王麗學(xué)，韓 靜，陳龍賓，余新越，劉景喜，馬 毅，霍文娟

（1天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院信息研究所，天津 300192；2天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；3天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；4天津師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，天津 300387；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300381）

0 引言

苜蓿(Medicago sativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，其蛋白含量高，被譽(yù)為“牧草之王”[1]，但其水溶性碳水化合物含量低、緩沖能值高且自身附著乳酸菌少，導(dǎo)致苜蓿青貯過(guò)程中pH降低困難，易發(fā)生有害菌發(fā)酵，故優(yōu)質(zhì)苜蓿青貯需要外源添加劑[2]。青貯過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜微生物菌群（如乳酸菌、酵母菌、霉菌等）的活動(dòng)過(guò)程[3]，菌群特征直接影響牧草青貯品質(zhì)[4]，甚至進(jìn)一步影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物群系[5-6]。

研究表明，青貯微生物群落因青貯物料自身特征[7-8]、外源添加物質(zhì)[9-10]或添加劑[11-12]、青貯方式[13]及青貯物料生長(zhǎng)的土壤環(huán)境[14]等多種因素的影響而存在差異。青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究不但可以解釋青貯品質(zhì)的變化，同時(shí)還有助于菌株篩選進(jìn)而用于青貯添加劑開(kāi)發(fā)，尤其對(duì)于苜蓿類(lèi)較難青貯的牧草而言意義重大。目前，有關(guān)苜蓿青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究，多集中于乳酸菌劑[15-16]、纖維素酶[6,15]、糖[12]等發(fā)酵促進(jìn)劑的影響，及與其他牧草混合青貯的效應(yīng)[10]等方面，而有關(guān)抑制型青貯添加劑對(duì)苜蓿青貯細(xì)菌群落組成的影響報(bào)道較少。

抑制型青貯添加劑如甲酸、乙酸等可通過(guò)抑制不良微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)青貯物料的有效保存[17-18]，其中甲酸可在短時(shí)間內(nèi)降低苜蓿青貯pH，提高青貯品質(zhì)[19]。木醋液是植物性原料炭化或干餾過(guò)程中產(chǎn)生的氣體混合物經(jīng)冷凝、回收、分離后獲得的有機(jī)產(chǎn)品，屬于植物酸類(lèi)混合物，安全、無(wú)污染、無(wú)殘留，可用作飼料添加劑、有機(jī)肥發(fā)酵劑等[20]，課題組前期研究表明木醋液作為青貯添加劑可提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，其乳酸含量顯著高于對(duì)照和甲酸處理[21]。本研究以甲酸和木醋液作為青貯添加劑制作苜蓿青貯，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了細(xì)菌群落組成，并結(jié)合苜蓿青貯主要營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)探討二者的作用機(jī)理，旨在為其在苜蓿青貯中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用苜蓿為丹農(nóng)種子公司提供的北極熊品種，種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所的“濱海鹽堿地綠化土壤改良科研試驗(yàn)基地”。試驗(yàn)用精制木醋液(pH 2.7)和甲酸（分析純）均為市售。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年10月開(kāi)展，設(shè)2個(gè)添加劑處理，分別為木醋液（B組）和甲酸（C組），以等量蒸餾水替代添加劑處理為對(duì)照（A組）。苜蓿刈割后晾曬24 h，其干物質(zhì)含量為(23.02±0.70)%，切割至2～5 cm小段，分別按6 mL/kg的劑量將添加物均勻噴灑在切割好的苜蓿上混勻，裝入特制聚乙烯塑料袋(25 cm×35 cm)，每袋300 g，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，用真空封口機(jī)進(jìn)行抽真空后封口。室溫條件發(fā)酵45 d后，在每個(gè)樣品的非表層部分用經(jīng)高溫滅菌的鑷子按照五點(diǎn)采樣法采集苜蓿青貯樣品20 g左右，先液氮速凍，再存于-80℃冰箱中，用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)測(cè)定與分析。

