張 帥， 扈梓悅， 牛萍萍， 孫 瑤

（上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

由于現代人精細飲食的增加， 咀嚼頻率及進食時間的減少導致頜骨咀嚼力下降。 一定程度的力學刺激有助于維持骨穩(wěn)態(tài)，多項研究表明，在下頜骨發(fā)育期間，咀嚼刺激不足會出現下頜骨體積減小、骨量降低及髁突軟骨變薄等現象[1-2]。有報道顯示，兒童頜骨發(fā)育不足及牙列發(fā)育異常也與食物刺激有關[3]。然而，關于牙槽骨如何響應咀嚼力學變化，從而影響頜骨骨密度和骨改建的相關機制并不明確。

現有研究顯示，Hedgehog 通路在發(fā)育過程中通過調節(jié)成骨及破骨過程， 發(fā)揮重要的骨調節(jié)作用[4-5]。在小鼠體內， 成熟成骨細胞中Hedgehog 信號增強會通過甲狀旁腺激素相關蛋白 （parathyroid hormone-related protein， PTHrP） 及核因子κ B 受體活化因子配體 （receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）驅動破骨細胞的產生[6]。多項研究證實， 機械力下的成骨及破骨活動可通過Hedgehog信號通路介導[7-8]。 通過牙槽骨咀嚼力缺乏模型，探究弱咀嚼力環(huán)境下Hedgehog 通路在頜骨發(fā)育中的變化， 為進一步研究牙槽骨量維持的關鍵因素及Hedgehog 在其中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立

將48 只3 周齡C57BL/6J 雄性小鼠隨機分為2 組，即正常飲食組（HD，對照組）及軟食組（SD，實驗組）。 正常飲食組喂養(yǎng)常規(guī)顆粒動物飼料，軟食組以相同成分粉末狀飼料喂養(yǎng)， 于1 周和3 周后經3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉后取小鼠下頜骨。 所有小鼠均為SPF 級，購于上海南方模式生物研究中心， 實驗經同濟大學倫理委員會批準（TJLAC-017-027）。

1.2 儀器與設備

組織處理脫水儀、 石蠟切片機（Thermo Fisher Microm 公司，美國）；HE 染色試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，中國）；TRAP 染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；山羊血清（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，中國）；DMP1-C-8G10.3 抗體（貝勒牙學院秦春林教授贈予， 美國）；CTSK 抗體 （Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；熒光二抗IgG（Invitrogen 公司，美國）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Sigma 公司，美國）；抗淬滅劑（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；Goldner 三色染色液（上海雷根生物科技有限公司，中國）；直立熒光顯微鏡和圖像分析系統 （Nikon 公司， 日本）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司， 瑞士）；TRIzol （Ambion 公司， 美國）；PCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司， 中國）；Light Cycler 96 實時熒光定量PCR 儀（Roche 公司，瑞士）。

1.3 實驗方法

1.3.1 Micro-CT 數據分析 小鼠下頜骨經4%多聚甲醛固定48 h 后，運用micro-CT 機（型號：micro-CT50；Scanco Medical 公司，瑞士）進行掃描。 選取下頜第一磨牙（first molar， M1）根分叉下方牙槽骨作為感興趣區(qū)域（region of interest， ROI），上緣起自根分叉頂點，下緣止于根尖連線處。 選取分析參數：骨體積分數（bone volume/total volume， BV/TV）、骨小梁數目（trabecular number， Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness， Tb.Th）、 骨小梁分離度（trabecular seperation， Tb.Sp）。

1.3.2 形態(tài)學染色 固定后的下頜骨經10%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣3～4 周后，用組織處理儀梯度脫水，石蠟包埋，行4 μm 厚度切片。選取合適切片，經二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化， 常規(guī)行HE 染色、Goldner 三色染色及TRAP 染色，甲基綠復染，烘干后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 免疫熒光染色 選取合適的切片，經二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化， 于37 ℃溫箱中用透明質酸酶修復，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后，37 ℃恒溫箱中血清封閉，其后孵育一抗DMP1（1∶200）、CTSK 抗體（1∶150）過夜。 洗掉一抗，依據種屬選擇相應二抗，室溫孵育，PBS 沖洗，孵育DAPI，用PBS 沖洗后滴加熒光防淬滅封片劑，封片，鏡下觀察。

1.3.4 RNA 提取及RT-qPCR 分析 提取軟食組及正常飲食組小鼠下頜骨，剔去多余軟組織，剪除前后方及磨牙下方硬組織， 僅留下頜磨牙區(qū)牙槽骨。 利用TRIzol 法提取總RNA，經逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA 后， 應用RT-qPCR 分析初級纖毛及Hedgehog 相關基因， 如IFT88、SMO、PTCH1、GLI1等表達情況。 引物序列如表1 所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計學分析

使用SPSS 20.0 與GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 軟食組小鼠磨牙根分叉區(qū)牙槽骨骨量顯著降低

