胡流云，劉岑岑，陳洪璋，劉果，3，溫林鳳，張軍，曹庸*，陳聰*

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東省天然活性物工程技術研究中心，廣東 廣州 510642）（2.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510000）（3.華南農業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

靈芝，擔子菌類多孔菌科，其性味甘、平，作為治療和預防疾病藥方中的一種中藥，有治療肝病、關節(jié)炎、高血壓、神經衰弱、身體虛弱[1]的功效。靈芝含有的功效成分種類豐富，除靈芝總糖、靈芝三萜等天然活性物之外，還富含核苷類、生物堿類、微量元素等，是其具有抗氧化、抗腫瘤[2]等功效的原因。

從靈芝的子實體、孢子和菌絲體中均能提取到靈芝總糖，是其所含主要的化學成分之一[3]，也是目前靈芝成分中研究最多的物質，截至2019年，已分離研究的多糖種類達200多種[4]，靈芝總糖的提取方法是先用熱水提取，然后用乙醇或甲醇沉淀，但也可以用水和堿提取，但其提取效率低，提取時間長。靈芝三萜屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物[5]，其生物合成是基于角鯊烯的環(huán)化作用，提取方式以丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚或這些溶劑的混合物進行。提取物可以通過各種分離方法進一步純化，包括正相和反相HPLC。最先從靈芝中分離出的三萜是靈芝酸A和靈芝酸B[6]，目前已知靈芝三萜種類超135種[7]。

靈芝的活性成分總體含量不高，利用率低，為獲得更大的經濟效益，根據現有的資源和條件探尋提高靈芝天然活性物提取率的方法，進一步提高靈芝的利用率顯得尤為重要。本實驗采用的是本課題組自主研發(fā)的低溫連續(xù)相變萃取裝置（ZL 201310306553.5），目前低溫連續(xù)相變萃取技術已被廣泛應用于多種產物提取，如陳皮揮發(fā)油[8]、廣佛手精油[9]、藍圓鲹魚油[10]等。本研究探討了在中試條件下低溫連續(xù)相變萃取技術提取靈芝活性成分的最佳工藝，旨在為靈芝活性成分的綜合利用和工業(yè)化大生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與試劑

赤靈芝，無限極（中國）有限公司；乙醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；齊墩果酸（標準品），湖南一科生物科技有限公司；乙腈（色譜純），美國J.T.Baker公司；甲醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；高錳酸鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉（分析純），天津市大茂化學試劑廠；香蘭素（分析純），天津市福晨化學試劑廠；冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯（分析純），天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 實驗設備

低溫連續(xù)相變萃取裝置，廣東省天然活性物工程技術研究中心自主研發(fā)；119中藥粉碎機，浙江溫嶺市藥材機械廠；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1750紫外分光光度計，日本島津制造所；LC-10 A高效液相色譜儀，日本島津公司；TSK gel（G6000-G3000pwxl）色譜柱，北京綠百草科技發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)水提工藝提取靈芝活性成分

參照張志軍等[11]的方法，將靈芝切片、粉碎、過3目篩網；加入12倍體積的三級水，100 ℃水浴提取2.5 h；經80目篩網過濾至貯液鍋；加入10倍體積三級水，100 ℃水浴提取2.0 h；抽濾，合并兩次水取的濾液，濃縮，溫度控制在 90 ℃，取濃縮后樣品計算固形物得率，檢測總糖含量。

1.3.2 低溫連續(xù)相變裝置水提后醇提工藝提取靈芝活性成分

取已粉碎過3目篩網的靈芝粉，選用三級水，萃取溫度95 ℃、萃取壓力0.1 MPa、解析溫度80 ℃、泵流速75 L/h提取靈芝原料，萃取時間5 h，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖含量。

水提結束后進行醇提，選用95%乙醇，萃取溫度以及解析溫度都為70 ℃、萃取壓力0.1 MPa、泵流速100 L/h時提取靈芝原料，萃取時間5 h，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖含量。

