劉文軒，羅欣，楊嘯吟，張一敏，朱立賢，毛衍偉，梁榮蓉*，馬偉民，楊振剛

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）（2.君博食品有限公司，山東 臨清 252600）（3.陽信億利源清真肉類有限公司，山東 陽信 251800）

隨著近年來我國人民水平的提高，尤其是中產(chǎn)階級群體的不斷壯大，我國牛肉消費量逐漸增大，在消費量不斷增長的同時，消費者日趨關(guān)注牛肉品質(zhì)。雪花牛排因具有良好的外觀、口感以及營養(yǎng)價值高而深受消費者喜愛。在眾多品質(zhì)指標（包括肉色、嫩和風味等）中，肉色是影響消費者購買與否的重要指標，消費者往往以肉色作為肉制品新鮮與否的重要指標[1]。消費者通常認為肉色為明亮的櫻桃紅色或者真空包裝的紫紅色表示肉制品新鮮可放心食用[2]。為使雪花牛肉貯藏期間呈現(xiàn)良好的肉色，許多廠家采用高氧氣調(diào)包裝（High oxygen modified atmosphere packaging，HiOx-MAP，80% O2/ 20%CO2）對其包裝貯藏。該條件下的高濃度氧氣可以與肉中的肌紅蛋白結(jié)合，使肌紅蛋白大部分以氧合肌紅蛋白（Oxymyoglobin，OMb）的形式存在，使肉呈現(xiàn)明亮的櫻桃紅色，從而延長其肉色貨架期[3]。但是，研究發(fā)現(xiàn)HiOx-MAP能夠促進牛排展銷期間的脂肪氧化[4]。而肉在貯藏過程中的脂肪氧化會產(chǎn)生一些初級和次級代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物能促進肌紅蛋白的氧化，從而導(dǎo)致肉色穩(wěn)定性變差，最終導(dǎo)致肉色的褐變[5]。而與普通牛肉相比，雪花牛肉含有較高的肌內(nèi)脂肪，高氧條件下，脂質(zhì)氧化會比普通牛肉更加劇烈[6]，這可能會加劇肌紅蛋白的氧化和雪花牛肉肉色的劣變，這對雪花牛肉的貯藏是不利的。

因此，為探究HiOx-MAP條件對雪花牛肉貯藏期間肉色穩(wěn)定性的影響和該條件下的肉色貨架期，本研究以兩種不同脂肪含量的育肥牛肉（A1等級和A3等級）為研究對象，探究育肥牛肉在HiOx-MAP條件下的脂質(zhì)氧化程度及其對肉色和肉色穩(wěn)定性的影響，為HiOx-MAP在育肥牛肉包裝中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在山東某肉牛屠宰場，選取一批統(tǒng)一飼養(yǎng)的飼養(yǎng)、體重相似、21月齡的安和雜交牛，宰前集中育肥6個月后屠宰。宰后在0~4 ℃排酸72 h后分割，按照日本牛肉分級標準進行分級，分別選取 A1等級和A3等級的左半胴體背最長肌各6條（n=6）作為實驗樣品，真空熱縮包裝后在保溫箱中（0~4 ℃）3 h內(nèi)運回實驗室。背最長肌修整后，分割為2.54 cm的牛排，分別進行HiOx-MAP包裝后，在0~4 ℃黑暗環(huán)境中貯藏0、5和10 d。在每個時間點，檢測生鮮牛排 pH值、肉色指標、不同狀態(tài)肌紅蛋白的比例、總還原力（The total reducing activity，TRA）和脂質(zhì)氧化水平等指標。

包裝材料：氧氣阻隔膜（Lid 1050；Sealed Air Corp），氣調(diào)包裝盒（TQBC-0775；SealedAir Corp），聚乙烯薄膜（水蒸氣透過率：23.5 g/(m2·24 h)，氧氣透過率：16654 cm3/(m2·24 h·atm)，二氧化碳透過率：64637 cm3/(m2·24 h·atm)。

1.2 儀器與設(shè)備

DT-6D氣調(diào)包裝機，大江機械設(shè)備有限公司；VORTEX1渦旋振蕩器，上海漢諾儀器有限公司；SenvenGo pH計，Mettler Toledo公司；SP62便攜式積分球分光光度儀，X-Rite公司；T18高速分散機，IKA公司；BioTek Epoch2酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YP10002電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；ST-255脂肪測定儀，F(xiàn)OSS公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Distillation Unit K-355凱氏定氮儀，BUCHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH值的測定