2 組小鼠分別飼養(yǎng)1 周、3 周， 固定取材后，micro-CT 結果（圖1）顯示，軟食組小鼠相較于正常飲食組， 其下頜骨不同區(qū)域骨量具有不同程度降低，尤其以髁突和牙槽骨較為明顯。 在牙槽骨中，以第一磨牙（M1）根分叉下方牙槽骨喪失最為嚴重。軟食組主要表現為近根方1/2 的腔隙顯著擴大， 近冠方1/2 牙槽骨骨密度明顯降低。 根分叉區(qū)牙槽骨的定量分析結果表明，軟食喂養(yǎng)1 周時，即4 周齡小鼠BV/TV 降低約25%，Tb.N 和Tb.Th 不同程度降低，Tb.Sp 上升，骨量出現顯著降低。 軟食喂養(yǎng)3 周時，即6 周齡小鼠較4 周齡軟食組小鼠骨丟失進一步加重，但定量分析顯示骨丟失速度減緩，說明軟食組小鼠骨穩(wěn)態(tài)異常。

圖1 Micro-CT 掃描和定量分析結果Figure 1 Micro-CT scans and quantitative analysis results

2.2 根分叉下方牙槽骨根方1/2 處骨喪失較為明顯

HE 染色結果（圖2）可見，軟食喂養(yǎng)1 周后，軟食組小鼠第一磨牙下方牙槽骨出現明顯的骨吸收。原有的位于根方的牙槽骨生理性腔隙進一步增大，且出現一些散在的不連續(xù)空腔，冠方牙槽骨尚無顯著變化。 軟食喂養(yǎng)3 周后，軟食組小鼠根分叉區(qū)域牙槽骨吸收加重，根方散在腔隙逐漸連接，且范圍進一步向冠側蔓延，同時冠方也開始出現了一些骨吸收形成的散在空腔。

圖2 小鼠下頜第一磨牙HE 染色結果Figure 2 HE staining results of mouse mandibular M1

2.3 根分叉下方牙槽骨冠方1/2 處礦化程度降低

牙本質基質蛋白（dentin matrix protein 1，DMP1）是主要由骨細胞表達的一種基質蛋白，在骨發(fā)育及礦化中發(fā)揮重要作用。 免疫熒光染色結果發(fā)現，軟食組小鼠較正常飲食組根分叉區(qū)DMP1 陽性細胞信號區(qū)域顯著減少，意味著軟食組小鼠牙槽骨礦化能力減弱。 與根方相比，冠方1/2 區(qū)域差異更明顯。Goldner 三色染色分別以綠色和紅色來顯示成熟的礦化骨與不成熟類骨質。如圖3 所示，4 周齡軟食組小鼠正處于生長發(fā)育階段，M1 磨牙區(qū)牙槽骨冠方紅染非礦化骨較多。6 周齡小鼠已近成年，此時非礦化骨在2 組間無顯著差異。

圖3 第一磨牙牙槽骨DMP1 及Goldner 三色染色結果Figure 3 DMP1 and Goldner trichrome staining results of alveolar bone of M1

2.4 軟食組小鼠磨牙根分叉區(qū)牙槽骨破骨活性增強

由于軟食組小鼠主要表現為從牙槽骨量丟失為主的骨改建，所以檢測了其破骨活性。TRAP 染色結果顯示，軟食喂養(yǎng)1 周后，TRAP 陽性細胞數量上升，TRAP 陽性區(qū)域面積減少，且主要集中在根方牙槽骨處。 軟食組3 周即小鼠6 周齡時，發(fā)育基本成熟，此時軟食組TRAP 染色略強于對照組，但2 組均顯著低于4 周齡時。 CTSK 的染色結果基本與TRAP 染色一致。 詳見圖4。

圖4 M1 牙槽骨TRAP 及CTSK 染色結果Figure 4 TRAP and CTSK staining results of alveolar bone of M1

2.5 軟食組小鼠Hedgehog 及初級纖毛相關基因表達上升

提取下頜骨磨牙區(qū)牙槽骨RNA，分析咀嚼力缺乏下Hedgehog 相關基因的表達變化。 RT-qPCR 結果表明，軟食組小鼠Hedgehog 通路下游分子SMO、PTCH1、GLI1 的mRNA 表達水平均呈現不同程度上調。 在軟食喂養(yǎng)早期，小鼠4 周齡時，相關mRNA水平呈現明顯的上調。 隨喂養(yǎng)時間增加，因咀嚼力缺乏而導致的相關mRNA 表達水平上調減緩。與初級纖毛相關的IFT88 的mRNA 水平在軟食喂養(yǎng)1 周及3 周后均呈現顯著上調。 這些結果表明Hedgehog及初級纖毛參與咀嚼力缺乏時骨改建的調節(jié)過程。詳見圖5。

圖5 Hedgehog 通路及初級纖毛相關基因表達情況Figure 5 The expression of Hedgehog pathway and primary cilia related genes

