趙毅杰， 蘇儉生

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海 200072）

口腔和頭頸部癌癥的治療方法通常為手術(shù)結(jié)合放療或化療[1]。 手術(shù)切除口腔腫瘤往往會造成口腔內(nèi)缺損， 嚴(yán)重影響患者的口腔功能及生活質(zhì)量[2]。因鈦?zhàn)鳛榉氰F磁性材料具有良好的生物相容性、耐腐蝕性[3]，有足夠的強(qiáng)度能夠保持面部輪廓穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)， 使其在頜面部手術(shù)重建中得到廣泛應(yīng)用，成為了一種良好的假體基礎(chǔ)材料。 但純鈦由于其生物惰性，不利于其與肌肉組織之間形成快速結(jié)合，導(dǎo)致術(shù)后假體附著的肌肉生長不良， 造成肌肉萎縮，致使患者預(yù)后不良，影響了局部的美觀和功能[2]。 與傳統(tǒng)鈦假體表面相比，具有微觀結(jié)構(gòu)的表面能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和黏附。 細(xì)胞外基質(zhì)在納米尺度上刺激細(xì)胞并與之相互作用。 為了能夠形成更多的微米甚至納米級別的表面形態(tài)， 相關(guān)研究應(yīng)用噴砂、化學(xué)、物理改性處理及TiO2納米管陣列等方式來更好地促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖[4-7]。

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，陽極氧化鈦襯底上的TiO2納米管表面具有良好的邊界和結(jié)構(gòu)堅(jiān)固的形貌，在陽極氧化過程中，通過改變電壓和電解液可以獲得不同的孔徑和高度[8-10]。 Oh 等[11]發(fā)現(xiàn)TiO2納米管對成骨作用具有良好的效果，但目前TiO2納米管對成肌的效果卻鮮有報道。 本研究選擇了10、15、20 V 3 種電壓，通過陽極氧化方法形成不同管徑的TiO2納米管，觀察其對C2C12 成肌細(xì)胞的伸展、增殖及分化的影響，以篩選出最適管徑的TiO2納米管。

1 材料和方法

1.1 純鈦片預(yù)處理

取圓型TA2 純鈦片（Φ14 mm，厚1 mm；寶雞鈦業(yè)股份有限公司，中國），用碳化硅砂紙逐級將其拋光至1000 目，隨后依次用丙酮、無水乙醇和去離子水清洗15 min，干燥，用高壓蒸汽機(jī)滅菌后備用，用PT（pure titanium）標(biāo)示。

1.2 TiO2 納米管制備

室溫環(huán)境下，以鈦片作為陽極、鉑片作為陰極，在0.1%HF（hydrofluoric acid；國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）電解液中，分別將電壓調(diào)至10、15 和20 V， 反應(yīng)20 min， 反應(yīng)后的3 組樣品分別用TNT10、TNT15 和TNT20 標(biāo)示， 用無水乙醇和去離子水分別清洗20 s， 用高壓蒸汽機(jī)滅菌后備用，并用掃描電鏡（SEM）（型號：SU8010；Hitachi 公司，日本）測得最后管徑。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和1%青、鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國）培養(yǎng)小鼠C2C12 成肌細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司，中國），將其放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至80%時進(jìn)行傳代，取第3 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)

將樣品放置于細(xì)胞接種同細(xì)胞增殖，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后， 每組任選3 個樣品， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 清洗3 遍后用2.5%戊二醛固定，將其置于4 ℃的冰箱中2 h，用PBS 洗滌3 次，分別用30%、50%、70%、85%、90%的乙醇梯度脫水各1 次，用100%乙醇脫水3 次，每次10 min，用臨界點(diǎn)干燥法干燥后噴金，用SEM 觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 細(xì)胞增殖

將各組樣本經(jīng)過鈷60（25 kGy）輻照法消毒后，放入24 孔板內(nèi)， 每組設(shè)置3 個平行孔。 將培養(yǎng)的C2C12 成肌細(xì)胞按照5×103個/孔的密度分別接種于樣本表面。將C2C12 成肌細(xì)胞培養(yǎng)至1、3、5、7 d 4 個時間點(diǎn)， 在每個時間點(diǎn)時使用CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）檢測，到達(dá)相應(yīng)的時間點(diǎn)后，吸出培養(yǎng)基，加入500 μL 普通培養(yǎng)基，隨后加入50 μL 的CCK-8 溶液，將其避光放入培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h。 隨后吸出100 μL 培養(yǎng)液放入96 孔板內(nèi)，重復(fù)3 次，全程避光。最后應(yīng)用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm 處的吸光度值。

