回收率研究的樣品是通過在PBS中稀釋提取物制備的，無需進(jìn)一步處理。

表2 用SPFX摻加的豬肉的批間和批內(nèi)差異摻加的SPFX（μg/L）批內(nèi)批間Table 2 Inter-assay and intra-assay variations of pork spiked with SPFX spiked SPFX (μg/L) intra-assay inter-assay measured

2.5 豬肉樣品分析

應(yīng)用icELISA法測定了鄭州市豬肉中SPFX的含量。樣品1、樣品2和樣品3的檢出濃度分別為48.77、219.32 和 614.63 μg/L（表3）。

表3 通過ELISA和HPLC樣品測定的豬肉樣品中SPFX的濃度Table 3 Concentrations of SPFX in pork samples determined by ELISA and HPLC Sample

2.6 討論

如上所述，通過 DCC方法將載體蛋白上的羧基轉(zhuǎn)化為伯胺基。采用紫外吸收法分別測定BSA、SPFX和SPFX-BSA。在紫外光譜法中，SPFX-BSA的喹諾酮類部分的吸收峰已移到224 nm和292 nm（圖3），這意味著 SPFX與 BSA的結(jié)合成功。包被抗原SPFX-OVA與SPFX-BSA具有相似的UV圖譜。

如其他研究所述，當(dāng)將氟喹諾酮的羧基連接到載體蛋白合成的免疫原制備抗體時，發(fā)現(xiàn)這些氟喹諾酮之間具有高交叉反應(yīng)性[8，15]。用SPFX抗體的CR值、恩諾沙星、氟羅沙星、氟甲喹、環(huán)丙沙星等4種氟喹諾酮類藥物的CR值評價該方法的特異性。

將已知量的SPFX添加到豬肉中，并使用緩沖液中制作的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析。添加35、105和315 μg/L的豬肉樣品的平均回收率分別為104、102和101（批內(nèi)回收率）和106、104和102（批間）回收率。CV（變異系數(shù)）的范圍分別為測定內(nèi)的0.97%～5.68%和測定間的1.07%～5.51%。由于35 μg/L接近31 μg/L的檢測限，因此需要更大的變異性和更低的準(zhǔn)確度。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對豬抽提液進(jìn)行了一系列稀釋，并比較了PBS緩沖液中的結(jié)果。提取液稀釋1:10，抑制曲線與PBS緩沖液基本一致。緩沖溶液中的測試極限為31 Cg/L。采用SPFX的濃度檢測限吸光度值降至無競爭吸光度值的90%。HPLC與icELISA的結(jié)果具有良好的一致性，進(jìn)一步證實(shí)了icELISA的可靠性。

越來越多的國家已經(jīng)制訂了喹諾酮類藥物的最大殘留量（MRLs）和停藥期，所以必須對樣品進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測以確保SPFX的正確使用。沈翠香等人[16]采用微生物抑制法來檢測恩諾沙星藥物殘留，其處理方法簡便，成本低的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被許多企業(yè)所應(yīng)用，但每組測試只能篩檢一類藥物，在初篩期間還會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，所以不能準(zhǔn)確地進(jìn)行獸藥殘留分析。萬雄等人[17]采用HPLC法檢測水產(chǎn)品中的司帕沙星殘留，該方法檢測結(jié)果精確、假陽性率低，但需對待測樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，而且設(shè)備昂貴，在面對大量待測樣品時就略顯不足。

3 結(jié)論

本研究制備了一種特異性單克隆抗體，采用高靈敏度間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法測定動物性食品中的SPFX，IC50最低達(dá)到31 μg/L，目前沒有抗體具有四種結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物和其他化合物。試驗(yàn)表明本研究中所建立的ELISA方法具備靈敏度高，特異性高，準(zhǔn)確度高，易操作，相對于HPLC法更加快速、便捷，可用于動物性食品中SPFX殘留的快速檢測。