1.3.3 低溫連續(xù)相變裝置醇提后水提工藝提取靈芝活性成分

取已粉碎過3目篩網的靈芝粉，選用95%乙醇，萃取溫度以及解析溫度均為70 ℃、萃取壓力0.1 MPa、泵流速100 L/h提取靈芝原料，萃取時間總計5 h，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖含量

醇提結束后進行水提，選用三級水，萃取溫度95 ℃、萃取壓力0.1 MPa、解析溫度80 ℃、泵流速35 L/h提取靈芝，萃取時間5 h，將解析罐中提取液放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖含量。

1.3.4 低溫連續(xù)相變裝置水提后醇提靈芝活性成分的工藝優(yōu)化

①低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝水提部分優(yōu)化：

以水提原料所得固形物、總糖以及三萜及甾醇總含量為考察指標，對水提時間、溶劑流速、水提溫度等單因素水提工藝進行優(yōu)化。水提時間的優(yōu)化：在萃取溫度95 ℃、萃取壓力0.1 MPa、解析溫度80 ℃、泵流速20 L/h提取靈芝原料，萃取時間1、2、3、4、5、6、7、8、9 h，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖和總三萜含量；溶劑流速的優(yōu)化：在萃取溫度95 ℃、萃取壓力0.1 MPa、解析溫度80 ℃、萃取時間5 h，溶劑流速20、30、40 L/h，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖和總三萜含量；水提溫度的優(yōu)化：在萃取壓力0.1 MPa、解析溫度80 ℃、萃取時間5 h，溶劑流速20 L/h，萃取溫度50、75、100 ℃，將解析罐中提取液全部放出，濃縮，并測定其固形物含量、總糖和總三萜含量；

②低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝醇提部分優(yōu)化：

單因素實驗：醇提時間對靈芝活性成分提取效果的影響：在水提5 h的基礎上，將原料自然瀝干，注入95%乙醇提取，流速25 L/h，每隔1 h取樣，合計取樣9次，考察醇提時間對提取物三萜含量的影響；醇提濃度對靈芝活性成分提取效果的影響：在水提5 h的基礎上，將原料自然瀝干，注入95%乙醇提取，醇提時間5 h，乙醇濃度分別為95%、80%、70%、60%，考察醇提濃度對提取物三萜含量的影響；醇提溫度對靈芝活性成分提取效果的影響：在水提5 h的基礎上，將原料自然瀝干，然后注入95%乙醇提取，醇提時間5 h，乙醇濃度95%，醇提溫度分別為90、80、70、60 ℃，考察醇提溫度對提取物三萜含量的影響。

乙醇回流提取靈芝活性成分正交實驗：根據單因素實驗結果，選取萃取溫度、萃取溶劑濃度以及萃取時間三個因素中較優(yōu)的三個水平設計正交實驗，實驗設計選擇L9（34）正交表，各因素水平如表1所示。

表1 乙醇回流正交實驗因素水平Table 1 The level of orthogonal experimental factors in ethanol reflux

低溫連續(xù)相變醇提靈芝活性成分正交實驗：根據單因素實驗結果，選取萃取溫度、萃取溶劑濃度以及萃取時間三個因素中較優(yōu)的三個水平設計正交實驗，實驗設計選擇L9（34）正交表，各因素水平如表2所示。

表2 低溫連續(xù)相變醇提正交實驗因素水平Table 2 Factors of orthogonal experiment of ethanol extraction with low-temperature continuous phase change transition