1.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析

C2C12 成肌細(xì)胞接種3、7 d 后， 用TRIzol（TaKaRa Bio Inc 公司，日本）法提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Bio Inc 公司，日本）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 隨后，通過羅氏Light Cycler480 檢測儀檢測Myh3、Myod1、Myog 的基因表達(dá)水平（表1）。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 2 組之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，對2 組及以上的比較進(jìn)行單因素方差分析，若P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同管徑TiO2 納米管表征結(jié)果

SEM 結(jié)果（圖1）顯示，純鈦片經(jīng)過拋光后可見拋光劃痕，但無特殊的形貌結(jié)構(gòu)。 經(jīng)過不同電壓下陽極氧化處理后的TiO2納米管顯示出了均勻的管狀納米結(jié)構(gòu)，各管壁獨(dú)立，管間無明顯界限。 隨著電壓的增大，TNT 組管徑也隨之增大。陽極氧化10、15、20 V 電壓對應(yīng)的管徑分別為25、50、100 nm。

圖1 各組樣品的SEM 表面形貌Figure 1 SEM images of the surface morphology of TiO2 samples in different groups

2.2 C2C12 成肌細(xì)胞增殖結(jié)果

CCK-8 檢測結(jié)果（圖2） 可直接反映5 d 和7 d時，TNT 各組的吸光度值均高于PT 組，表明這種納米管結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的生長和增殖。 此外，TNT組間的吸光度值也不同，說明不同管徑的納米管對細(xì)胞的影響也不同。TNT15 組對于C2C12 細(xì)胞增殖的效果最佳， 與PT 組具有顯著差異 （P＜0.01）。TNT20 組相較于TNT15 組，細(xì)胞增殖的數(shù)量有了明顯的下降趨勢（P＜0.01）。

圖2 C2C12 成肌細(xì)胞在不同組表面培養(yǎng)1、3、5、7 d 的CCK-8結(jié)果Figure 2 CCK-8 results of C2C12 myoblasts cultured on the surfaces of different groups for 1, 3, 5 and 7 days

2.3 C2C12 成肌細(xì)胞形態(tài)

SEM 結(jié)果（圖3）顯示，24 h 鋪板后，每組樣品的C2C12 成肌細(xì)胞均成功黏附，PT 組C2C12 成肌細(xì)胞鋪展不明顯。由于TiO2納米管增加了表面粗糙度，增加了親水性，展現(xiàn)出對于細(xì)胞更好的黏附效果， 所以TNT15 組和TNT20 組伸展出更多的偽足和偽板。

圖3 C2C12 成肌細(xì)胞在各組樣品表面培養(yǎng)24 h 后的細(xì)胞形態(tài)（×500）Figure 3 Morphology of C2C12 myoblasts cultured on the surfaces of differnet groups after 24 hours（×500）

2.4 成肌基因表達(dá)的檢測

Myog、Myh3 和Myod1 這3 個基因是調(diào)節(jié)成肌分化的重要基因。在細(xì)胞鋪板3 d（圖4A—C）和7 d（圖4D—F）后，TNT 各組中，除TNT20 組在7 d 時，其余各組在3 個基因中的表達(dá)高于PT 組， 其中TNT15 組的表達(dá)顯著高于其他組。 在培養(yǎng)3 d 時，TNT20 組Myog 和Myh3 這2 個基因的分化表達(dá)高于TNT10 組；TNT10 組 中，Myod1 的 表 達(dá) 高 于TNT20 組。 在培養(yǎng)7 d 時，當(dāng)管徑小于50 nm 時，隨著管徑的增大，促進(jìn)了成肌的分化，這與之前的增殖結(jié)果相一致，而TNT20 組展現(xiàn)出了對成肌分化的相對抑制作用， 在TNT10 組中，3 個基因的表達(dá)均高于TNT20 組。 小孔徑TiO2納米管這樣的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其良好的親水性能增加細(xì)胞的前期黏附作用，轉(zhuǎn)化為機(jī)械信號，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和分化。