3 討論

在下頜骨生長發(fā)育期間，長期進食軟食會引起咀嚼力不足，造成下頜骨骨量降低。 本研究中，小鼠進食軟食1 周即4 周齡時，磨牙區(qū)牙槽骨即出現了骨量顯著降低、礦化能力減弱、出現未成熟骨、破骨活性明顯增強、Hedgehog 信號通路顯著上調的變化，這些可能與此時下頜骨處于發(fā)育階段，骨改建較為活躍相關。 而進食3 周軟食即小鼠6 周齡時，頜骨發(fā)育基本完成，下頜骨基本處于一個較為穩(wěn)定的階段，此時骨丟失速度降低，骨量較4 周齡時僅輕度下降， 不成熟骨消失， 破骨細胞活性及Hedgehog信號通路相關基因表達略有上漲。 這些結果表明牙槽骨發(fā)育早期階段機械刺激的重要作用。

此前已有多項研究探討了機械應力在頜骨發(fā)育及乳恒牙列替換萌出中的作用機制。Wu 等[9]利用小型豬模型證明了頜骨內源性應力通過integrinβ1-Runx2-Wnt 通路調控牙列替換。 Men 等[10]探討GLI1+細胞作為一種牙周膜干細胞響應咬合力維持骨穩(wěn)態(tài)。 此外，一些臨床研究揭示錯頜畸形導致的咀嚼刺激不足， 使髁突及下頜骨密度降低及不對稱發(fā)育[11]。 而咀嚼刺激不足又進一步影響牙齒形態(tài)及咀嚼肌、舌肌等功能，繼而影響頜骨發(fā)育[12]。

Hedgehog 信號通路在骨發(fā)育和維持體內骨穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。 多項研究表明，Hedgehog 信號主要是Sonic hedgehog（SHH）及Indian hedgehog（IHH）通過多種途徑參與骨代謝調節(jié)的[13-14]。隨著年齡增加，Hedgehog 信號逐漸減弱。研究發(fā)現，當成骨細胞中HH 信號增強時，其可通過調節(jié)PTHrP 介導的RANKL 與OPG 的表達來誘導破骨細胞的生成與骨吸收[4]。 另一項研究也證實，經SHH 處理的小鼠的骨髓基質細胞在體外顯示出增強的破骨細胞潛力，導致骨改建及骨強度降低[6]。 Shimo 等[15]也發(fā)現， 源于口腔腫瘤的SHH 可以刺激腫瘤微環(huán)境下頜骨中破骨細胞的生成及骨吸收。 Kohara 等[16]的實驗證實，抑制Hedgehog 可以抑制破骨細胞生成，同時增加骨量。 針對Hedgehog 通路的調節(jié)是應對骨吸收的一個重要措施。

Hedgehog 通路的下游分子SMO、PTCH1、GLI1等均在破骨調節(jié)過程中發(fā)揮作用。 小鼠破骨細胞中SMO 的特異性缺失可減輕衰老小鼠骨小梁骨量降低[16]。PTCH1 表達水平升高會抑制SMO 與HH 的轉導，導致骨量降低[17]。 GLI1 陽性細胞作為一種力學響應細胞參與牙槽骨改建過程[18]。 在經典Hedgehog信號轉導中，PTCH1 通過抑制SMO 發(fā)揮負向調節(jié)作用，而SMO、GLI1 等則發(fā)揮正向調節(jié)作用。 基于本研究中PTCH1 與SMO 的同步上調，提出以下猜想： ①PTCH1 通過影響SMO 的亞細胞定位影響Hedgehog 信號轉導，但關于PTCH1 調控SMO 的相關機制仍不清楚[19]，目前相關研究指出，二者之間可能存在第二信使如膽固醇等參與了這一過程；②PTCH1 的核心功能是調節(jié)SMO 進入初級纖毛膜， 部分研究表明，SHH 可獨立于PTCH1/2 激活SMO[20]；③RT-qPCR 僅能反映mRNA 水平，與轉錄翻譯后的蛋白水平可能存在差異。 此外， IFT88 是Hedgehog 下游的重要信號轉運蛋白。 Kitamura 等[21]發(fā)現IFT88 突變的小鼠下頜骨縮短，且Hedgehog 信號下調，證實IFT88 通過調節(jié)SHH 參與下頜骨發(fā)育過程。

本研究中，咀嚼刺激不足導致了下頜牙槽骨骨量降低， 伴隨著Hedgehog 下游相關分子SMO、PTCH1、GLI1、IFT88 的表達上升， 這些結果將為后續(xù)研究力學及Hedgehog 通路在骨量維持中的作用提供理論基礎。 此外，探究頜骨響應力學機制可以為飲食習慣提供指導，初級纖毛可為研究這一過程提供了一個新的視角，但其如何響應機械刺激參與破骨活動仍需進一步研究。