1.3.5 總糖含量測定方法（高錳酸鉀法）

總糖含量的測定：參照王富山等[12]方法，用高錳酸鉀標準滴定法，計算濃縮液中總糖含量。

1.3.6 總三萜含量測定方法

參照《中國藥典》[13]，根據標準曲線計算樣品中三萜含量。靈芝總三萜得率按以下公式計算：

1.3.7 總糖分子量分布及含量測定方法

采用高效液相色譜儀配備示差檢測器，色譜柱為凝膠色譜柱：TSKgel G6000PWxl柱與 TSKgel G3000PWxl柱串聯，采用的流動相為 0.02 mol/L Na2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫箱溫度為35 ℃，上樣體積為 20 μL。用 0.5、1.2、2.5、5、8、15、27、41、67、180萬分子量的葡聚糖標準品，以保留時間對應的洗脫體積為橫坐標，相對分子量為縱坐標建立標準曲線。

1.3.8 數據處理

每個樣品做 3次重復實驗，所得數據用 SPSS V17.0軟件統(tǒng)計分析，使用IBM SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理正交實驗的極差分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同工藝提取靈芝活性成分對比分析

參照張志軍等[11]的傳統(tǒng)水提工藝提取靈芝活性成分的固形物、總糖和總三萜的得率分別為 4.06%、0.67%、0.77%。低溫連續(xù)相變先水提后醇提工藝提取靈芝活性成分固形物、總糖、總三萜的得率分別為6.34%、0.80%、1.59%。低溫連續(xù)相變先醇提后水提工藝提取靈芝活性成分固形物、總糖、總三萜的得率分別為 5.19%、0.93%、1.10%（如表3所示）。對比三種提取工藝，低溫連續(xù)相變萃取工藝提取靈芝所得固形物、總糖和總三萜的得率明顯高于水提，熱水浸提是靈芝多糖提取的傳統(tǒng)方法，提取時間長、能源消耗大、多糖得率低、活性差[14]；低溫連續(xù)相變萃取工藝中先水提后醇提比先醇提后水提所得固形物多22.16%，優(yōu)勢明顯；低溫連續(xù)相變萃取工中先醇提后水提工藝較先水提后醇提所得總糖更高，但是先水提后醇提工藝中水提 5 h可將提取出 89.12%的總糖含量，而先醇提后水提工藝中醇提5 h只能提出49.67%的總糖，因此先水提后醇提工藝生產效率更高；低溫連續(xù)相變萃取工藝中先水提后醇提工藝較先水提后醇提工藝提取靈芝總三萜得率高44.55%。綜上，低溫連續(xù)相變萃取工藝比傳統(tǒng)水提工藝更優(yōu)，低溫連續(xù)相變先水提后醇提工藝比先醇提提后水提總體得率更多，效率更高。為進一步提高靈芝活性成分的提取率，我們設計實驗對低溫連續(xù)相變先水提后醇提工藝進行了優(yōu)化。

表3 不同工藝提取靈芝活性成分分析Table 3 Analysis of effective components from Ganoderma lucidum by different extraction techniques

2.2 低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的水提工藝優(yōu)化

水提時間的優(yōu)化：水提分小時提取所靈芝活性成分如表4所示。9 h固形物得率合計為6.19%，5 h固形物得率合計為5.59%；9 h總糖得率合計為1.50%，5 h總糖得率合計為 1.27%；9 h總三萜總得率為0.37%，5 h總三萜總得率為0.32%（表4）。結果表明，隨著水提時間的延長，水提靈芝所得活性成分逐漸增多，5 h后總糖得率趨于平穩(wěn)，說明此時提取液中的總糖已達到平衡[11]。5 h水提靈芝所得固形物、總糖和總三萜分別占9 h水提靈芝所得的90.31%、84.67%和86.49%，所以水提5 h效率最高，利于放大生產。

表4 水提時間對低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的影響Table 4 Effect of water time on the extraction of active components from Ganoderma lucidum by low-temperature continuous phase change transition