圖4 C2C12 成肌細(xì)胞在不同樣品表面培養(yǎng)3、7 d 后，Myog、Myh3、Myod1 基因檢測水平結(jié)果Figure 4 Gene expression levels of Myog, Myh3 and Myod1 in the C2C12 myoblasts cultured on different samples for 3 and 7 days

3 討論

在口腔頜面部整復(fù)手術(shù)中，以鈦為基礎(chǔ)材料的假體應(yīng)用十分廣泛。 在支撐起面部輪廓的同時，手術(shù)后形成肌肉萎縮的問題依然沒有得到解決[2]。 隨著近年來生物材料學(xué)的不斷發(fā)展，材料表面的改性得到了越來越多的關(guān)注。

細(xì)胞外基質(zhì)具有納米級的復(fù)雜特征，它能在納米尺度上刺激細(xì)胞并與之相互作用[12]。有學(xué)者的研究顯示， 人造的納米結(jié)構(gòu)能夠起到類似細(xì)胞外基質(zhì)的作用，影響細(xì)胞的生理學(xué)，人造的納米結(jié)構(gòu)能夠影響細(xì)胞的黏附、增殖和分化[13-15]，這樣的制造技術(shù)已經(jīng)能夠精確控制人造表面上的納米結(jié)構(gòu)。Wu 等[12]利用陽極氧化的技術(shù)在鈦表面形成納米管結(jié)構(gòu)，并將該技術(shù)用在骨再生實(shí)驗(yàn)中，以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的增殖和分化。 TiO2納米管表面具有良好的邊界和堅(jiān)固的表面形態(tài)，能夠自組裝、高度有序而且垂直排列。 噴砂、化學(xué)蝕刻等表面改性的方法相比較于TiO2納米管，不能夠產(chǎn)生宏觀和微觀上的均勻性[14]。

因此，我們選擇了TiO2納米管這種表面改性的方式，在體外研究其不同孔徑對于C2C12 小鼠成肌細(xì)胞的生理性影響， 并篩選出一個最佳管徑促進(jìn)C2C12 細(xì)胞的增殖分化。 通過SEM 圖像顯示納米管， 系統(tǒng)展現(xiàn)了這類納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有更清晰、可重復(fù)和可靠性更高的粗糙度。 基于陽極氧化形成納米管的機(jī)制，我們通過改變電壓的強(qiáng)度，形成了不同管徑的納米管，隨著電壓的增大，管徑也隨之增加。納米管系統(tǒng)具有良好的親水性[16]，能夠促進(jìn)細(xì)胞在其表面的黏附，本研究展現(xiàn)出了同樣的結(jié)果。 各TiO2納米管組均有效促進(jìn)了細(xì)胞的偽板和偽足的產(chǎn)生。 Wang 等[17]的研究顯示，隨著納米管管徑的增大，成骨的生化活性也隨之增大。 在細(xì)胞水平上，細(xì)胞整合素和納米管表面黏附點(diǎn)的橫向距離有關(guān)，孔徑的增大改變了跨膜整合素的位置和間距[18]。 黏附細(xì)胞的力通過整合素向細(xì)胞骨架傳遞，所以我們發(fā)現(xiàn)在TNT15 和TNT20 這2 組中，細(xì)胞的黏附更好。研究表明， 15～30 nm 的管徑為BMSCs 整合素聚集的最佳距離[19-20]，當(dāng)管徑達(dá)到100 nm 時會發(fā)生細(xì)胞凋亡。 在成肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)管徑為50 nm 時，成肌細(xì)胞的增殖與分化最好；當(dāng)管徑達(dá)到100 nm 時，增殖與分化的效果反而下降，與成骨研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似[13-19]。

綜上，50 nm 管徑的TiO2納米管能更好地促進(jìn)小鼠C2C12 細(xì)胞的增殖、黏附、鋪展和分化，這部分的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也為今后體內(nèi)研究打下了基礎(chǔ)，并為未來口腔頜面部肌肉組織工程學(xué)提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。