參考Chen[7]的方法，在每個貯藏時間點，使用校正率為95%以上的pH計測定牛排的pH值，每塊牛排測定6個點，取其平均值。

1.3.2 水分含量的測定

參照 GB 5009.3-2016[8]中的直接干燥法進行水分含量的測定。

1.3.3 脂肪含量的測定

參照國標 GB 5009.6-2016[9]中索氏提取法進行測定。

1.3.4 蛋白含量的測定

參照國標GB 5009.5-2016[10]凱氏定氮法進行測定。

1.3.5 肉色指標和R630/580的測定

使用 SP62便攜式積分球色差計測定牛排表面的肉色指標（L*值、a*值、b*值、C*值和H*值），注意避開筋腱和脂肪組織。在貯藏0 d時，需進行30 min發(fā)色后測定，5 d和10 d打開包裝后直接測定。每塊牛排隨機測六個點，取其平均值。在測定時，同時讀取生肉餅在580 nm和630 nm的反射率，計算630 nm與580 nm的比值為R630/580值。其中：

1.3.6 不同狀態(tài)肌紅蛋白比例的測定

使用 SP62便攜式積分球色差計分別測定波長為473 nm、525 nm、572 nm和700 nm處的反射率，計算生鮮牛排中高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MMb）、脫氧肌紅蛋白（Deoxymyoglobin，DMb）和OMb的比例，其計算公式如下：

1.3.7 肌紅蛋白總還原力（TRA）的測定

根據(jù)王芳芳[11]的方法并作相應(yīng)修改，取1 g肉樣切碎，加入5 mL pH為5.8濃度為25 mmol/L的PIPES緩沖液后，使其在冷凍研磨儀在4 ℃破碎均勻。取5 mL均質(zhì)液于10 mL容量瓶中，加入2 mL 5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后放入4 ℃生化培養(yǎng)箱中1 h，其中每隔10 min攪拌一次，使其混勻。孵育完成后，加入0.1 mL 0.5%的氨基磺酸銨和0.2 mL 0.5 mol/L的醋酸鉛，在室溫下放置5 min后，加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，用蒸餾水補足至10 mL，室溫下放置5 min后，用Whatman 42#濾紙過濾，取濾液在420 nm下測定其吸光度。

TRA=1 mmol/L鐵氰化鉀的吸光度-樣品吸光度

1.3.8 脂肪氧化值（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的測定

根據(jù)Yang等[6]的方法稍作修改，在每個貯藏時間點，從生肉餅中隨機稱取4 g肉樣，剔除筋腱和表面脂肪，加入20 mL蒸餾水后插入冰盒中，用均質(zhì)機14000 r/min均質(zhì)1 min。隨后在均質(zhì)液中加入16 mL 10%三氯乙酸，用玻璃棒攪拌均勻后使用Whatman 1#濾紙過濾。取4 mL濾液于離心管中，加入1 mL硫代巴比妥酸溶液，渦旋30 s使其混合均勻。混勻后將離心管80 ℃水浴90 min后取出，冷卻至室溫后，使用酶標儀測定 532 nm處的吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標準品做標準曲線計算TBARS值，最終結(jié)果表示為mg MDA/kg樣品。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用SAS 9.0混合模型進行分析，以貯藏時間、大理石花紋等級以及它們的交互作用為固定因素，牛為隨機因子，進行各個指標的方差分析，p<0.05為差異水平顯著，根據(jù)顯著性用 Sigmaplot 12.5進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種等級育肥牛排的化學(xué)組分

由表1可以看出，兩種等級的牛排蛋白質(zhì)含量差異不顯著（p>0.05），但是A1和A3等級的牛排脂肪含量和水分含量差異顯著（p<0.05）。A3等級的肌內(nèi)脂肪含量為15.81%，顯著高于A1等級，而水分含量為59.52%，顯著低于A1等級。兩者脂肪含量與水分含量的總和差異不顯著（p>0.05）。這是由于雪花牛肉的脂肪沉積于肌纖維之間，部分取代了肌纖維之間的水分，導(dǎo)致肌肉中水分降低[12,13]。這與董璦榕等人[14]的研究結(jié)果一致。他們也發(fā)現(xiàn)，在育肥牛肉中水分含量與脂肪含量之和基本恒定。因此，本研究選用的兩個等級的牛排肌內(nèi)脂肪含量存在顯著差異，可以用于本研究。

表1 兩種等級牛排的化學(xué)組分Table 1 The chemical composition of steaks from two different marbling grades