1.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)測(cè)定與分析

苜蓿青貯樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)測(cè)定由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用Illumina MiSeq平臺(tái)，選用長(zhǎng)度約為280 bp的細(xì)菌16S rRNA基因高度可變的V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，其PCR擴(kuò)增引物為338F(5'-3')ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R(5'-3')GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Q5高保真DNA聚合酶0.25 μL，5×反應(yīng)緩沖液5 μL，5×高GC緩沖液5 μL，10 mMdNTP0.5 μL，模板 DNA 1 μL，10 μM 正、反向引物各 1 μL，ddH2O 11.25 μL。PCR程序：98℃30 s；98℃15 s，50℃30 s，25～27個(gè)循環(huán)；72℃ 30 s，72℃ 5 min，于4℃保存。擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳切取目的片段并用Axygen凝膠回收試劑盒回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR產(chǎn)物在Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)上進(jìn)行定量，然后按照每個(gè)樣品所需數(shù)據(jù)量進(jìn)行混樣。利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫(kù)。在Agilent Bioanalyzer機(jī)器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對(duì)文庫(kù)做2100質(zhì)檢，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)在MiSeq機(jī)器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

運(yùn)用R軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先對(duì)所獲序列預(yù)處理，評(píng)估有效序列質(zhì)量，獲得可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列；然后對(duì)高質(zhì)量序列按照97%的序列相似度劃分可操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)；再將豐度值高于0.001%的OTU代表序列與細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列進(jìn)行比對(duì)，即可獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息。采用IBM SPSS Statistics 20.0對(duì)苜蓿青貯細(xì)菌分類(lèi)學(xué)信息進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，并運(yùn)用Duncan法進(jìn)行多重比較，通過(guò)SigmaPlot12.0軟件作圖，文中數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.3.1 細(xì)菌群落組成 對(duì)不同處理在門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的OTU序列和菌群數(shù)量信息進(jìn)行單因素方差分析，著重分析不同處理在門(mén)、屬水平的細(xì)菌群落組成差異，并根據(jù)組間差異獲得如耐酸乳酸菌等重要物種信息。

1.3.2 細(xì)菌群落多樣性 選擇Chao1、ACE、Shannon和Simpson 4個(gè)指數(shù)進(jìn)行分析。Chao1豐富度指數(shù)通過(guò)計(jì)算群落中只檢測(cè)到1次和2次的OTU數(shù)（即“Singleton”和“Doubleton”），估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)；ACE豐富度指數(shù)默認(rèn)將序列量10以下的OTU都計(jì)算在內(nèi)，估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)；Shannon和Simpson多樣性指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，前者對(duì)豐富度和稀有OTU更敏感，而后者對(duì)均勻度和優(yōu)勢(shì)OTU更敏感。

1.3.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性與營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系 通過(guò)PCA分析苜蓿青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指標(biāo)與其營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)一步探討甲酸和木醋液對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)影響的作用機(jī)理。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿青貯細(xì)菌群落組成分析

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，9個(gè)苜蓿青貯樣品獲得有效序列41461～55384個(gè)（合計(jì)429886個(gè)），其中高質(zhì)量序列39105～48470個(gè)（合計(jì)395074個(gè)），占有效序列的87.52%～96.43%（平均91.90%），物種累計(jì)曲線(xiàn)最終趨于平緩，說(shuō)明樣本量足以反映群落的豐富度，且所有的OTU均可歸屬至已知分類(lèi)單元（門(mén)、綱、目、科、屬）。根據(jù)OTU及細(xì)菌類(lèi)群分類(lèi)地位鑒定結(jié)果（圖1），門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的OTU數(shù)量及細(xì)菌類(lèi)群數(shù)均表現(xiàn)為A組＜B組＜C組，其中在綱、目水平A組與C組差異顯著，而在科、屬、種水平A、B組與C組差異均顯著。