水提溶劑流速的優(yōu)化：以每小時通過物料罐中靈芝原料的溶劑量為考察因素，總糖提取率為考察指標，考察不同的溶劑流速對靈芝原料的固形物以及總糖含量的影響。溶劑流速為30 L/h時，所得固形物得率最高為5.59%，高于流速20 L/h所得固形物得率5.58%以及流速為40 L/h固形物得率5.09%；同時30 L/h流速提取所得總糖提取率為39.11%，高于20 L/h流速所得總糖提取率37.17%以及40 L/h總糖得率30.39%（表5～表7）。結果表明，流速過高并不利于總糖的提取，當流速為30 L/h時，提取總糖效果最好，可能是因為流速過高會增加其他組分（如蛋白質）的溶出，對于多糖的溶解可能存在一定影響[15]。

表5 水提溶劑流速（20 L/h）對低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的影響Table 5 Influence of water extraction solvent flow rate (20 L/h) on low-temperature continuous phase change transition of active components of Ganoderma lucidum

表7 水提溶劑流速（40 L/h）對低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的影響Table 7 Influence of water extraction solvent flow rate (40 L/h) on low-temperature continuous phase change transition of active components of Ganoderma lucidum

水提溫度的優(yōu)化：以水提溫度為考察因素，總糖提取率為考察指標，考察不同水提取溫度對靈芝原料的固形物、總糖和總三萜得率的影響。對比三種不同提取溫度提取靈芝活性成分，發(fā)現當提取溫度為100 ℃時、水提總時間為5 h、流速為30 L/h以及解析溫度 78 ℃所得固形物得率為 5.59%、總糖得率為1.27%，總三萜得率為 0.32%，均為最高（表8）。水提溫度越高，多糖的提取效果越好，但是溫度太高，也有可能影響到靈芝活性物的生物活性[11]。

表8 水提溫度對低溫連續(xù)相變萃取靈芝總三萜的影響Table 8 Effect of water temperature on the extraction of total triterpenoids from Ganoderma lucidum by low-temperature continuous phase change transition

表6 水提溶劑流速（30 L/h）對低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的影響Table 6 Influence of water extraction solvent flow rate (30 L/h) on low-temperature continuous phase change transition of active components of Ganoderma lucidum

表11 醇提溫度對低溫連續(xù)相變萃取靈芝總三萜的影響Table 11 Effect of ethanol temperature on the extraction of total triterpenoids from Ganoderma lucidum by low-temperature continuous phase change transition

2.3 低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的醇提工藝優(yōu)化

2.3.1 醇提單因素實驗

醇提時間對靈芝活性成分提取效果的影響：由表9可知，每小時靈芝總三萜得率隨時間的延長逐漸減少，其中1 h總三萜得率最高，為0.37%，6 h開始總三萜得率（0.02%）明顯降低，前5 h三萜得率為0.69%，占9 h靈芝總三萜總得率（95.83%），表明在前5 h三萜得率較高，5 h之后醇提三萜得率較小。在一定時間內，靈芝總三萜的得率隨時間的延長而不斷增加，當擴散達到平衡后，靈芝細胞內外總三萜濃度達到動態(tài)平衡，所以隨著時間再延長，靈芝總三萜的提取率無明顯變化[16]。

表9 醇提時間對低溫連續(xù)相變萃取靈芝總三萜的影響Table 9 Effect of ethanol time on the extraction of total triterpenoids from Ganoderma lucidum by low-temperature continuous phase change transition

醇提濃度對靈芝活性成分提取效果的影響：由表10所示，隨著乙醇濃度的提高，其三萜得率不斷提高，用 95%乙醇進行提取，其三萜得率（0.34%）要明顯高于60%乙醇濃度提取三萜得率（0.15%）。楊德等[17]發(fā)現靈芝三萜類成分提取率與乙醇濃度呈正相關關系，所以高濃度的乙醇利于靈芝三萜的萃取。

表10 乙醇濃度對低溫連續(xù)相變萃取靈芝總三萜的影響Table 10 Effect of ethanol concentration on the extraction of total triterpenoids from Ganoderma lucidum by low-temperature continuous phase change transition