2.2 不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間包裝盒頂隙空間氣體成分的變化

由于肌肉組織的呼吸作用，氣調(diào)包裝中的氣體成分并不是一成不變的，微生物繁殖以及包裝膜的滲透，都會導(dǎo)致頂隙空間氣體成分發(fā)生變化[15]。如表3所示，貯藏時間和等級的交互作用對頂隙空間O2含量和CO2含量影響不顯著（p>0.05），僅貯藏時間對O2含量有主效應(yīng)（p<0.05），隨著貯藏時間的延長，O2含量顯著下降，但貯藏至10 d時，氧氣含量仍然在77%。CO2含量在各處理組中保持穩(wěn)定。這與楊嘯吟[16]的結(jié)果一致，O2含量的降低是由肌肉組織的呼吸作用以及肉制品自身氧化耗氧導(dǎo)致的。

表2 兩種不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間包裝盒內(nèi)頂隙空間氣體成分分析Table 2 Variation of gas composition in the package of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

表3 兩種不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間pH值的變化Table 3 Variation of pH values of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

2.3 兩種等級牛排 HiOx-MAP貯藏期間 pH值的變化

pH值是影響肉色的重要因素，排酸24 h后，較高的pH會形成肉色發(fā)暗的DFD（dark，firm and dry）異質(zhì)肉。表3顯示，貯藏時間和等級的交互作用對pH值影響不顯著（p>0.05），但貯藏時間對其影響顯著（p<0.05），隨著貯藏時間的延長，pH值顯著升高，但始終在正常范圍 5.4~5.6之間。Yuan等人[17]以牛背最長肌、半膜肌為研究對象，探究了4 ℃條件下，pH值隨著貯藏時間的變化情況，他們也發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，4 ℃條件下的pH值顯著升高（p<0.05）。牛肉因其含有豐富的蛋白質(zhì)，在貯藏期間易發(fā)生微生物污染，微生物對蛋白質(zhì)的代謝，會產(chǎn)生游離氨基酸、胺類等堿性物質(zhì)，導(dǎo)致pH值的升高[18]。

2.4 不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間肉色的變化

a*值表示肉樣的紅度值，a*值越大，表示肉色越鮮紅。貯藏時間和等級的交互作用對a*值影響顯著（p<0.05）。隨著貯藏時間的延長，兩種牛排的a*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這是由于在貯藏初期，HiOx環(huán)境下有利于OMb的形成，而OMb呈現(xiàn)明亮的櫻桃紅色[19,20]，使牛排a*值呈上升趨勢。隨著貯藏時間的延長，OMb長期處于高濃度氧的情況下，被氧化為MMb，使MMb逐漸積累，最后使肉色呈現(xiàn)不良的棕褐色。在貯藏初期，兩種等級的牛排a*值差異不顯著，隨著貯藏時間的延長，A3牛排的a*值顯著低于A1，貯藏至10 d時，A1牛排的a*值僅下降至17.43，而A3牛排的a*值卻下降至12.22，已經(jīng)低于消費者對生鮮肉肉色的可接受閾值，a*值>14.5[21]。這說明高脂肪含量的雪花牛排，在HiOx-MAP下更容易發(fā)生氧化，肉色褐變程度越大。Wang等人[22]得出了與我們相似的結(jié)論，認為a*值與脂肪氧化值呈顯著負相關(guān)，隨著脂質(zhì)氧化程度的增大，a*值顯著降低。

圖2所展示的肉色變化趨勢與a*值變化趨勢一致。圖2顯示，在前5 d貯藏期內(nèi)，兩個等級的牛排肉色均呈現(xiàn)鮮紅色，是消費者喜歡的色澤；在貯藏10 d時，兩個等級的牛排肉色均出現(xiàn)劣變趨勢，但是A3等級的肉色劣變顯著快于A1等級，A3等級已經(jīng)出現(xiàn)肉眼可見的明顯褐色，而 A1等級的肉色仍為可接受的鮮紅色。因此，高氧氣調(diào)包裝條件下A3等級的牛排貯藏至10 d時可能會導(dǎo)致消費者接受度降低，而A1等級的牛排仍可被接受。

L*值表示肉樣的亮度值。貯藏時間和等級的交互作用對L*值影響不顯著（p>0.05，表4），只有貯藏時間對其影響顯著（p<0.05）。隨著貯藏時間的延長，L*值顯著升高。Esmer等人[23]的研究也表明，L*值受貯藏時間影響顯著。生鮮肉貯藏至5 d時，L*值顯著升高（p<0.05），貯藏至10 d時，L*值依然保持上升的趨勢，但此時肉色已經(jīng)變暗。楊嘯吟等[24]的研究也得出了相同的結(jié)論，HiOx-MAP條件下，牛排的L*值在0~10 d內(nèi)顯著升高，而a*值從5 d開始顯著下降。這可能是由于牛排汁液滲出較多，表面水分增加了光的反射率導(dǎo)致L*值升高[25]。