圖1 苜蓿青貯樣品細(xì)菌序列(OTU)劃分及細(xì)菌類(lèi)群分類(lèi)地位統(tǒng)計(jì)

2.1.1 門(mén)水平細(xì)菌組間差異 由苜蓿青貯在門(mén)水平的組間差異（表1）可知，厚壁菌門(mén)(Firmicates)豐度表現(xiàn)為B組＞A組＞C組，組間差異均顯著；變形菌門(mén)(Proteobacteria)豐度表現(xiàn)為A組>B組>C組，組間差異均顯著；藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)豐度均表現(xiàn)為C組顯著高于A、B組；放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)和浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)豐度較低，均以C組最高。由此可見(jiàn)，對(duì)照組以變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，豐度為57.726%，然后是厚壁菌門(mén)(40.345%)；木醋液組則以厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，豐度為55.687%，然后是變形菌門(mén)(37.050%)；而甲酸組以藍(lán)細(xì)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，豐度為61.775%，然后依次是變形菌門(mén)(21.771%)和厚壁菌門(mén)(12.996%)。

表1 苜蓿青貯細(xì)菌群落門(mén)水平豐度的組間差異 %

2.1.2 屬水平細(xì)菌組間差異 對(duì)苜蓿青貯豐度大于1%的屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表2）可知，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)分別有9，8，1，1個(gè)屬的豐度大于1%。厚壁菌門(mén)中，腸球菌屬(Enterococcus)豐度最高，表現(xiàn)為B組>A組>C組，組間差異均顯著；芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)均表現(xiàn)為C組>B組>A組，其中芽孢桿菌屬C組與A、B組差異顯著，而乳球菌屬B、C組與A組差異顯著；乳桿菌目(Lactobacillales)未知科屬、乳桿菌科(Lactobacillaceae)未知屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)未知屬及明串珠菌屬(Leuconostoc)的豐度組間差異均不顯著。變形菌門(mén)中，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)未知屬豐度最高，表現(xiàn)為A組＞B組＞C組，組間差異均顯著；羽扇豆屬(Lupinus)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)的豐度均表現(xiàn)為A組＜B組＜C組，A、B組與C組差異顯著；特拉布斯氏菌屬(Trabulsiella)豐度表現(xiàn)為A組＞B組＞C組，其中A、C組間差異顯著；甲基桿菌屬(Methylobacterium)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)未知屬的豐度組間差異均不顯著。藍(lán)細(xì)菌門(mén)的鏈型植物目(Streptophyta)未知科屬及放線(xiàn)菌門(mén)微桿菌科(Microbacteriaceae)未知屬的豐度均表現(xiàn)為C組>B組>A組，C組與A、B組差異顯著。由此可見(jiàn)，對(duì)照組苜蓿青貯的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)腸桿菌科未知屬，其豐度為48.302%，然后是厚壁菌門(mén)腸球菌屬(35.041%)；木醋液組的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)腸球菌屬，其豐度為45.026%，然后是變形菌門(mén)腸桿菌科未知屬(30.798%)；甲酸組的優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)細(xì)菌門(mén)鏈型植物目未知科屬，其豐度為61.747%，其他類(lèi)群的豐度均低于10%。

表2 苜蓿青貯細(xì)菌群落門(mén)水平豐度的組間差異 %

2.2 苜蓿青貯細(xì)菌群落多樣性分析

苜蓿青貯的細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果（圖2）表明，Chao1、ACE指數(shù)顯示出與OTU及菌群數(shù)量相似的趨勢(shì)，均表現(xiàn)為A組C組>A組，組間差異不顯著；Simpson指數(shù)表現(xiàn)為B組＞A組＞C組，組間差異均不顯著。

圖2 紫花苜蓿青貯樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 苜蓿青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系