醇提溫度對靈芝活性成分提取效果的影響：由表11可知，隨著溫度的升高，靈芝總三萜得率不斷升高，當醇提溫度為 90 ℃時，靈芝總三萜得率為 0.67%，要明顯高于低溫度提?。?.38%）。隨著溫度的升高，乙醇的滲透能力增加，靈芝總三萜從細胞內向外的擴散能力增加，從而提高提取率[15]。但是過高的醇提溫度，需要更高的壓力，會增加設備的成本，不利于工業(yè)大生產。

2.3.2 回流提取正交實驗結果分析

從表12可以看出，實驗室進行回流提取靈芝三萜實驗，最佳提取條件為A2B1C2，即醇提溫度為85 ℃、醇提濃度為95%以及醇提時間4 h，其中各因素對結果影響主次順序為醇提濃度＞醇提溫度＞醇提時間。

表12 回流提取正交實驗及結果Table 12 Orthogonal experiment and results of reflux extraction

2.3.3 低溫連續(xù)相變醇提正交實驗結果分析

由低溫連續(xù)相變醇提正交實驗結果（表13）可得，最佳提取條件為A1B1C2，即提取溫度為90 ℃，乙醇濃度為95%以及提取時間為4 h，其中各因素對結果影響主次順序為醇提濃度＞醇提時間＞醇提溫度。

表13 低溫連續(xù)相變醇提正交實驗及結果Table 13 orthogonal experiment and results of ethanol extraction with low-temperature continuous phase change transition

對比實驗室回流提取，低溫連續(xù)相變萃取靈芝總三萜含量較高，其中低溫連續(xù)相變萃取工藝在溫度因素變化下，對靈芝總三萜得率影響較小，在考慮能耗的條件下，醇提最佳條件為低溫連續(xù)相變溫度85 ℃，乙醇濃度95%以及提取時間4 h。

2.3.4 低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝驗證

在正交水平設計所得的最優(yōu)醇提結果條件下，在車間進行 20 L釜低溫連續(xù)相變提取靈芝驗證正交實驗結果條件為：先進行水提，其水提總時間為5 h，水提流速為30 L/h，水提溫度為100 ℃。水提結束后，原料自然瀝，再注入 95%乙醇進行醇提，醇提溫度85 ℃，乙醇濃度95%，醇提時間4 h，醇提流速為28 L/h，所得實驗結果如表12所示，通過對比傳統(tǒng)工藝提取靈芝所得固形物、總糖、總三萜得率（表14）發(fā)現，優(yōu)化后的低溫連續(xù)相變萃取靈芝工藝固形物得率為7.56%，總糖得率為1.14%，總三萜得率為1.17%，比傳統(tǒng)水提靈芝工藝固形物、總糖和總三萜得率分別高15.60%、23.91%和333.33%。對比其他靈芝多糖提取方法，如超聲輔助萃取法（靈芝多糖得率2.78%）、酶解法（靈芝多糖得率4.41%）、微波輔助萃取法（靈芝多糖得率1.78%）以及超臨界萃取法（靈芝多糖得率 4.54%）等[15，18-20]，雖然連續(xù)低溫連續(xù)相變工藝提取靈芝總糖得率不及這些方法，但是超聲輔助萃取以及微波輔助萃取可能會對多糖結構造成破壞，酶解法受pH、溫度等因素影響較大，超臨界萃取法受限于設備制造成本。另一方面，對比其他靈芝三萜提取方法，如乙醇回流提取，氯仿回流提取等[16，21]，其三萜得率分別為0.69%和0.41%～0.93%，采用連續(xù)低溫連續(xù)相變工藝提取靈芝三萜得率為1.17%，明顯高于其他方法。同時這些方法均存在萃取后料液分離困難、萃取溶劑回收不便等問題，難以規(guī)?；a。采用低溫連續(xù)相變工藝提取靈芝活性成分，相比于傳統(tǒng)溶劑浸提法具有萃取率高、萃取時間短、溶劑回收方便、損失率低且粗提物無需過濾等優(yōu)點，適宜大批量工業(yè)化大生產。