表4 兩種不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間L*值，b*值，C*值，H*值和R630/580值的變化Table 4 Variation of L*， b*， C*， H* and R630/580 values of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

b*值表示肉樣的黃度值。如表4所示，貯藏時間和等級因素交互作用對b*值影響不顯著（p>0.05，表4），但貯藏時間對其影響顯著（p<0.05）。如表4所示，隨著貯藏時間的延長，生鮮肉的b*值與a*值呈現(xiàn)相同的變化趨勢。有人認為，b*值與a*值呈正相關(guān)，并且b*值與MMb的含量呈負相關(guān)，b*值的降低代表著 MMb的生成[23,26]。由此可以看出，兩種牛排在前5 d時能夠保持良好的肉色，而貯藏至10 d時，肉色發(fā)生劣變。

C*值用來表示色彩飽和度，C*值越大，表示肉色的色彩飽和度越高，說明肉色越鮮紅。貯藏時間和等級兩因素交互作用對C*值影響顯著（p<0.05），生鮮肉的C*值變化趨勢與a*值相同。隨著貯藏時間的延長，兩種等級牛排的C*值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在貯藏至10 d時，A3等級牛排C*值降低更顯著。這也說明了這兩種牛排在HiOx-MAP中只能在較短時間保持鮮紅的肉色，隨著貯藏時間的增加，肉色都會劣變，但脂肪含量更高的 A3等級牛排劣變程度更大。

H*值用來表示肉色的變化情況，H*值越接近于0，表示肉色越鮮紅，越接近于 90，表示肉色越褐變[27]。貯藏時間和等級對生鮮肉H*值影響顯著（p<0.05）。在貯藏前期，生鮮肉的H*值變化趨勢不明顯并且兩種等級牛排之間差異不顯著，貯藏至10 d時，兩種等級牛排的H*值顯著增加并且A3等級牛排顯著高于A1等級牛排。這表明在貯藏后期，兩種等級牛排都積累了大量 MMb導(dǎo)致肉色劣變，而A3等級牛排肉色劣變程度更大。

R630/580值可以用來間接表示生鮮肉中 MMb所占的比例。R630/580值越低，MMb所占的比例越高，消費者的可接受程度越低。由表4可知，貯藏時間和等級對R630/580值影響顯著（p<0.05）。兩種等級生鮮牛排的 R630/580值均隨貯藏時間的延長而降低，貯藏至10 d時，A3牛排的R630/580值顯著低于A1，并且低于消費者對于生鮮肉的接受閾值（R630/580>3）[11]。這說明 A3等級的牛排在貯藏后期，MMb開始大量積累，造成肉色的劣變，這與圖1中的a*值的變化規(guī)律一致。

2.5 不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間TRA的變化

肌紅蛋白TRA對肉色穩(wěn)定性具有中要的作用。貯藏時間和等級的交互作用對 TRA影響不顯著（p>0.05），但二者分別其有主效應(yīng)（p<0.05）。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，兩種牛排的TRA顯著下降，且在整個貯藏期間，A3牛排的TRA顯著低于 A1。TRA的下降不利于肌紅蛋白的穩(wěn)定，會導(dǎo)致 MMb的積累，從而導(dǎo)生鮮肉色劣變現(xiàn)象的發(fā)生。因此，在貯藏至10 d，兩種等級的生鮮牛排肉色顯著下降，且 A3等級牛排的下降速率更大。有學(xué)者研究了TRA與a*值的關(guān)系，結(jié)果表明，TRA的提高有利于生鮮肉a*值的提高[28]。整體來看，A1牛排的TRA顯著高于A3牛排，所以，較高的脂肪含量不利于肌紅蛋白TRA的維持，這是導(dǎo)致A3級牛排肉色劣變速率較快的原因。

2.6 不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間不同狀態(tài)的肌紅蛋白比例的變化

肌肉中的肌紅蛋白比例對肉色起到了至關(guān)重要的作用。肌紅蛋白是一種單體血紅素蛋白，動物屠宰放血后，肌紅蛋白狀態(tài)對肉色起決定性作用[29]。如表5所示，貯藏時間和等級的交互作用對MMb%影響顯著（p<0.05）。整體來看，A3牛排的MMb%顯著高于 A1牛排，貯藏前期兩種牛排之間無顯著差異，但是在貯藏至10 d時，A3牛排的MMb%顯著高于A1牛排，且A3牛排的MMb%已超過40%，導(dǎo)致 A3牛排此時出現(xiàn)了顯著的肉色劣變。Greene等[30]的研究表明，當MMb含量超過40%時，肉色就不會被消費者接受。MMb%與脂質(zhì)氧化程度有關(guān)，Zakrys等[31]認為，脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的不飽和醛（如4-羥基壬烯醛），能夠促進肌紅蛋白向MMb的轉(zhuǎn)化。隨著貯藏時間的延長，兩個等級牛排的MMb%顯著升高。這與圖1的結(jié)果基本一致。