以苜蓿青貯中出現(xiàn)的豐度較高菌門(mén)和多樣性指數(shù)及苜蓿青貯主要營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)[21]進(jìn)行PCA分析，前3個(gè)主成分累計(jì)可解釋苜蓿青貯樣品88.786%的信息，以PC1和PC2作圖（圖3）。由圖3可以看出，苜蓿青貯相關(guān)指標(biāo)大致可以分為4組，I組為營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)NFC含量與細(xì)菌群落藍(lán)細(xì)菌門(mén)豐度及Chao1和ACE指數(shù)，與PC1負(fù)相關(guān)；II組為營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)NDF、ADF和發(fā)酵指標(biāo)pH、乳酸、乙酸、氨態(tài)氮含量及細(xì)菌群落厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)豐度，與PC1正相關(guān)；III組為細(xì)菌群落Shannon和Simpson指數(shù)，與PC2正相關(guān)；IV組為營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)粗蛋白含量，與PC2負(fù)相關(guān)。從樣品整體分布上看，受PC1影響，C組位于2、3象限，而A、B組位于1、4象限；受PC2影響，B組更偏向于第1象限，而A組更偏向于第4象限、C組更偏向于第3象限。

圖3 苜蓿青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的主成分分析圖

3 結(jié)論

與對(duì)照相比，木醋液提高了優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門(mén)(Firmicutes)腸球菌屬(Enterococcus)乳酸菌的豐度同時(shí)降低變形菌門(mén)(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)豐度，有助于促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵；甲酸則顯著降低了優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門(mén)(Firmicutes)腸球菌屬(Enterococcus)乳酸菌和變形菌門(mén)(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的豐度，即菌群繁殖被普遍抑制。這種細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化可較好地解釋木醋液和甲酸對(duì)苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的影響。

4 討論

青貯飼料中參與乳酸發(fā)酵的細(xì)菌群落大多數(shù)屬于厚壁菌門(mén)[16]，其與變形菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)共同構(gòu)成了鮮苜蓿的主要附生細(xì)菌群落，但因氣候、地理位置等因素導(dǎo)致其豐度存在差異[8,15]，自然發(fā)酵過(guò)程中，厚壁菌門(mén)逐漸占優(yōu)勢(shì)[3,16]。本研究中對(duì)照組自然發(fā)酵后以變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，而木醋液組則以厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明木醋液的添加有助于促進(jìn)苜蓿良性發(fā)酵；甲酸組以藍(lán)細(xì)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)，應(yīng)該是苜蓿青貯發(fā)酵進(jìn)程受到抑制，有研究表明甲酸處理下苜蓿青貯在5天內(nèi)快速下降至最低而乳酸發(fā)酵在0.5天后減緩[22]，故推測(cè)藍(lán)細(xì)菌門(mén)（經(jīng)后續(xù)鑒定主要由鏈型植物目(Streptophyta)未知科屬組成的均一性群落）為苜蓿青貯樣品菌群提取過(guò)程中的植物組織部分，具體尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