表14 低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝驗證Table 14 Low-temperature continuous phase change transition process validation of active components of Ganoderma lucidum

2.4 低溫連續(xù)相變萃取工藝靈芝水提液總糖GPC分析

葡聚糖大分子量和小分子量對數log M與洗脫體積標準曲線分別為y=-0.5739x+14.208，R2=0.9906和y=-0.4075x+11.549，R2=0.9998，可用于分析計算樣品的總糖分子量分布。

對比不同工藝的水提液上樣測定GPC譜圖（圖1）和峰面積（表15），發(fā)現低溫連續(xù)相變萃取工藝提取靈芝活性成分的各分子量的總糖含量明顯高于傳統(tǒng)水提工藝，且低溫連續(xù)相變萃取工藝比傳統(tǒng)水提工藝提取靈芝活性成分所得總糖多出組分2和組分5（分子量分別約為614529 u和1000 u）。不同靈芝多糖的組成和結構與其免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等重要的生物學活性密切相關[22]。

表15 不同組分分子量段及峰面積Table 15 Molecular weight segment and peak area of different components

2.5 低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝水提液不同提取時間分子量段占比分析

分小時對低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝水提液取樣，通過 GPC測定各分子量段，發(fā)現組分 1（＞3000000 u）、組分 2（614529 u）和組分 3（6812 u），隨著提取時間的增加，其峰面積占比逐漸增加；組分4（2165 u），隨著提取時間的增加，其峰面積占比增加后減??；組分5（1043 u）以及＜500 u的組分，隨著提取時間的增加，其峰面積占比逐漸減小（圖2）。結果表明在低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的水提液中，小分子組分的溶出時間先于比大分子組分的溶出時間。

3 結論

3.1 本研究以赤靈芝為原料，通過單因素試驗和正交試驗設計，確定低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分的最佳工藝條件。實驗結果表明，低溫連續(xù)相變水提靈芝活性的成分的最佳條件為：水提提取溫度為100 ℃、解析溫度為78 ℃、水提溶劑流速為30 L/h以及水提總時間為5 h；水提結束后進行醇提，各因素對靈芝總三萜提取影響程度的大小順序為醇提濃度＞醇提時間＞醇提溫度，最佳工藝條件為醇提提取溫度為85 ℃，解析溫度68 ℃，醇提溶劑流速為28 L/h以及醇提總時間為4 h。經驗證，在該最佳工藝條件下，低溫連續(xù)相變萃取靈芝固形物得率為 7.56%，總糖得率為1.14%，總三萜得率為1.17%，比傳統(tǒng)工藝提取靈芝固形物、總糖和總三萜得率分別高 15.60%、23.91%和333.33%。采用低溫連續(xù)相變工藝提取靈芝活性成分，具有萃取率高、萃取時間短、溶劑回收方便、損失率低且粗提物無需過濾等優(yōu)點，且一套設備解決了對靈芝水溶性成分（靈芝總糖）和脂溶性活性成分（總三萜）的綜合利用，大大提高了生產效率，該工藝在工業(yè)化大生產應用方面具有廣闊的前景。

3.2 通過GPC分析不同提取工藝水提液中總糖的分子量分布及新工藝不同時間段總糖組分的分子量段占比，發(fā)現低溫連續(xù)相變萃取靈芝活性成分工藝比傳統(tǒng)工藝所提取的總糖組分要多出組分2和組分5。不同靈芝多糖的組成和結構與其生物學活性密切相關，故低溫連續(xù)相變萃取靈芝所得各水提液組分的化學成分和生物學功能（如免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等）有待進一步研究。