表5 兩種不同等級牛排HiOx-MAP貯藏期間不同狀態(tài)肌紅蛋白比例的變化Table 5 Variation of the ratio of different myoglobin forms of steaks from two different marbling grades of steaks stored under HiOx-MAP

貯藏時間和等級的交互作用對OMb%影響顯著（p<0.05）。隨著貯藏時間的延長，OMb%顯著降低，這是因為長期暴露在高濃度氧氣的環(huán)境中，OMb部分被氧化為MMb，導(dǎo)致MMb的積累，使肉色由明亮的櫻桃紅色變成棕褐色。在整個貯藏期間，A3牛排中的OMb%下降速率大于A1。這說明A3牛排中，OMb向MMb轉(zhuǎn)化的速率更快。在整個貯藏期間，脂肪含量較低的A1牛排OMb%降低了7.75%，而脂肪含量較低的A3牛排21.48%，顯著大于A1。OMb%的降低趨勢與a*值的降低趨勢和 MMb%的增加趨勢相一致。

貯藏時間和等級的交互作用對DMb%影響不顯著（p>0.05），但等級對其影響顯著（p<0.05）。雖然兩個等級的牛排中，DMb%均不高，但 A1牛排的DMb%顯著高于A3牛排，這說明脂肪含量較低的 A1牛肉能保持較高的肌紅蛋白還原狀態(tài)，這有利于維持牛排貯藏期間的肉色穩(wěn)定性。

2.7 不同等級牛排 HiOx-MAP貯藏期間TBARS值的變化

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂肪氧化產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，以 MDA產(chǎn)生的毫克當量數(shù)來表征 TBARS值和脂質(zhì)氧化程度。有研究表明，當包裝體系中的O2含量超過21%時，就容易發(fā)生脂肪氧化，產(chǎn)生 MDA[15]。由圖5可以看出，貯藏時間和等級的交互作用對 TBARS值影響顯著（p<0.05），隨著貯藏時間的延長，兩種牛排中MDA含量顯著增大，說明兩種等級的牛排脂肪氧化程度顯著增大（p<0.05）。在貯藏10 d時，A3牛排脂肪氧化程度顯著高于A1（p<0.05）。這說明兩個等級間由于脂肪含量的不同造成了兩個等級牛肉之間顯著的脂質(zhì)氧化程度差異。而研究表明，脂肪氧化程度越高，肉色穩(wěn)定性越差[32]。Fourati等[33]認為脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的化合物與蛋白氧化具有較強的相關(guān)性。由此我們可以推測，隨著脂質(zhì)氧化程度的增大，肌紅蛋白氧化程度顯著增大，從而加速了雪花牛肉的褐變。Wang等[34]以兔肉為研究對象探究MDA對肌紅蛋白的影響，結(jié)果表明，MDA能夠促進MMb的形成。由此可以看出，脂肪氧化能夠通過增加MMb的含量導(dǎo)致生鮮牛排的失色褐變。這是導(dǎo)致本研究中，A3級牛肉肉色穩(wěn)定性差于A1等級的重要原因。

3 結(jié)論

育肥牛肉大理石花紋等級越高，其在高氧氣調(diào)包裝下的脂質(zhì)氧化程度越大，降低了高鐵肌紅蛋白總還原力，促進了肌紅蛋白的氧化和高鐵肌紅蛋白的積累，加快了HiOx-MAP貯藏期間肉色的劣變。在HiOx-MAP中，隨著貯藏時間的延長，兩種等級牛排的肉色穩(wěn)定性逐漸降低，在貯藏后期，高脂肪含量的A3的a*值顯著下降，肉色劣變嚴重，而A1能保持相對良好的肉色。基于該研究結(jié)果，我們認為，HiOx-MAP中，脂肪含量較低的A1等級的牛排在 10 d內(nèi)能保持良好的肉色，而脂肪含量高的A3等級牛排只能進行短時間的貯藏。因此，我們建議脂肪含量較高的高檔雪花牛肉若在較短時間（5 d內(nèi)）貯藏可以采用HiOx-MAP來保持鮮紅的肉色，但是，若需要長時間貯藏，應(yīng)選用無氧包裝方式，避免脂質(zhì)氧化造成的肉色劣變。