乳酸菌是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物[23]，分屬于細(xì)菌界5個(gè)門(mén)的43個(gè)屬[24]，本研究中豐度＞1%的厚壁菌門(mén)中的9個(gè)屬均為乳酸菌。在未添加外源菌劑的情況下，青貯發(fā)酵后的細(xì)菌群落組成主要受附生菌群組成及特性影響[8,12]，Ni等[25]研究報(bào)道腸球菌科、動(dòng)球菌科(Planococcaceae)和腸桿菌科是鮮苜蓿的主要附生菌群，青貯后腸球菌科豐度增加至近50%而腸桿菌科保持在16%左右。本研究中對(duì)照組和木醋液組的腸球菌屬和腸桿菌科未知屬的豐度均較高，這與Ni等[25]的結(jié)果類(lèi)似，故推斷二者應(yīng)該是本研究所用苜蓿的主要附生菌群。腸球菌屬乳酸菌是近年應(yīng)用較多的微生物菌種之一[26]，腸桿菌可通過(guò)脫氨反應(yīng)生成氨，減緩pH的降低[11]，同時(shí)可與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)可利用的水溶性碳水化合物[7]，故良性發(fā)酵一般表現(xiàn)為乳酸菌豐度增加而腸桿菌豐度降低[10]。本研究中，與對(duì)照組相比，木醋液的添加顯著降低了腸桿菌科的豐度，說(shuō)明其為酸性抑制劑表現(xiàn)出了對(duì)有害菌群的抑制作用，但同時(shí)也顯著提高了乳酸菌尤其是腸球菌屬和乳球菌屬的豐度，即說(shuō)明木醋液對(duì)乳酸菌發(fā)酵沒(méi)有抑制作用反而表現(xiàn)為促進(jìn)，這與Ogunade等[16]報(bào)道丙酸處理并沒(méi)有影響優(yōu)勢(shì)乳酸菌屬豐度的結(jié)果類(lèi)似，可能是因?yàn)槟敬滓旱奶砑訛檐俎Ｇ噘A中的乳酸菌提供了更適宜的發(fā)酵環(huán)境。但甲酸處理顯著抑制了大多數(shù)細(xì)菌包括有害菌和乳酸菌的發(fā)酵，作為其優(yōu)勢(shì)菌群的藍(lán)細(xì)菌門(mén)鏈型植物目未知科屬經(jīng)推測(cè)應(yīng)該為苜蓿青貯菌群提取過(guò)程中的植物組織部分，甲酸組中也有芽孢桿菌屬、乳球菌屬、鞘脂單胞菌屬、羽扇豆屬（推測(cè)應(yīng)該是植物組織部分）和微桿菌科未知屬的豐度較對(duì)照組顯著提高，說(shuō)明這些菌屬應(yīng)該屬于耐酸性較強(qiáng)的菌群，后續(xù)可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和篩選，用于苜蓿青貯添加菌劑的開(kāi)發(fā)。

主成分分析結(jié)果表明，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度越高，藍(lán)細(xì)菌門(mén)豐度越低，苜蓿青貯中的乳酸、乙酸、氨態(tài)氮、NDF和ADF含量及pH越高，而NFC含量越低，這與Zheng等[12]報(bào)道的水溶性碳水化合物（屬于NFC）含量低的青貯材料乙酸產(chǎn)量高且pH降低緩慢，及Ogunade等[16]報(bào)道的乳酸濃度與乳酸菌（本文中厚壁菌門(mén)中＞1%的菌屬均為乳酸菌）的豐度正相關(guān)類(lèi)似。其中，甲酸組NFC含量較高、乳酸和乙酸含量較低且氨態(tài)氮含量為0[21]，這進(jìn)一步說(shuō)明了甲酸抑制了苜蓿青貯發(fā)酵進(jìn)程，減少了青貯底物的消耗，同時(shí)也降低了發(fā)酵產(chǎn)物，也進(jìn)一步印證了藍(lán)細(xì)菌門(mén)鏈型植物目未知科屬屬于苜蓿植物組織部分的推斷。在厭氧環(huán)境中，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)細(xì)菌能夠有效降解纖維類(lèi)物質(zhì)，為微生物活動(dòng)提供更多能量物質(zhì)[27]，故本研究中苜蓿青貯NDF和ADF含量均表現(xiàn)為木醋液組略低于對(duì)照組，在甲酸組變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)雖然豐度低但其N(xiāo)DF和ADF含量卻顯著低于對(duì)照組和木醋液組，這應(yīng)該是由于甲酸對(duì)苜蓿酸化降解纖維類(lèi)物質(zhì)的影響[3]效果大于微生物群系作用的緣故；厚壁菌門(mén)多為乳酸菌，產(chǎn)乳酸有助于降低青貯pH，而變形菌門(mén)尤其是腸桿菌可通過(guò)脫氨反應(yīng)生成氨，減緩青貯pH的降低[11]，王雅雅等[28]報(bào)道變形菌門(mén)與pH正相關(guān)，本研究結(jié)果與之相同。